conoce con el nombre microscopio ptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes pticas. Est constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados de tal manera que garantizan un funcionamiento ptimo y ergonmico (19) (ver fig. 4-3): Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y dems elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo). Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolucin (objetivos y ocular) Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin, espejo, condensador y diafragma). Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros). 4.3.-Sistema mecnico del microscopio La parte mecnica del microscopio tambin se denomina montura y es de forma y dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el precio del instrumento. De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeos o porttiles. Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un trabajo profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para realizar los trabajos ms variados y su costo es el ms elevado. Los modelos medianos no convienen a todo tipo de investigacin pero son ms prcticos puesto que su precio es menor gracias a su construccin ms simple. Los microscopios porttiles responden a necesidades ms restringidas y producen aumentos menores, conviniendo para observaciones someras. Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o base, mecanismo de enfoque, la platina, el revlver y el tubo del ocular. 4.3.1- Pie o base Generalmente en herradura o en Y, aunque tambin puede ser rectangular, con un peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la fuente de iluminacin y puede contener un mecanismo para regular la intensidad luminosa. Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato. La columna puede ser inclinada; en su parte ms inferior se dispone el condensador y la parte superior posee una cremallera que permite desplazar en sentido vertical el condensador, la platina o el revlver y el tubo. Las ventajas que procura el microscopio inclinado son mltiples y la posicin es ms confortable para el observador (actividad que es muy incmoda cuando el tubo del microscopio es vertical). 4.3.2.-Mecanismo de enfoque Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el espcimen o ya sea el revlver donde estn colocados los objetivos, de modo que se pueda centrar el punto focal del objetivo que se est utilizando es ese momento. Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rpido del tornillo macromtrico y segundo, otro lento del tornillo micromtrico. La cremallera que permite el movimiento rpido del tornillo macromtrico posee dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para subirlos rpidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el preparado histolgico. El tornillo micromtrico por el contrario posee una graduacin tal que cada divisin de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm. Esta disposicin permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos, considerando el nmero de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte ms superficial y luego la ms profunda. El movimiento del tornillo micromtrico tiene una extensin de 5mm aproximadamente y est limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los objetivos de mayor aumento (11). 4.3.3.-La platina Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histolgicas. Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador. Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijacin e inmovilizacin de la lmina porta- objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro. Este dispositivo permite el examen metdico y completo de la preparacin al proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia atrs y de derecha a izquierda y viceversa. Otra pieza, el vernier (denominado as gracias al nombre de su inventor en 1631), tambin llamado nonius, consiste en dos pequeas reglas graduadas en milmetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura determinada en la preparacin. En la prctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y ms difcil an colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestin. Adems, estas cifras solo son vlidas para el microscopio en el cual se obtuvieron. Hay otros procedimientos ms simples para tal fin (11, 64). 4.3.4.-El revlver Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que permite el intercambio rpido de objetivos mediante un movimiento de rotacin. El revlver est constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que est colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual manera, alojar un nmero variable de objetivos (dos, tres, cuatro o ms). 4.3.5.-El tubo Soporta la porcin ptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable, cuyo interior est pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formacin de reflejos y facilitar la observacin. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la microfotografa, hay un tercer tubo accesorio, generalmente ms largo y vertical que sirve para conectar una cmara fotogrfica sin necesidad de lente ocular. 4.4.-Sistema ptico del microscopio Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolucin (objetivos y ocular) Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan. Los componentes pticos estn colocados en una base estable que permite un intercambio rpido y un alineamiento preciso. El sistema ptico est constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular. 4.4.1.-Los objetivos Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio. Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento, resolucin y de la correccin de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales. Clasificacin: Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos categoras de objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los objetivos apocromticos. En cada categora se distinguen an dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66): Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja. Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografa blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromtico cuando no posee ninguna denominacin. Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y estn mejor diseados para la microfotografa en colores. Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y por ello, son ms costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografa y video a color. Debido a su alto grado de correccin, estos objetivos poseen mayores aperturas numricas que los acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observacin se presenta un poco curvo. Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos. Objetivos secos y objetivos de inmersin: Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersin el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de cedro, que posee un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio. La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que en los objetivos secos, est disminuida. El empleo de la inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento. ptica finita y ptica infinita: Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center (66). La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es rectilneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear objetivos diseados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente. Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los fabricantes estn elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseados para realizar una correccin infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con esta correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparicin de imgenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos nuevos modelos son de mayor tamao (66) (fig. 4-4). Estructura de los objetivos: Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee grabadas las especificaciones y caractersticas. Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromtico que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esfrica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15). Nomenclatura de los objetivos: Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15). La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener (fig. 4-6): Nombre del fabricante: Casa comercial Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante. Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono luminoso. Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con correccin infinita. Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de correccin en las lentes internas para realizar la correccin y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada mvil para el ajuste. Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milmetros. Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros). Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El dimetro general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca ms amplia y slo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente. Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin y para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol). Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para facilitar la identificacin del aumento Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15) 4.4.2.-El ocular El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones: Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la imagen. Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto. La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se denomina colectora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7). Clasificacin: Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. Tambin denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy comn en modelos de microscopios antiguos (11). Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas entre s y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos corregidos al infinito (15). Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromticos secos. Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibicin (11). Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro como en la periferia del campo ptico (11). Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular (11). Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 4-8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas, la curvatura de campo y su empleo ptimo es en combinacin con objetivos de gran poder de aumento.
Cdigo de color de inmersin Medio de inmersin Negro Aceite Naranja Glicerol Blanco Agua Rojo Especial o multiuso Cdigo de color de aumento Aumento Negro 1x, 2.5x Marrn 2x, 2.5x Rojo 4x, 5x Amarillo 10x Verde 16x, 20x Azul turquesa 25x, 32x Azul celeste 40x, 50x Azul cobalto 60x, 63x Blanco, crema 100x, 250x, 200x
Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (mono-oculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos ms modernos son trinoculares, especiales para la microfotografa. Los binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinacin de 45 para realizar la observacin cmodamente. Campo del microscopio: Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el ocular. Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible observado a travs de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo est determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy til al realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de observacin de la preparacin, lo cual se dificulta con un campo circular clsico al quedar zonas superpuestas (11). El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero de campo que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm. Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus caractersticas: UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio. H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observacin microscpica. K, C, comp: Para oculares compensadores. Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos. Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems elementos del tejido. Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del espcimen al encontrarse en el plano de formacin de la misma. Los oculares para la medicin poseen un mecanismo de enfoque mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de medicin del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear algn software de computacin para realizar mediciones sobre las imgenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el mtodo ms econmico y de uso ms generalizado es la medicin con los oculares. En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la finalidad de indicar de manera especfica alguna estructura en particular en el campo de observacin. El sealador se aprecia como una lnea oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo. Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por otra, impedir la formacin de reflejos luminosos que dificulten la visualizacin. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptras en caso que el observador posea una disminucin de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm). Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa un campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta el nmero de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que corresponde al tamao de la misma. Si la clula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2 ed. (13).
4.5.-Sistema de iluminacin El sistema de iluminacin est constituido por las partes del microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la observacin microscpica. Uno de los aspectos crticos a considerar en la microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espcimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se ver afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema ptico. La iluminacin ptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observacin. Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine fotnico. En sus inicios, la microscopa se practicaba con iluminacin por reflexin; se utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lmparas de aceite o petrleo) y la desviaba hacia la preparacin. Este mtodo se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el vaco y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino, carbn, tungsteno, entre otros) que al paso de una corriente elctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50). Con el uso de la bombilla elctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios actuales, desde los ms sencillos y econmicos hasta los ms sofisticados, an poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en el caso que sta no se encuentre alineada con la platina. El sistema de iluminacin est constituido por la fuente de luz, el condensador y un diafragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminacin est colocado debajo de la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la mayora de los casos el estudio de las preparaciones histolgicas se hace por transiluminacin. En otros casos muy especficos se emplea el mtodo de luz reflejada, en el cual se ilumina la superficie del espcimen mediante epi-iluminacin (ver captulo 3). La fuente de luz emite una radiacin que es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un cono luminoso necesario para la visualizacin con objetivos de mayor aumento. 4.5.1.-Fuentes de luz Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen numerosas fuentes de iluminacin artificial, tanto para la observacin rutinaria como para la microfotografa. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la constancia, la uniformidad y la intensidad; adems es muy favorable para los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial: Bombillas de tungsteno y halgenas: La mayora de microscopios de luz estn dotados de lmparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lmparas son radiadores trmicos que emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300 1200 nm. Estn constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que es activado por una corriente elctrica produciendo una importante cantidad de luz y calor. Varan mucho en tamao, diseo y forma (68). Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy brillante para la observacin y se reduce con filtros que disminuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la intensidad sin alterar los colores. Tambin se emplean filtros de colores que compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del espcimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el tinte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la definicin. Lmparas de arco elctrico: Son lmparas que pueden contener gases (vapor de mercurio, xenn o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromtica con filtros apropiados, ideal para microfotografa en blanco y negro o a colores. Tambin se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia). Lser: En los ltimos aos se ha incrementado el uso de lser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificacin de Luz por Emisin Estimulada de Radiacin) (42), que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con caractersticas de tamao, coherencia, forma y pureza controladas. El lser de argn es uno de los ms utilizados, cuya emisin est en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente en microscopa confocal. LED: De las siglas en ingls Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un dispositivo emisor de luz con caractersticas muy prximas a la luz monocromtica (espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente elctrica pasa a travs del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que estn hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lmparas. En comparacin con las bombillas incandescentes, son ms interesantes porque permiten ahorro de energa con un mayor rendimiento lumnico. Para microscopa se emplean LED de larga duracin que proveen una luz muy brillante y fra; esto ltimo es una gran ventaja, puesto que no genera calor y la observacin es ms cmoda para el usuario. En la actualidad se producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca. 4.5.2.-Condensador Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El trmino condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensacin de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la seccin del cono luminoso (11) que a su vez forma una imagen ms clara. El condensador est conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espcimen. El primer condensador que se fabric en 1838 (por Dujardin) posea tres lentes acromticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y tambin producen aberraciones, sin embargo, stas tambin pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de correccin de aberraciones pticas (15): Condensador de Abbe: Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y el ms econmico. Compuesto de dos o ms lentes. Puede llegar a tener una apertura numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observacin de rutina y con objetivos de modesta apertura numrica y amplificacin. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminacin que puede producir. Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad. Acromtico: Corrige aberraciones cromticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es til para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografa (blanco y negro o color). Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el condensador de eleccin para microfotografa a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es ptimo con inmersin y objetivos de mayor aumento. Figura 4-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotnico. El medio de inmersin, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el preparado histolgico como entre el preparado y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15). El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada para optimizar la intensidad y el ngulo de apertura. Cada vez que se cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la apertura numrica del nuevo objetivo. A menudo no es prctico utilizar el mismo condensador para un amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para objetivos de bajo poder de aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una lente frontal adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante un mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercndolo o no a la platina donde est colocado el espcimen (fig. 4-10). Adems de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro, existe una variedad de modelos de condensadores especializados que se utilizan en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento del contraste entre los detalles de la estructura del espcimen. Se han desarrollado condensadores especiales para microscopa de campo oscuro, contraste de fase, luz polarizada, contraste de interferencia diferencial. 4.5.3.-Diafragma o iris Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir cambios en la apertura y con dimetros variables cuya finalidad es la de obtener conos luminosos cada vez ms estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros diafragmas consistan en un disco de metal con agujeros de diferente dimetro, el cual se rotaba segn la necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo ms elaborado y con un diseo que le permite cambiar de dimetro. La apertura del diafragma se regula en relacin con el tipo de objetivo que se est utilizando. El diafragma o iris est pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminacin del objeto. (11, 70, 71). (fig. 4-11). Figura 4-12.-Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el esquema. La lmpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S del filamento de la lmpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que su punto focal est en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es proyectada en el plano de la preparacin por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio (72). 4.5.4.-Iluminacin Khler La iluminacin es una variable crtica que hay que considerar al poner en funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminacin, an en equipos sofisticados, conduce a la obtencin de imgenes defectuosas. El espcimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede producir artificios en la imagen que se observa. En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de iluminacin para optimizar la observacin microscpica y la microfotografa (15), que permite aprovechar al mximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo dimetro sea igual al del rea de captura del objetivo. Los microscopios modernos estn diseados para aplicar la iluminacin Khler y los requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13): Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz. Bombilla con lente colectora. Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lmpara y un diafragma de apertura, colocado debajo del condensador. El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen ntida del diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue cundo el condensador se encuentra lo ms cerca de la preparacin. El diafragma de campo regula el dimetro de la apertura de la iluminacin y al cerrarlo se incrementan los contrastes (15). Una vez ajustada la iluminacin Khler no se debe regular la intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lmpara mediante un ajuste de voltaje. 4.6.-Formacin de la imagen en el microscopio compuesto Figura 4-14. Las lneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ngulo, el cual es dos veces ms grande que el ngulo de las lneas O-W. De igual manera, la distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La flecha en AR aparece dos veces ms grande que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Con la finalidad de facilitar la comprensin de la propiedad de aumento que tienen las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos minsculos, es necesario conocer algunos aspectos del fenmeno de la visin. El ojo humano est constituido de tal manera que slo puede tener una visin clara cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o ligeramente divergentes, debido a que la retina requiere la participacin del cristalino para enfocar los rayos en su superficie. El lmite para visin cercana es la mnima distancia a la cual se puede observar claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6 y 10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor considerado normal es de 25 cm. El tamao aparente de un objeto depende del ngulo formado por dos lneas proyectadas desde el centro del ojo a las extremidades de dicho objeto (fig. 4-14) Este ngulo as formado se conoce como ngulo de visin o ngulo visual (73). La utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste en la reduccin de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de manera que puedan entrar al ojo en un estado de moderada divergencia, como si emanaran de un objeto situado ms all del lmite de visin cercana y en consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 4-15). Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una flecha pequea (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son an tan divergentes que no permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para formar lneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si ste est a su vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73). Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha (objeto) ms grande, aparentemente situada en el lmite de visin cercana del observador (aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamao entre la flecha real y la flecha imaginaria estar determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen formada no es real, no puede ser proyectada en una pantalla o recogida en una placa fotogrfica; es una imagen mental. Por esta razn la imagen se denomina virtual y la distancia desde la lente hasta la imagen formada se denomina distancia focal virtual (74,75). Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ngulo de visin y en consecuencia el objeto se ver ms grande (fig. 4-16) Figura 4-16. Sin la lente colocada en fg el ojo ver la flecha con el ngulo formado por las lneas punteadas b y c, formando la imagen bc. Los rayos bf y cg emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en direccin f y g, los cuales crean un ngulo visual mayor que hace que la fecha se vea ms grande (d-e). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73). Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitir comprender el principio del microscopio compuesto, denominado as, en oposicin a la lupa (microscopio simple) en base a que est conformado por dos sistemas de lentes, los cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje ptico. El primer sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo, posee una distancia focal muy corta y es posible colocar el objeto un poco ms all de su punto focal para obtener una imagen real, invertida y aumentada. El sistema de lentes a travs del cual el observador examina se denomina ocular y funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo. La distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal (11). El aumento del microscopio depender en principio de la longitud focal del objetivo. Mientras ms pequea sea esta longitud y el objeto se acerque al objetivo, ms grande ser la imagen real. El aumento tambin depende de la distancia focal del ocular y mientras ms corta sea esta, mayor ser el aumento (fig. 4-17). Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos emanados del espcimen en estudio y su paso a travs de las lentes objetivo y ocular para la formacin de las imgenes. La flecha ab corresponde al espcimen, que est colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real, aumentada e invertida en ab. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ) de la lente ocular. El ojo del observador percibir a travs del ocular la imagen virtual, aumentada y derecha ab de la imagen real ab. Modificado de Langueron M. Prcis de Microscopie ( 4.7.-Accesorios del microscopio Habindose familiarizado con la estructura y funcionamiento del microscopio compuesto, hay que considerar aquellos accesorios que conducen a una excelente prctica microscpica y que facilitan el trabajo, hacindolo ms rpido y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento. Dentro de las actividades o posibilidades se pueden citar:
Medir y cuantificar: Consiste en la micrometra (morfometra) aproximada de los especmenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades (conteo de clulas, ncleos, partculas), ngulos. Se emplean oculares de medicin con retculos o gradillas en combinacin con micrmetros especializados, lminas calibradas, cmaras de conteo y el vernier. En la actualidad se han desarrollado instrumentos para morfometra que emplean tecnologa digital y los datos obtenidos pueden ser transmitidos a un computador, permitiendo as la automatizacin, el almacenamiento de los datos y la obtencin de variables estadsticas a partir de ellos. Dibujar: Dibujar las preparaciones microscpicas es una actividad de las ms completas y precisas que permite obtener una representacin fiel del espcimen en estudio tal y como el observador la percibe y representa la suma de detalles que se observan al cambiar el plano de enfoque, obtenindose la sensacin de relieve y profundidad. Se emplean las cmaras claras y otros dispositivos para dibujar que estn concebidos con una serie de espejos y prismas que hacen coincidir en la retina o en una pantalla tanto el campo observado como el plano en el cual se debe dibujar. Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la imagen observada al mismo tiempo que se dibuja con un lpiz. Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es mediante la microfotografa. Las imgenes obtenidas se archivan y se emplean en publicaciones cientficas y presentaciones con fines docentes y banco de datos. Se necesitan adaptadores para conectar la cmara a un tubo semejante al tubo del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean desde las cmaras fotogrficas clsicas hasta las cmaras digitales especializadas para acoplar al microscopio y las cmaras fotogrficas digitales de uso comn. Actualmente la fotografa clsica resulta complicada, costosa, de resultados menos atractivos y ha sido desplazada por la fotografa digital que es de ms fcil y prctica ejecucin. Con las cmaras digitales de alta resolucin se obtienen resultados muy satisfactorios e inmediatos que pueden ser archivados en el computador para su posterior anlisis y procesamiento. Filmar: La captura de imgenes en movimiento se realiza mediante cmaras de video (digitales o no) que registran la actividad de especmenes vivos, clulas en cultivo, cmaras de perfusin, dispositivos con motor y automatizados, entre otros, para la demostracin y anlisis de procesos fisiolgicos en videomicroscopa. Incrementar el contraste: Para facilitar la observacin de especmenes con una estructura particular y clulas vivas se emplean filtros, condensadores y otros dispositivos que transforman al microscopio de campo claro en un instrumento para tal fin, logrndose la microscopia fotnica especial (campo oscuro, contraste de fases, polarizacin, entre otras). Procesamiento de imgenes: Con el empleo del computador y de software especializados para captura, administracin y procesamiento de las microfotografas, en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles en facilidad de uso y sofisticacin que simplifican la investigacin cientfica (76, 77) http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_8.htm http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO NOWEB/capitulo3_4.htm
El Microscopio Ha Sido Una Herramienta Fundamental en Investigación, Especialmente en Disciplinas Relacionadas Con La Medicina y La Biología, Como Lo Son Microbiología, Histología y Citología