UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y FORESTALES.

BIOTECNOLOGA.



INFORME LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR I,
EXTRACCIN DE ADN GENMICO

ORLANDO BARRA
EDUARDO PACHECO
ANDREA SOBARZO

PROFESORES:
GRACIELA BERRIOS


TEMUCO CHILE
2014
INTRODUCCIN
Hoy en da la ciencia nos ha permitido, pasear por los ms
remotos horizontes de la biologa, conociendo incluso la
informacin biolgica que se requiere para generar a un individuo
completo, a esta informacin la conocemos con el nombre de ADN,
logrando encontrar en un mismo individuo distintas variedades de
esta biomolcula, tales como; ADN genmico, Mitocondrial,
Ribosomal e incluso en el caso de las bacterias Plasmidial, este
ltimo hace refencia a molculas de ADN extracromosmico, ya sea
circular o lineal que se replican y transcriben independientes del
ADN cromosmico, su tamao vara desde 1 a 250 kb y en general
este tipo de ADN no contiene informacin esencial, sino que mas
bien le confieren ventajas al hospedador en condiciones de
crecimiento determinadas. El ejemplo ms comn, es el de los
plsmidos que contienen genes de resistencia a un determinado
antibitico, de manera que el plsmido nicamente supondr una
ventaja en presencia de ese antibitico. Se ha logrado identificar
algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad
de insertarse en el cromosoma bacteriano, rompiendo
momentneamente el cromosoma y situndose en su interior, con lo
que, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el
plsmido. Gracias a la caracterstica de replicacin autnoma y
las que guardan relacin con ciertas ventajas para el hospedador,
han sido muy utilizados en biologa molecular, especficamente en
ingeniera gentica donde son utilizados como vectores de
clonacin, gracias a su fcil manipulacin para insertar nuevas
secuencias gnicas, tambin son utilizadas para producir grandes
cantidades de protenas (insulina), y hoy en da son de gran
inters en el mercado de la agrobiotecnologa como resultado de
las fuertes crticas de los grupos ecologistas hacia la presencia
de antibiticos en los OGM. Sin lugar a dudas la utilizacin de
ADN plasmidial en biologa molecular inici un cambio de paradigma
en la biotecnologa, logrando un alto auge como herramienta de
mejoramiento gentico y productivo de diferentes industrias
biolgicas, pero necesariamente antes de aplicar estas supuestas
virtudes y atributos de inters biotecnolgico, es necesario
reconocer la caracterstica y extraer el ADN plasmidial de dicha
bacteria para luego ser estudiado rigurosamente en el laboratorio.

OBJETIVOS GENERALES

-Conocer y analizar el procedimiento de extraccin de ADN
plasmidial.

-Familiarizar al estudiante con metodologas y normas de trabajo,
en un laboratorio de Biologa Molecular aplicando siempre el
conocimiento obtenido previo gracias a la lectura de la gua de
trabajo otorgadas por el profesor.

OBJETIVOS ESPECFICOS

-Conocer la razn por la cual utilizamos cada reactivo presente en
el protocolo.

-Lograr aplicar correctamente la cuantificacin de ADN y poder dar
una explicacin concreta de los resultados.

EXTRACCIN DE ADN PLASMIDIAL

Los plsmidos son pequeas molculas de DNA extra-cromosmico
circular o lineal que aparecen en el citoplasma de las bacterias y
que determinan rasgos que no son vitales para La clula, pero que
de alguna manera contribuyen la capacidad del organismo para
adaptarse. Estructuralmente Este ADN no difiere Del cromosmico,
pero sin embargo es ms resistente a agentes qumicos, esta mayor
resistencia es la base para La creacin de protocolos para la
separacin y extraccin de DNA plasmidial y destruccin de los
otros cidos nucledos contaminantes.
La lisis alcalina, en combinacin con un detergente como el SDS
(dodecilsulfato sdico) ha sido usado por ms de 20 aos para
aislar el DNA plasmidial de E. coli (Birnboin y Doly 1979). La
exposicin de una suspensin bacteriana a un fuerte detergente
aninico con pH elevado, lisan la pared celular bacteriana,
desnaturalizando el DNA cromosmico y protenas y relajando el DNA
plasmidial.

MATERIALES Y MTODOS

En este prctico se utilizaron cepas bacterianas, provenientes de
Escherischia coli, las cuales fueron incubadas el da anterior
inoculando un tubo falcon con un mondadiente que contiena la
bacteria, medio LB; el cual es un medio lquido que se utiliza
para mantener en condiciones adecuadas de cultivo a E.coli,
contiene 10g de NaCl, 5g de Extracto de levadura y 10g de
triptona, adems la suspensin tambin estaba provista de y
ampicilina. Los cultivos se mantuvieron en agitacin por una noche
a 37C.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE DNA PLASMIDIAL

1. Centrifugar los cultivos a 12.000 rpm por 3 min

2. Remover el sobrenadante; para reducir contaminacin por
fragmentos de la pared celular del husped

3. Resuspender el pellet en 100 L de solucion Alcalina I fria,
mezclar vigorosamente con vortex.: Solucin amortiguadora que
proporciona un estado estable para el ADN. mantiene la osmolaridad
para prevenir la prematura lisis celular y previene la degradacin
del DNA por la captura de iones.





4. Adicionar 200 L de solucin de lisis II (fresca), cerrar el
tubo y mezclar invirtiendo cinco veces, No usar vortex. Poner el
tubo en hielo. Utilizado para promover la Lisis celular,
condiciona la desnaturalizacin del DNA cromosmico, denaturacin
de protenas y liberacin de plsmidos.

5. Adicionar 150 L de solucin alcalina III fra, cerrar el tubo y
mezclar invirtiendo cinco veces. Poner el tubo en hielo 3-5
minutos (NO CONGELAR); cumple la funcin de Unir las hebras de DNA
y la remocin de contaminantes, precipitando protenas denaturadas
y la mayora de los polisacridos.

6. Centrifugar a mxima velocidad por 5 minutos a 4C y transferir
el sobrenadante a un nuevo tubo.

7. Adicionar un volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en
vortex y centrifugar a mxima velocidad por 2 minutos a 4C; El
cloroformo es utilizado para favorecer la denaturalizacin de las
protenas y deshidratacin del ADN.

8. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.

9. Precipitar el ADN plasmidial adicionando 2 volmenes de etanol
absoluto, incubar a -20oC por 20 minutos; La adicin del etanol
absoluto se sustenta en las cualidades moleculares del DNA,
buscando precipitar los cidos nuleicos sacando provecho de su
polaridad.

10. Centrifugar a mxima velocidad por 5 minutos a 4C

11. Remover el sobrenadante, adicionar 1 ml de etanol al 70% y
Centrifugar a mxima velocidad por 2 minutos a 4C; utilizado para
el enjuague y Remocin de impurezas como restos de compuestos
fenlicos y sales.

12. Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una
superficie limpia para permitir que la pellet quede lo ms seco
posible.

13. Secar el pellet a T.A., resuspender en 50 ul de ADESI y
Guardar a -20C; Resuspender y rehidratar el ADN. El ser
desionizada permite que los iones no interfieran en otras
reacciones.
ESPECTROFOTOMETRA

La Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms
utilizadas para la deteccin especfica de molculas y densidad
ptica. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su
aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes,
biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido,
gas).
El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la
radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene
una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.
Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, an el
vidrio que parece ser completamente transparente absorbe
longitudes de ondas que pertenecen al espectro visible. Cuando la
luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la
energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser
absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas
absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide
sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes
de onda no absorbida.

PROTOCOLO DE ESPECTROFOTOMETRA DE LOS CIDOS NUCLEICOS
1- Procedemos a encender el espectrofotmetro y ajustar los
parmetros para la correcta medicin de densidad ptica de las
muestras.
2- La medicin se realiza a 260nm de Absorbencia
3- la muestra se carga en una cubeta de cuarzo estril, en un
volumen de 2 uL, disolvindose en 1998 uL de ADESI. Esta parte del
proceso debe realizarse con cuidado de no tocar la zona de la
cubeta que ser expuesta a las longitudes de onda, dado que podra
interferir en nuestros resultados.

4- Se utiliz una cubeta control o blanco.

5- una vez cargadas las cubetas estas se introducen en los
espacios dentro del espectrofotmetro, cuidando de que los lados
que no tienen ranuras queden expuestos al paso del haz de luz.

6- Cerramos la tapa y marcamos Start o Comienzo.

7- Procedemos a anotar nuestros resultados.

RESULTADOS ESPECTROFOTMETRO
grupos
concentracin
ng/ul 260/280 260/230
O. Barra 2.03 2.03 3.383

Los resultados dan a conocer claramente la existencia de ADN en la
muestra, lo que nos indica que el procedimiento se realizo de
manera correcta.


ELECTROFORESIS DE ADN

Las molculas de ADN cargadas negativamente gracias a su grupo
fosfato, al exponerse a un campo electromagntico se mueven. La
velocidad de migracin es proporcional al voltaje aplicado. Pero
si este voltaje es muy elevado las bandas de elevado peso
molecular no migraran de igual forma, de tal forma el rango
efectivo de separacin disminuye segn se aumenta el campo
elctrico. Otro factor que influye en una electroforesis de ADN es
el gel, esto se da por las distintas naturalezas y tamizado que
ste presente, por ejemplo un gel de poliacrilamida permite
separar bandas desde 5 a 500pb (pares de bases), logrando una
definicin que permite diferenciar bandas por tan solo 1
nucletido (Muy til a la hora de secuenciar ADN). En el caso del
gel de agarosa nos permite separar bandas desde 200 a 50.000 pb,
obviamente tiene una menor resolucin, pero su espectro de
separacin es mayor. Estos geles son depositados en una cmara,
sumergidos en un buffer (pH 8.0) para que las molculas de ADN se
desplacen desde el polo negativo al positivo. Otro aspecto a
considerar que es estrictamente necesario es que a pesar de que
los cidos nucleicos absorben UV, estos no emiten luz visible
alguna y por ello es necesario teirlos. Para este proceso se usan
floroforos mas especficamente Gel Red el cual es muy estable en
el tiempo y es inocuo para el humano y el medio ambiente a
diferencia del Bromuro de Etidio que es altamente mutagnico y
citotxico.
-Marcador de Peso 1KB: Los marcadores moleculares son biomolculas
que se pueden relacionar con un rasgo gentico. Las biomolculas
que pueden ser marcadores moleculares son las protenas (antgenos
e isoenzimas) y el ADN (genes conocidos o fragmentos de secuencia
y funcin desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se
asocian inequvocamente con un rasgo gentico, se dice que forman
un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables)
-Buffer de corrida: utilizado para condicionar el medio necesario
para la electroforesis del ADN. Permitiendo visualizar la corrida
electrofortica. Su consistencia viscosa se debe al glicerol, que
provee mayor densidad a la muestra para evitar que esta se caiga o
se dirija a otro pocillo.
-Buffer TAE 1X: Buffer de corrida que permite la liberacin de
iones los cuales proporcionan los electrones necesarios para que
ocurra el paso de la corriente a travs del gel. Esta disolucin
est formada por Tris, acetato y EDTA, y es de uso frecuente
en electroforesis.
-Gel Red: Fluorforo que se intercala en los cidos nucleicos para
permitir su visualizacin en presencia de luz UV.
-Gel de agarosa: Junto al Buffer TAE 1X se mezclaran para obtener
el gel en donde se pondrn las peinetas y posteriormente el ADN
con el marcador de peso y el fluorforo a utilizar, luego se lleva
al transluminador UV para visualizar.

PREPARACIN DEL GEL
Gel al 1%, 100ml
-Pesar 1g de Agarosa en una balanza analtica en un pocillo
especial y agregar en un frasco tapa rosca.
-Adicionar 100ml de Buffer TAE 1x.
-regula y mantiene a pH estable.
-Fundir en el microondas con precaucin de que no hierva.
-Dejar enfriar hasta que sea posible mantenerlo en las manos sin
quemar.
-Verter cuidadosamente en la cmara electrofortica segn de uso
la cual debe contener en su interior la peineta correspondiente.
-Esperar a que solidifique y extraer la peineta, que dejar
plasmados los pocillos.
POSISIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Utilizando parafilm se deben agregar las sustancias en el
siguiente orden:

-3ul de solucin + 1ul de Marcador de peso = Mezclar (2ul volumen
final)
-1ul de solucin + 3ul de muestra de ADN plasmidial = Mezclar (2ul
volumen final)
-verter cada volumen final en un pocillo del gel, manteniendo el
orden.
-Nuestra muestra fue depositada en el 3 carril.

CONDICIONES DE LA CMARA ELECTROFRETICA

-Los pocillos del gel en la cmara deben ir ubicados en el ctodo;
visualizado de color negro, para que migren hacia el nodo; color
rojo.
-Los cables que conectan la cmara con la fuente de poder, deben
ir ubicados de acuerdo a sus respectivos colores
-Se deja 30 minutos corriendo a 80V.

VISUALIZACIN DEL GEL

-Luego de transcurrido los 30 minutos reciclar el Buffer TAE 1x
que cubra el gel.
-Extrae el gel cuidadosamente, con muchsimo cuidado para no
daarlo.
-Introducir el gel en el transluminador UV procurando que se
encuentre apagada.
-Encender la luz UV.
-Visualizar en el computador, mediante un software de anlisis de
geles.
-Analizar la foto correspondiente.
-Desechar el gel luego de su utilizacin.

RESULTADOS
Al observar la fotografa se puede
apreciar claramente que nuestra
muestra, se cargo de forma
incorrecta, dado que la solucin
escapa de los mrgenes del carril
(3), adems se puede observar una
degradacin del ADN plasmidial,
suponemos que manipulamos ms de la
cantidad necesaria de algn
reactivo, adems no se observan
residuos de ADN Genmico ni tampoco
residuos de RNA ribosomal, en si el
procedimiento no se realizo satisfactoriamente aunque creemos
que se podra utilizar el ADN, pero se debera realizar algn
protocolo extra de purificacin.




DISCUSIN
Al momento de comparar nuestro carril con los dems, nos damos
cuenta que la nica similitud existente es que todos los grupos
contienen en sus pocillos ADN plasmidial. Sin embargo en nuestro
caso este se encontraba algo degradado. al observar la fotografa
se podra suponer que no haba ADN necesario, pero al relacionar
los resultados del espectrofotmetro vs la visualizacin del gel,
pensamos que al cargar el gel se pudo haber cometido algn error,
o simplemente utilizamos demasiado reactivo para desnaturalizar el
ADN, adems pudimos darnos cuenta que en nuestro pocillo exista
en todas partes algo de solucin, ya que el gel brillaba en toda
su amplitud, por otro lado tuvimos la duda de que alguno de las
soluciones que utilizamos tuviera ARNasas puesto que no se
observan residuos de ARN en nuestro carril, lo cual no ocurre en
los dems, revisando el material de apoyo y nuestros apuntes nos
atrevemos a decir que no utilizamos ARNasas y que la ausencia de
ARN en el gel podra deberse a que este se encuentra degradado.

CONCLUSIN
Tomando en cuenta todas las complicaciones que tuvimos al momento
de la visualizacin de nuestra extraccin de ADN plasmidial en el
gel de agarosa, podemos concluir que necesitamos ms prctica para
mejorar nuestro manejo de la micropipeta al momento de realizar la
carga del gel, puesto que se logra apreciar de manera evidente,
que nuestra solucin de ADN, escapa de los mrgenes del pocillo.
Adems cabe destacar la importancia de saber el contenido de cada
una de las soluciones que utilizamos en el protocolo del practico
dado que nos podra ser de mucha ayuda al momento de sacar las
conclusiones, hacemos referencia a esto puesto que no estamos
seguros si es que alguna de las soluciones (I,II o III) contenan
o no ARNasas, lo que afecta sin lugar a dudas nuestro comentario
final, por supuesto que no descartamos una mala manipulacin de
los reactivos o del material en alguno de los pasos del protocolo,
sin embargo lo que si podemos afirmar es que efectivamente nuestro
carril contena ADN plasmidial, y podemos dejar a modo de
conclusin la posibilidad de utilizar algn mtodo de purificacin
de ADN para poder as sacar provecho de nuestra extraccin.

BIBLIOGRAFIA
Cabrera, J. (2001). Texto Ilustrado de Biologa Molecular e
Ingeniera Gentica: Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en
Ciencias de la Salud, Elsevier - Health Sciences Division.



Caballero, J; Moyano, E; Muoz, J. (2002). Paper: Purificacin de
ADN plasmdico y electroforesis del mismo en gel de agarosa.
Recuperado el 08-05-2014 de www.uco.es, disponible en
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/38%20PURIFICACI%C3%93N%20DNA%20PL%C3%81SMIDO.pdf

Concepcin, J; Puerta B; Claudia P; Urea P. (1998). Libro:
Prcticas de biologa molecular; plsmidos y electroforesis,
recuperado el 05/05/2014 de www.googlebooks.cl, disponible en
http://books.google.cl/books?id=pTrKpnFClZQC&pg=PA32&lpg=PA32
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