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PRUEBAS BIOQUÍMICAS REALIZADAS

A ENTEROBACTERIAS
CATALASA NITRITOS
CITOCROMO OXIDASA
PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA
DE MOELLER)
CITRATO ROJO DE METILO(RM)
(EOSINA-AZUL METILENO) EMB SIM (SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)
HECKTOEN-ENTERICO (HE) SS (SALMONELLA SHIGELLA)
LIA ( LISINA-HIERRO) TSI (TRES AZUCARES-HIERRO)
MALONATO UREA
MAC CONKEY VOGES PROSKAUER (VP)
MOTILIDAD XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

(PRINCIPAL) (ENTEROBACTERIAS) (GLOSARIO)

























CATALASA

FUNDAMENTO
La catalasa es una enzima que descompone el peroxido de
Hidrogeno (H2O2) en agua y oxigeno. El peroxido de Hidrogeno se
forma como uno de los productos finales del metabolismo aerobio de
los hidratos de carbono. Si se permite que se acumule resulta letal
para la célula bacteriana.

La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para
diferenciar miembros de la familia Micrococaceae de miembros de la
familia Streptococcaceae.


MATERIALES Y
REACTIVOS
*Peroxido de Hidrogeno al 3% almacenado en frasco ámbar en frío.
*Cultivo de 18-24 horas del microorganismo a probar

PROCEDIMIENTO
*Con un asa o palillo de madera, transferir parte del centro de una
colonia a la superficie de un portaobjetos
*Agregar 1 gota de Peroxido de Hidrógeno al 3% y observar la
producción de burbujas

INTERPRETACION
la producción rápida y sostenida de burbujas o efervescencia
constituye una reacción positiva.

NOTA
los eritrocitos poseen cátalasa, por lo cual se debe evitar tomar
colonias de agar sangre para evitar falsos positivos.


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ACTIVIDAD CITOCROMO-OXIDASA

FUNDAMENTO
Los citocromos son Hemoproteinas que contienen hierro y actúan
como el ultimo eslabón de la cadena respiratoria aerobia,
transfiriendo electrones (Hidrogeno) al oxigeno, con formación de
agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios
o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de Oxidasa es
importante para identificar aquellos organismos que carecen de esta
enzima (anaerobios obligados). La prueba es muy útil para diferencia
Enterobacterias (Todas Oxidasa negativas) de otras especies como
Pseudomona o Neisserias oxidasa positiva.

MATERIALES Y
REACTIVOS
Hay dos compuestos susceptibles a oxidarse por la acción de esta
enzima, produciendo un color inicialmente rosado y luego azul
oscuro a negro. Dichos compuestos son dimetil-fenil-diamina y
tetrametil-parafenil-endiamina. Siendo el más utilizado el segundo,
también se dispone en el mercado de tirillas de Oxidasa o el reactivo
ya preparado.

INTERPRETACION
Las colonias bacterianas con actividad de Citocromo-Oxidasa en
segundos toman un color azul intenso en el sitio de la prueba. Para
esta técnica no se debe utilizar asas de acero inoxidable, dado que
los productos de Oxidación formados al esterilizarlas a la llama
pueden producir reacciones falsas positivas. Por lo cual debemos
utilizar palillos de madera.



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MAC CONKEY

FUNDAMENTO
Agar selectivo y diferencial para el aislamiento de Enterobacterias. El
medio contiene sales biliares y cristal violeta que son inhibidores de
la microbiota Gram positiva. La lactosa junto al indicador Rojo neutro
sirven para la comprobación de la degradación de dicho azúcar,
dividiendo el grupo en 2: Bacterias fermentadoras y no
fermentadoras de Lactosa.

TECNICA:
Sembrar en el agar realizando siembra por agotamiento a partir del
cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37º C.

INTERPRETACION
Las colonias fermentadoras de lactosa dan un color rosado. Las
colonias no fermentadoras de lactosa son incoloras, lo anterior por el
comportamiento del indicador de pH.


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HECKTOEN-ENTERICO (HE)
FUNDAMENTO
El agar HE es un medio de cultivo selectivo para la identificación de bacterias
intestinales patógenas. La alta concentración de sales biliares inhibe el desarrollo de
las bacterias Gram positivas. La Fucsina acida junto con el azul de Bromotimol
reaccionan virando a amarillo al bajar le pH del medio por la acción de los ácidos
producidos a partir de la fermentación de los 3 hidratos de carbono (Lactosa,
Sacarosa, Salicina) que contiene el medio. La combinación de tiosulfato y una sal de
hierro dan una coloración negra a las colonias H2S positivas.

TECNICA
Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del microorganismo en
estudio. Incubar a 37º C por 24 horas.

INTERPRETACION
Las bacterias fermentadoras rápidas de lactosa como Escherichiae coli forman
colonias de color naranja brillante a rosa salmón.
* Las colonias de Salmonella spp. Son de color azul verdoso con típicos centros
negros por el gas H2S.
*Las colonias de Shigella spp. Son verde azulosas.
* Las cepas de Proteus spp son algo inhibidas, las colonias que se desarrollan son
pequeñas y transparentes.


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XLD ( XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO)

FUNDAMENTO
La degradación a acido a partir de la Xilosa, lactosa y sacarosa producen un
viraje a amarillo del indicador Rojo de fenol. El tiosulfato y sal de hierro revelan
la formación de H2S por la precipitación del sulfuro de hierro negro en las
colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, producen cadaverina, se
reconocen por la presencia de un color rojo-purpúreo debido al aumento de pH
alrededor de las colonias. El efecto inhibidor es muy débil.

TECNICA
Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del
microorganismo en estudio, incubar a 37’ C por 24 horas.

INTERPRETACION
Los microorganismos como E. coli, Klebsiella sp y Enterobacter so. Pueden
utilizar más de un hidrato de carbono y formar colonias amarillas
brillantes.
*La mayor parte de las especies de Salmonella y Arizona forman colonias Rojas,
la mayoria con centro negro debido a la producción de H2S.
*Los géneros Shigella, Providencia y algunas cepas de Proteus no utilizan
ningún hidrato de carbono y forman colonias translucidas.
*Las colonias que solo fermentan la Xilosa presentaran un color Naranja.


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SS (SALMONELLA SHIGELLA)

FUNDAMENTO
El agar SS es un medio altamente selectivo que inhibe el desarrollo de la mayoria
de coniformes y permite el desarrollo de las especies de Salmonella y Shigella. La
alta concentración de sales biliares y citrato se sodio inhibe a todas la bacterias
Gram positivas y a algunas Gram negativas. La Lactosa es el único hidrato de
carbono y el Rojo neutro detecta la producción de acido. El tiosulfato de sodio es
una fuente se azufre y las bacterias que producen H2S se detectan por la
presencia de un precipitado negro por el citrato ferrico.

TECNICA
Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del
microorganismo en estudio, incubar a 37’ C por 24 horas.

INTERPRETACION
las cepas de Shigella y la mayoria de Salmonella presentan colonias incoloras.
Colonias trasparentes con centro negro: Proteus y algunas Salmonellas. Las
bacterias fermentadoras de Lactosa presentan colonias rojas a rosadas.


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EMB
(EOSINA-AZUL METILENO)

FUNDAMENTO
Es una agar selectivo para el aislamiento de Enterobacterias patógenas. Los
colorantes de anilina (Eosina y azul de metileno) inhiben las bacterias Gram
positivas y las Gram negativas exigentes nutricionalmente. También se combinan
precipitándose a pH acido actuando como indicadores de producción de ácidos
de los carbohidratos presentes en el medio (Lactosa y Sacarosa)

TECNICA
Inocular realizando siembra por agotamiento a partir del cultivo del
microorganismo en estudio, incubar a 37’ C por 24 horas.

INTERPRETACION
Las colonias fermentadoras son de color rosado. Escherichiae coli fermenta los
azucares y forma colonias verdes con brillo metálico. Las colonias no
fermentadoras son incoloras,


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CITRATO

FUNDAMENTO
El citrato de sodio es una sal del acido cítrico, un compuesto orgánico simple
que constituye uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxilicos.
Generalmente los microorganismos que emplean el citrato como única fuente de
carbono, utilizan sales de amonio como única fuente de nitrógeno. El
metabolismo del citrato realizado, por algunas bacterias se realiza por el ciclo de
krebs y requiere el desdoblamiento del citrato por la enzima citritasa (citrato-
oxalacetato-liasa o citrato desmolasa) en presencia de magnesio o manganeso
y de transportadores como citrato permeasas.
La citritasa actúa sobre el citrato produciendo acido oxalacetico y acetato;
productos que son convertidos enzimaticamente a piruvato y dióxido de carbono.
Durante esta reacción el medio comienza a alcalinizarse por el CO2 que se
genera, el cual se combina con el agua y el sodio para formar Carbonato un
producto alcalino, este carbonato da la alcalinidad que produce el cambio de
color del indicador de pH del medio de verde a azul Prusia oscuro (indicador:
azul de bromotimol, amarillo a pH< de 6.0 y azul a pH > de 7.6). El medio incluye
citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de
nitrógeno.

TECNICA
Inocular el tubo con agar citrato de Simmons realizando siembra por estría
tomando una colonia del microorganismo en estudio. Incubar a 37 grados C por
24 horas.

INTERPRETACION
El desarrollo de un color azul intenso en 24-48 horas indica una prueba positiva
y revela que el microorganismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato en
el medio con la formación de productos alcalinos. La prueba también es positiva
en ausencia de color azul si existe crecimiento del microorganismo a lo largo de
la estría de inoculación.


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TSI
( TRES AZUCARES-HIERRO)

FUNDAMENTO
Es una prueba usada para la fermentación de la glucosa, lactosa y sacarosa y la
producción de H2S por parte de la bacteria sumándole producción de gas. El
cambio de color rojo-anaranjado (color inicial del medio) a amarillo indica
fermentación. Si se fermenta únicamente la glucosa el cambio de color del medio
ocurre solamente en el fondo debido a que se encuentra 10 veces menos
concentrada que la sacarosa y la lactosa, además los radicales libres no son
suficientes para hacer virar el medio.
Si se fermentan los 3 azucares hay cambio de color tanto en la superficie como
en el fondo. La presencia de burbujas que rompen el medio y a veces tienden a
expulsarlo indica presencia de gas como producto final de la fermentación.
La producción de H2S se manifiesta por la aparición de un precipitado color
negro debido a la reducción de la sal de hierro presente en el medio.

TECNICA
Inocular el medio realizando siembra mixta del microorganismo en estudio,
incubar a 37 grados C por 24 horas.

INTERPRETACION

A: Reacción acida. Color amarillo A/A: Fermentación 3 azucares
K: Reacción alcalina. Color roja naranja K/A: Fermentación de la glucosa
Burbujas: Producción de gas K/K: No hay fermentación de los 3
Precipitado negro: Formación H2S


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LIA
( LISINA-HIERRO)

FUNDAMENTO
Es un medio que sirve para demostrar la producción de dos enzimas: la lisina
descarboxilasa y la lisina desaminasa, además la presencia de sales de hierro
sirve para detectar la producción de H2S por algunos microorganismos.
La descarboxilacion de la lisina ocurre en ambiente anaeróbico o sea en el
fondo del tubo y se pone de manifiesto por la alcalinización del medio
produciendo un viraje del indicador púrpura de bromocresol. La presencia de
glucosa en los componentes del LIA determina primero una reacción de
fermentación, produciendo acidificación y cambio de color del medio a amarillo
y el pH favorable para la reacción de descarboxilacion que ocurre después,
volviendo a su color violeta original la parte del fondo del tubo.
La desaminacion de la lisina que se puede producir por los géneros Proteus y
Providencia tiene lugar en la parte superior del tubo produciendo
acido a cetocarbonico que al combinarse con la sal de hierro y en presencia de
oxigeno forma un color violeta rojizo. La producción de H2S se evidencia por la
presencia de un precipitado negro por utilización de las sales de hierro.

TECNICA
Inocular realizando siembra mixta con doble picadura a partir de una colonia del
cultivo del microorganismo en estudio e incubar 24 horas a 37 grados C

INTERPRETACION
A: Reacción acida. Color amarillo
K: Reacción alcalina. Color violeta
R: Reacción alcalina: color rojo
K/K: Descarboxilacion lisina
K/A: Fermentación glucosa. Descarboxilacion lisina
R/A: Desaminacion lisina. Fermentación glucosa


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SIM
( SULFURO-INDOL-MOTILIDAD)

FUNDAMENTO
El indol, es uno de los productos de la degradación metabólicas del amino acido
triptofano. Las bacterias que producen la enzima triptofanasa son capaces de
hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de Indol, acido piruvico y
amoniaco. La prueba del indo esta basada en la formación de un complejo rojo
cuando el Indol reacciona con el grupo aldehído p-dimetilaminobenzaldehido.
Este es el principio activo del reactivo de Kovacs.
MEDIO DE CULTIVO: agar SIM o caldo triptofano

TECNICA
Inocular al medio realizando siembra por picadura hasta la mitad del medio a
partir del cultivo del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37 grados C.
al finalizar este periodo añadir 5 gotas del reactivo de Kovacs por la pared del
tubo.

INTERPRETACION
El desarrollo de un color rojo-fucsia en la interfase del reactivo y de los medio
segundos después añadir el reactivo de Kovacs indica la presencia de indol y
por lo tanto una prueba positiva.



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MOTILIDAD

FUNDAMENTO
Me permite determinar la capacidad de movimiento por parte de un
microorganismo.

TECNICA
Siembra en picadura con el microorganismo a estudiar, incubar 24 horas a 37
grados C

INTERPRETACION
Formación de nata la parte superior de medio indica viabilidad del microorganismo,
desarrollo de turbidez hacia los lados de la estría de inoculación indica motilidad
positiva.


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ROJO DE METILO
(RM)

FUNDAMENTO
Determinar la capacidad de un microorganismo para producir y mantener
estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y
vencer la capacidad amortiguadora del sistema. La prueba Rojo de metilo es
cuantitativa para la producción de acido y requiere que los microorganismos
produzcan ácidos fuertes a partir de la glucosa, de forma que el medio del pH
descienda a menos de 4.4. Esta distinción puede hacerse a través del indicador
Rojo de metilo que presenta color amarillo por encima de un pH de 5.1 y solo
presenta color rojo cuando el pH desciende a 4.4.

REVELADOR
Rojo de metilo

TECNICA
Inocular en el caldo RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en
estudio. Incubar 24-48 horas a 37º C. finalizado este periodo adicionar 5 gotas del
revelador Rojo de metilo.

INTERPRETACION
El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la
producción de acido es suficiente como para bajar el pH a 4.4 y es una prueba
positiva. Cuando ocurre la formación de un color amarillo la prueba es negativa.


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VOGES PROSKAUER
(VP)

FUNDAMENTO
Determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final
neutro (acetoina y 2,3 Butanodiol) a partir de la fermentación d ela glucosa. Los
productos neutros formados en la presencia de oxigeno atmosférico, alcalisis
(Hidróxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el
color producido en la reacción. El Alfa naftol actúa como catalizador para revelar un
complejo color rojo.

REVELADOR
Solución A: Alfa naftol al 5% en etanol absoluto
Solución B: Hidróxido de Potasio al 40% en agua destilada.

TECNICA
Inocular en RMVP con una colonia del cultivo del microorganismo en estudio.
Incubar a 37º C por 24 horas. Al finalizar este periodo adicionar 6 gotas (0.6ml) de
la solución A y 2 gotas (0.2ml) de la solución B. dejar en reposo durante 10-15
minutos.

INTERPRETACION
Una prueba positiva esta indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15
minutos de añadido los reactivos reveladores por la presencia de acetoina. Una
prueba negativa da un color cobrizo.


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MALONATO

FUNDAMENTO
El malonato de sodio, es una sal orgánica que es utilizada por las bacterias como
única fuente de carbono con formaron de productos alcalinos que se evidencia
por un viraje de verde a azul del indicador del medio, azul de Bromotimol. Si un
microorganismo es capaz de utilizar el malonato de sodio como única fuente de
carbono, al mismo tiempo que utilizar el sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno, se produce un aumento de la alcalinidad que se debe a la formación de
Hidróxido de sodio (NaOH).

TECNICA
inocular 1-2 asadas del microorganismo en el Caldo Malonato, incubar a 37º C por
24 horas.

INTERPRETACION
El cambio de color de verde a azul indica una prueba positiva.


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UREA

FUNDAMENTO
Los microorganismos que poseen la enzima Ureasa tienen la capacidad de
hidrolizar la urea contenida en el medio con producción de amoniaco, para esta
prueba se utiliza el caldo urea de stuart o agar urea de christensen. El caldo
sturat esta estabilizado con sales de fosfato a un pH de 6.8. el microorganismo
en estudio debe producir cantidades relativamente grandes a fin de superar el
sistema estabilizador del medio y elevar el pH del medio los suficiente como para
virar el indicador (por encima de 8.0)

TECNICA
inoculación en caldo, incubar a 37º C por 24 horas.

INTERPRETACION
Un cambio de color Rojo fucsia indica que la urea fue hidrolizada por la ureasa
del microorganismo. Ausencia de cambio de color indica reacciona negativa


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PRUEBA AMINO-ACIDOS (CALDO DESCARBOXILASA DE MOELLER)

FUNDAMENTO
El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base mas comúnmente utilizado
para determinar la capacidad de descarboxilacion de amino-ácidos por las
Enterobacterias.
El amino-acido por ensayar se añade al medio base antes de inocular el
microorganismo en estudio. Se debe emplear paralelamente un control que
consiste en un tubo con medio base sin el amino-acido. Ambos se incuban
anoxigénicamente adicionando una capa de aceite mineral estéril.
Durante las etapas iniciales de incubación ambos tubos se vuelven amarillos
debido a la fermentación de la pequeña cantidad de glucosa del medio (pH 5.6).
Si el amino-acido es descarboxilado se forman aminas alcalinas y el medio
retorna a su color púrpura inicial. Los amino-ácido Lisina, Arginina y Ornitina son
3 amino-ácidos ensayados y producen las siguientes aminas específicas.
Lisina Cadaverina (Descarboxilasa)
Ornitina Putrescina (Descarboxilasa)
Arginina Citrulina ( Dihidrolasa)

TECNICA
Inocular con material de una colonia del cultivo del microorganismo en estudio,
dos tubos de caldo de Moeller, uno con el amino-acido y otro sin este (control).
Cubrir ambos tubos con una capa de aceite mineral estéril. Incubar a 37º C por
24 horas.

INTERPRETACION
El desarrollo de un color amarillo en el tubo control indica que el microorganismo
es viable y que el pH del medio ha disminuido lo suficiente para activar las
enzimas descarboxilasas. El retorno al color púrpura o violeta del tubo que
contiene el amino-acido indica una reacción positiva debido a la liberación de
aminas por descarboxilacion.


arginina (+) ornitina (+) lisina (+)
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NITRITOS

FUNDAMENTO
Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los
Nitratos o gas Nitrógeno libre. La reducción de Nitrato (NO3) a Nitrito
(NO2) y a Nitrógeno gaseoso (N2) se produce en condiciones de
anaerobiosis, en las cuales el microorganismo produce su oxigeno
del Nitrato. El oxigeno actúa como un aceptor de Hidrógeno; es decir
el protón y el aceptor final de protones. La mayoría de las bacterias
aerobias son anaerobias facultativas y solo pueden reducir los
Nitratos en ausencia de oxigeno.

REVELADOR:
La presencia de Nitritos se detecta en el medio, añadiendo el
reactivo de Griess- llovays, con al formación de un colorante Rojo de
Diazonio.

PROCEDIMIENTO
Inocular el medio de Nitrato con una parte de la colonia del cultivo
Axenico del microorganismo en estudio. Incubar 24 horas a 37º C.
después de este tiempo añadir 5 gotas del reactivo de Griess-llovays.

INTERPRETACION
El desarrollo de un color rojo después de añadir el reactivo, indica la
presencia de Nitritos y representa una prueba positiva. La ausencia
del color tras el agregado del reactivo puede indicar que los nitritos
no han sido reducidos (Una verdadera prueba negativa), o que han
sido reducidos a productos distintos de los nitritos, como Amoniaco,
Nitrógeno molecular u Oxido Nitroso e Hidroxilamina. Por lo tanto es
necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de zinc a todas las
reacciones negativas. Los iones de Zinc reducen los nitratos a
Nitritos y el desarrollo de un color Rojo tras agregar polvo de zinc
indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción
negativa verdadera. Si no hay cambio de color tras agregar el polvo
de zinc indica que los nitratos fueron reducidos a otros compuestos
como amoniaco, Nitrógeno molecular, Oxido Nitroso e Hidroxilamina.


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