INFORME LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR I, EXTRACCIN DE ADN GENMICO
ORLANDO BARRA EDUARDO PACHECO ANDREA SOBARZO
PROFESORES: GRACIELA BERRIOS
TEMUCO CHILE 2014 INTRODUCCIN Hoy en da la ciencia nos ha permitido, pasear por los ms remotos horizontes de la biologa, conociendo incluso la informacin biolgica que se requiere para generar a un individuo completo, a esta informacin la conocemos con el nombre de ADN, logrando encontrar en un mismo individuo distintas variedades de esta biomolcula, tales como; ADN genmico, Mitocondrial, Ribosomal e incluso en el caso de las bacterias Plasmidial, este ltimo hace refencia a molculas de ADN extracromosmico, ya sea circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN cromosmico, su tamao vara desde 1 a 250 kb y en general este tipo de ADN no contiene informacin esencial, sino que mas bien le confieren ventajas al hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo ms comn, es el de los plsmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibitico, de manera que el plsmido nicamente supondr una ventaja en presencia de ese antibitico. Se ha logrado identificar algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano, rompiendo momentneamente el cromosoma y situndose en su interior, con lo que, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el plsmido. Gracias a la caracterstica de replicacin autnoma y las que guardan relacin con ciertas ventajas para el hospedador, han sido muy utilizados en biologa molecular, especficamente en ingeniera gentica donde son utilizados como vectores de clonacin, gracias a su fcil manipulacin para insertar nuevas secuencias gnicas, tambin son utilizadas para producir grandes cantidades de protenas (insulina), y hoy en da son de gran inters en el mercado de la agrobiotecnologa como resultado de las fuertes crticas de los grupos ecologistas hacia la presencia de antibiticos en los OGM. Sin lugar a dudas la utilizacin de ADN plasmidial en biologa molecular inici un cambio de paradigma en la biotecnologa, logrando un alto auge como herramienta de mejoramiento gentico y productivo de diferentes industrias biolgicas, pero necesariamente antes de aplicar estas supuestas virtudes y atributos de inters biotecnolgico, es necesario reconocer la caracterstica y extraer el ADN plasmidial de dicha bacteria para luego ser estudiado rigurosamente en el laboratorio.
OBJETIVOS GENERALES
-Conocer y analizar el procedimiento de extraccin de ADN plasmidial.
-Familiarizar al estudiante con metodologas y normas de trabajo, en un laboratorio de Biologa Molecular aplicando siempre el conocimiento obtenido previo gracias a la lectura de la gua de trabajo otorgadas por el profesor.
OBJETIVOS ESPECFICOS
-Conocer la razn por la cual utilizamos cada reactivo presente en el protocolo.
-Lograr aplicar correctamente la cuantificacin de ADN y poder dar una explicacin concreta de los resultados.
EXTRACCIN DE ADN PLASMIDIAL
Los plsmidos son pequeas molculas de DNA extra-cromosmico circular o lineal que aparecen en el citoplasma de las bacterias y que determinan rasgos que no son vitales para La clula, pero que de alguna manera contribuyen la capacidad del organismo para adaptarse. Estructuralmente Este ADN no difiere Del cromosmico, pero sin embargo es ms resistente a agentes qumicos, esta mayor resistencia es la base para La creacin de protocolos para la separacin y extraccin de DNA plasmidial y destruccin de los otros cidos nucledos contaminantes. La lisis alcalina, en combinacin con un detergente como el SDS (dodecilsulfato sdico) ha sido usado por ms de 20 aos para aislar el DNA plasmidial de E. coli (Birnboin y Doly 1979). La exposicin de una suspensin bacteriana a un fuerte detergente aninico con pH elevado, lisan la pared celular bacteriana, desnaturalizando el DNA cromosmico y protenas y relajando el DNA plasmidial.
MATERIALES Y MTODOS
En este prctico se utilizaron cepas bacterianas, provenientes de Escherischia coli, las cuales fueron incubadas el da anterior inoculando un tubo falcon con un mondadiente que contiena la bacteria, medio LB; el cual es un medio lquido que se utiliza para mantener en condiciones adecuadas de cultivo a E.coli, contiene 10g de NaCl, 5g de Extracto de levadura y 10g de triptona, adems la suspensin tambin estaba provista de y ampicilina. Los cultivos se mantuvieron en agitacin por una noche a 37C.
PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE DNA PLASMIDIAL
1. Centrifugar los cultivos a 12.000 rpm por 3 min
2. Remover el sobrenadante; para reducir contaminacin por fragmentos de la pared celular del husped
3. Resuspender el pellet en 100 L de solucion Alcalina I fria, mezclar vigorosamente con vortex.: Solucin amortiguadora que proporciona un estado estable para el ADN. mantiene la osmolaridad para prevenir la prematura lisis celular y previene la degradacin del DNA por la captura de iones.
4. Adicionar 200 L de solucin de lisis II (fresca), cerrar el tubo y mezclar invirtiendo cinco veces, No usar vortex. Poner el tubo en hielo. Utilizado para promover la Lisis celular, condiciona la desnaturalizacin del DNA cromosmico, denaturacin de protenas y liberacin de plsmidos.
5. Adicionar 150 L de solucin alcalina III fra, cerrar el tubo y mezclar invirtiendo cinco veces. Poner el tubo en hielo 3-5 minutos (NO CONGELAR); cumple la funcin de Unir las hebras de DNA y la remocin de contaminantes, precipitando protenas denaturadas y la mayora de los polisacridos.
6. Centrifugar a mxima velocidad por 5 minutos a 4C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
7. Adicionar un volumen de fenol: cloroformo (1:1 v/v), mezclar en vortex y centrifugar a mxima velocidad por 2 minutos a 4C; El cloroformo es utilizado para favorecer la denaturalizacin de las protenas y deshidratacin del ADN.
8. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
9. Precipitar el ADN plasmidial adicionando 2 volmenes de etanol absoluto, incubar a -20oC por 20 minutos; La adicin del etanol absoluto se sustenta en las cualidades moleculares del DNA, buscando precipitar los cidos nuleicos sacando provecho de su polaridad.
10. Centrifugar a mxima velocidad por 5 minutos a 4C
11. Remover el sobrenadante, adicionar 1 ml de etanol al 70% y Centrifugar a mxima velocidad por 2 minutos a 4C; utilizado para el enjuague y Remocin de impurezas como restos de compuestos fenlicos y sales.
12. Remover el sobrenadante e invertir el tubo sobre una superficie limpia para permitir que la pellet quede lo ms seco posible.
13. Secar el pellet a T.A., resuspender en 50 ul de ADESI y Guardar a -20C; Resuspender y rehidratar el ADN. El ser desionizada permite que los iones no interfieran en otras reacciones. ESPECTROFOTOMETRA
La Espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms utilizadas para la deteccin especfica de molculas y densidad ptica. Se caracteriza por su precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido, gas). El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, an el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitudes de ondas que pertenecen al espectro visible. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.
PROTOCOLO DE ESPECTROFOTOMETRA DE LOS CIDOS NUCLEICOS 1- Procedemos a encender el espectrofotmetro y ajustar los parmetros para la correcta medicin de densidad ptica de las muestras. 2- La medicin se realiza a 260nm de Absorbencia 3- la muestra se carga en una cubeta de cuarzo estril, en un volumen de 2 uL, disolvindose en 1998 uL de ADESI. Esta parte del proceso debe realizarse con cuidado de no tocar la zona de la cubeta que ser expuesta a las longitudes de onda, dado que podra interferir en nuestros resultados.
4- Se utiliz una cubeta control o blanco.
5- una vez cargadas las cubetas estas se introducen en los espacios dentro del espectrofotmetro, cuidando de que los lados que no tienen ranuras queden expuestos al paso del haz de luz.
6- Cerramos la tapa y marcamos Start o Comienzo.
7- Procedemos a anotar nuestros resultados.
RESULTADOS ESPECTROFOTMETRO grupos concentracin ng/ul 260/280 260/230 O. Barra 2.03 2.03 3.383
Los resultados dan a conocer claramente la existencia de ADN en la muestra, lo que nos indica que el procedimiento se realizo de manera correcta.
ELECTROFORESIS DE ADN
Las molculas de ADN cargadas negativamente gracias a su grupo fosfato, al exponerse a un campo electromagntico se mueven. La velocidad de migracin es proporcional al voltaje aplicado. Pero si este voltaje es muy elevado las bandas de elevado peso molecular no migraran de igual forma, de tal forma el rango efectivo de separacin disminuye segn se aumenta el campo elctrico. Otro factor que influye en una electroforesis de ADN es el gel, esto se da por las distintas naturalezas y tamizado que ste presente, por ejemplo un gel de poliacrilamida permite separar bandas desde 5 a 500pb (pares de bases), logrando una definicin que permite diferenciar bandas por tan solo 1 nucletido (Muy til a la hora de secuenciar ADN). En el caso del gel de agarosa nos permite separar bandas desde 200 a 50.000 pb, obviamente tiene una menor resolucin, pero su espectro de separacin es mayor. Estos geles son depositados en una cmara, sumergidos en un buffer (pH 8.0) para que las molculas de ADN se desplacen desde el polo negativo al positivo. Otro aspecto a considerar que es estrictamente necesario es que a pesar de que los cidos nucleicos absorben UV, estos no emiten luz visible alguna y por ello es necesario teirlos. Para este proceso se usan floroforos mas especficamente Gel Red el cual es muy estable en el tiempo y es inocuo para el humano y el medio ambiente a diferencia del Bromuro de Etidio que es altamente mutagnico y citotxico. -Marcador de Peso 1KB: Los marcadores moleculares son biomolculas que se pueden relacionar con un rasgo gentico. Las biomolculas que pueden ser marcadores moleculares son las protenas (antgenos e isoenzimas) y el ADN (genes conocidos o fragmentos de secuencia y funcin desconocida). Cuando varios marcadores moleculares se asocian inequvocamente con un rasgo gentico, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o cuantificables) -Buffer de corrida: utilizado para condicionar el medio necesario para la electroforesis del ADN. Permitiendo visualizar la corrida electrofortica. Su consistencia viscosa se debe al glicerol, que provee mayor densidad a la muestra para evitar que esta se caiga o se dirija a otro pocillo. -Buffer TAE 1X: Buffer de corrida que permite la liberacin de iones los cuales proporcionan los electrones necesarios para que ocurra el paso de la corriente a travs del gel. Esta disolucin est formada por Tris, acetato y EDTA, y es de uso frecuente en electroforesis. -Gel Red: Fluorforo que se intercala en los cidos nucleicos para permitir su visualizacin en presencia de luz UV. -Gel de agarosa: Junto al Buffer TAE 1X se mezclaran para obtener el gel en donde se pondrn las peinetas y posteriormente el ADN con el marcador de peso y el fluorforo a utilizar, luego se lleva al transluminador UV para visualizar.
PREPARACIN DEL GEL Gel al 1%, 100ml -Pesar 1g de Agarosa en una balanza analtica en un pocillo especial y agregar en un frasco tapa rosca. -Adicionar 100ml de Buffer TAE 1x. -regula y mantiene a pH estable. -Fundir en el microondas con precaucin de que no hierva. -Dejar enfriar hasta que sea posible mantenerlo en las manos sin quemar. -Verter cuidadosamente en la cmara electrofortica segn de uso la cual debe contener en su interior la peineta correspondiente. -Esperar a que solidifique y extraer la peineta, que dejar plasmados los pocillos. POSISIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS
Utilizando parafilm se deben agregar las sustancias en el siguiente orden:
-3ul de solucin + 1ul de Marcador de peso = Mezclar (2ul volumen final) -1ul de solucin + 3ul de muestra de ADN plasmidial = Mezclar (2ul volumen final) -verter cada volumen final en un pocillo del gel, manteniendo el orden. -Nuestra muestra fue depositada en el 3 carril.
CONDICIONES DE LA CMARA ELECTROFRETICA
-Los pocillos del gel en la cmara deben ir ubicados en el ctodo; visualizado de color negro, para que migren hacia el nodo; color rojo. -Los cables que conectan la cmara con la fuente de poder, deben ir ubicados de acuerdo a sus respectivos colores -Se deja 30 minutos corriendo a 80V.
VISUALIZACIN DEL GEL
-Luego de transcurrido los 30 minutos reciclar el Buffer TAE 1x que cubra el gel. -Extrae el gel cuidadosamente, con muchsimo cuidado para no daarlo. -Introducir el gel en el transluminador UV procurando que se encuentre apagada. -Encender la luz UV. -Visualizar en el computador, mediante un software de anlisis de geles. -Analizar la foto correspondiente. -Desechar el gel luego de su utilizacin.
RESULTADOS Al observar la fotografa se puede apreciar claramente que nuestra muestra, se cargo de forma incorrecta, dado que la solucin escapa de los mrgenes del carril (3), adems se puede observar una degradacin del ADN plasmidial, suponemos que manipulamos ms de la cantidad necesaria de algn reactivo, adems no se observan residuos de ADN Genmico ni tampoco residuos de RNA ribosomal, en si el procedimiento no se realizo satisfactoriamente aunque creemos que se podra utilizar el ADN, pero se debera realizar algn protocolo extra de purificacin.
DISCUSIN Al momento de comparar nuestro carril con los dems, nos damos cuenta que la nica similitud existente es que todos los grupos contienen en sus pocillos ADN plasmidial. Sin embargo en nuestro caso este se encontraba algo degradado. al observar la fotografa se podra suponer que no haba ADN necesario, pero al relacionar los resultados del espectrofotmetro vs la visualizacin del gel, pensamos que al cargar el gel se pudo haber cometido algn error, o simplemente utilizamos demasiado reactivo para desnaturalizar el ADN, adems pudimos darnos cuenta que en nuestro pocillo exista en todas partes algo de solucin, ya que el gel brillaba en toda su amplitud, por otro lado tuvimos la duda de que alguno de las soluciones que utilizamos tuviera ARNasas puesto que no se observan residuos de ARN en nuestro carril, lo cual no ocurre en los dems, revisando el material de apoyo y nuestros apuntes nos atrevemos a decir que no utilizamos ARNasas y que la ausencia de ARN en el gel podra deberse a que este se encuentra degradado.
CONCLUSIN Tomando en cuenta todas las complicaciones que tuvimos al momento de la visualizacin de nuestra extraccin de ADN plasmidial en el gel de agarosa, podemos concluir que necesitamos ms prctica para mejorar nuestro manejo de la micropipeta al momento de realizar la carga del gel, puesto que se logra apreciar de manera evidente, que nuestra solucin de ADN, escapa de los mrgenes del pocillo. Adems cabe destacar la importancia de saber el contenido de cada una de las soluciones que utilizamos en el protocolo del practico dado que nos podra ser de mucha ayuda al momento de sacar las conclusiones, hacemos referencia a esto puesto que no estamos seguros si es que alguna de las soluciones (I,II o III) contenan o no ARNasas, lo que afecta sin lugar a dudas nuestro comentario final, por supuesto que no descartamos una mala manipulacin de los reactivos o del material en alguno de los pasos del protocolo, sin embargo lo que si podemos afirmar es que efectivamente nuestro carril contena ADN plasmidial, y podemos dejar a modo de conclusin la posibilidad de utilizar algn mtodo de purificacin de ADN para poder as sacar provecho de nuestra extraccin.
BIBLIOGRAFIA Cabrera, J. (2001). Texto Ilustrado de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica: Conceptos, Tcnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud, Elsevier - Health Sciences Division.
Caballero, J; Moyano, E; Muoz, J. (2002). Paper: Purificacin de ADN plasmdico y electroforesis del mismo en gel de agarosa. Recuperado el 08-05-2014 de www.uco.es, disponible en http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol- mol/pdfs/38%20PURIFICACI%C3%93N%20DNA%20PL%C3%81SMIDO.pdf
Concepcin, J; Puerta B; Claudia P; Urea P. (1998). Libro: Prcticas de biologa molecular; plsmidos y electroforesis, recuperado el 05/05/2014 de www.googlebooks.cl, disponible en http://books.google.cl/books?id=pTrKpnFClZQC&pg=PA32&lpg=PA32 &dq=biologia+molecular+adn+plasmidial&source=bl&ots=1SzklL2_6 q&sig=ZwcxCr3JEWVFSMNsWtZXB1dZfRA&hl=es&sa=X&ei=mA9sU- TsBoLIsATS44LoCw&ved=0CCkQ6AEwAA#v=onepage&q=biologia%20molec ular%20adn%20plasmidial&f=false.