Dra.

Marian Ulrich
En 1963 Bumhametal. (1) publicaron
el primer artculo sobre la aplicacin de
Inmunofluorescencia directa al estudio
de lesiones de lupus eritematoso (LE) y
otras enfermedades dermatolgicas. A
partir de esa fecha, la deteccin de anti-
cuerpos, antgenos, inmunocomplejos,
componentes del sistema de comple-
mento y otras sustancias mediante el
procedimiento de inmunofluorescencia
(IF) ha sido de gran utilidad en estudios
histopatolgicos en dermatologa (2-5).
La unin qumica de fluorescefna
isotiocianato, rodamina u otros fluoro-
cromos con anticuerpos no altera su
capacidad de combinarse con los ant-
genos. El uso de estos conjugados,
usualmente fluoresceinados, propor-
ciona una tcnica de alta sensibilidad,
comparable a las reacciones que utili-
zan anticuerpos conjugados con enzi-
mas o radioistopos. La IF directa,
realizada sobre cortes de tejido, posee
la gran ventaja de permitir precisar la
localizacin de la reaccin in situ.
La inmunofluorescencia ha sido de
importancia en la dermatolog a por varias
razones. El procedimiento proporciona
criterios de gran precisin para estable-
cerel diagnstico diferencial de las enfer-
medad~s ampollares, complementarios
a las observaciones clnicas y los estu-
dios histopatolgicos de rutina. En algu-
nas enfermedades ampollares, la titula-
cin de anticuerpos en muestras seria-
das, mediante IF indirecta, permite la
evaluacin de la actividad clnica y el
seguimiento de la respuesta teraputica.
La evaluacin de piel lesionada y piel
aparentemente sana contribuye a la cla-
sificacin y pronstico del LE en todas
sus manifestaciones, tanto localizadas
como sistmicas.
Los procedimientos de IF ms utiliza-
dos incluyen una tincin directa, en la
cual se incuban cortes de tejido lesiona-
do, peri-Iesional o aparentemente sano
con diversos anticuerpos fluoresceina-
dos para detectar la presencia de diver-
sos isotipos de inmunoglobulinas, com-
plemento y otras sustancias in situ. En el
procedimiento indirecto, se aplica el sue-
ro del paciente a cortes de un tejido
normal apropiado en el primer paso y
luego se incuban las preparaciones con
el anticuerpo fluoresceinado, para detec-
tar la presencia de anticuerpos en el
suero.
Cada uno de estos procedimientos
posee ventajas y desventajas. La gran
89 -
lnmunojluorescencia en Enfermedades de la Piel
ventaja del mtodo directo es que permi-
te la deteccin in situ de los reactantes,
pero la reaccin no es cuantitativa; la
toma de una biopsia, por pequea que
sea, es algo invasiva; se pueden presen-
tar reacciones falso-positivas por razo-
nes tcnicas u otros factores (por ejem-
plo, la toma de muestras de piel expuesta
al sol).
La inmunofluorescencia indirecta
con el suero del paciente permite reali-
zar estudios cuantitativos y no requiere
la toma de biopsias ni las precauciones
especiales necesarias para la conserva-
cin de las mismas. La desventaja prin-
cipal es la necesidad de utilizar sustratos
o tejidos especiales para obtener resul-
tados ptimos, por ejemplo, labio de
cobayo, esfago de conejo o de mono
u otros muy poco accesibles para la
gran mayora de los laboratorios.
Adicionalmente, puede haber depsitos
de inmunoglobulinas u otros inmuno-
reactantes en la piel en la ausencia de
niveles detectables de anticuerpos
s ricos (por ejemplo, algunos casos de
LE discoideo crnico) o anticuerpos
que no reaccionan directamente con
componentes de la piel (dermatitis her-
petiforme, DH).
Tcnica de la
inmunojluorescencia directa
En nuestro laboratorio, se utiliza el
procedimiento descrito a continuacin:
Biopsias tomadas con un punch de :t 4
m m o con bistur, son llevadas de inme-
diato al laboratorio. La escogencia del
sitio para la toma de la biopsia es de
gran importancia en algunos casos;
por ejemplo la toma de piel sana no
expuesta al sol para la bsqueda de la
banda lpica o la, toma de piel sana
adyacente ms piel lesionada o piel
peri-Iesional en las enfermedades am-
pollares. En lo posible se toma la biop-
sia de lesiones relativamente n4evas.
Material tomado en otros centros a una
distancia de una o dos horas de trasla-
do es colocado sobre una gasa empa-
pada con solucin fisiolgica y trasla-
dado en un recipiente con hielo. Se ha
descrito un medio de transporte {6) que
permite preservar la biopsia a tempera-
tura ambiente durante varios das an-
tes de proceder a la congelacin. Se
cubre la biopsia con el compuesto
O.C.T. {Optimum Cutting Temperature
Compound; Miles Inc., Elkhart, India-
na, USA) despus de orientarla sobre
un fragmento de corcho, de manera
que salgan la dermis y epidermis en.los
cortes, y se congela a -202 C para su
procesamiento dentro de una semana.
Muchos autores recomiendan un con-
gelamiento rpido en nitrgeno lquido
y conservacin a -702 C para evitar el
deterioro de la muestra. Se hacen cor-
tes a 5 micras en el criostato y se secan
las lminas, que llevan cuatro o cinco
cortes, al aire durante una hora. Des-
pus de un lavado de 10 minutos, se
cubren los cortes con el antisuero
conjugado apropiado y se incuban en
cmara hmeda en la oscuridad duran-
te media hora a temper~tura ambiente.
Despus de un lavado final de 10 minu-
tos, se coloca una gota de glicerina-
solucin fisiolgica 111 VN y una lami-
nilla sobre el portaobjeto y se examinan
las preparaciones en un microscopio
con fuente de luz ultravioleta, a un
aumento de 160 y de 400 x.
Normalmente hacemos la evalua-
cin preliminar con un antisuero poliv'a-
!ente contra las inmunoglobulinas hI,J-
manas IgG, A y M, excepto en ls
90
lnmunojluorescencia el1
casos en los cuales se sospecha una
patologa caracterizada por la presen-
cia de un isotipo especfico de inmuno-
globulina, por ejemplo, la presencia de
anUcuerpos del isotipo IgA en dermati-
Us herpetiforme o en la prpura de
Henoch-Schonlein. La bsqueda del
componente C3 de complemento pue-
de ser muy til en el estudio de vascu-
litis y de otras dermatosis. Los trabajos
de investigacin requieren el uso de
una amplia gama de reactivos y proce-
dimientos, por ejemplo, la separacin
de la epidermis y dermis al nivel de la
lmina lcida mediante el uso de una
solucin salina hipertnica (7), pero
muchos centros carecen de los recur-
sos econmicos y de personal para
realizar exmenes exhaustivos. De to-
das maneras, exmenes relativamen-
te sencillos pueden ofrecer un servicio
complementario til en los estudios
dermato-hi stopatolgicos.
Tcnica de
inmunojluorescencia indirecta
La variedad de exmenes que em-
plean la inmunofluorescencia indirecta
es tan amplia que un resumen detalla-
do escaparCa de los propsitos de este
capCtulo. En nuestro instituto, el exa-
men para anticuerpos antinucleares,
r.ealizado sobre una impronta de hCga-
do de ratn, fijado con metanol, es
utilizado con mucha frecuencia tanto
para la evaluacin de los colagenosis
como para descartar un proceso de
patologa sistmica autoinmune de
base en alopecia, vitiligo, urticaria cr-
nica o prpura. Se har referencia a los
hallazgos ms importantes de IF indi-
recta en las enfermedades descritas
abajo.
9}
Enfermedades de fa Piel
Enfermedades dermatolgicas
con patrones caractersticos de
innumojluorescencia
Enfernledades ampollares
Pnftgo vulgary pnfigo super-
ficial (foliceo y eritematoso) (ver
foto NQ 12 en el Anexo). Casi e1100%
de estas formas clnicas de pnfigo
presenta IF intercelular en la epider-
mis, en un patrn caracterstico de
red o "panal de abeja", al utilizar con-
jugados contra inmunoglobulina G
(lgG) o el componente 3 del sistema
de complemento (C3). Muchas veces
se observa una sola capa de clulas
rodeadas con fluorescencia adheren-
tes a la membrana basal en lesiones
nuevas de pnfigo vulgar, pero en
lesiones ms viejas se pueden obser-
varvarias capas de clulas. La fluores-
cencia en piel sana peri-Iesional de-
muestra el mismo patrn, muchas
veces con una definicin mejor porque
el tejido no ha sufrido las alteraciones
propias de las ampollas, incluyendo
desprendimiento total de la epidermis
superior.
Adicionalmente, se observa un pre-
cipitado granular en la unin dermo-
epidrmica en la mayora de los ca-
sos de pnfigo eritematoso, variante
que demuestra algunas caractersti-
cas similares a LE.
El patrn de IF observado en
pruebas indirectas con suero sobre
sustratos adecuados es idntico a
lo descrito arriba y concuerda con
una patognesis autoinmune dirigi-
da contra antgenos intercelulares
de la epidermis. La prueba indirecta
con suero demuestra buena corre-
lacin entre los niveles de anticuer-
lnmunojluorescencia en Enfermedades de fa Piel
pos, la actividad clnica y la res.
puesta teraputica.
Penfigoide ampo llar. La IF
aplicada a lesiones ampollares y
piel sana peri-Iesional en penfigoide
ampollardemuestra un patrn lineal
y continuo en la unin dermoepidr-
mica (ude) con anti-IgG y anti-C3 en
casi e1100% de los casos. La prue-
ba de IF indirecta con suero de-
muestra el mismo patrn y concuer-
da con la evidencia de una reaccin
autoinmune contra antgenos en la
lmina lcida en esta enfermedad.
Normalmente los anticuerpos de-
tectados pertenecen a la clase IgG,
pero casos de penfigoide ampollar
con depsitos lineales de IgA en la
ude han sido descritos; algunos au-
tores describen esta entidad como
dermatosis ampollar por IgA lineal.
La fluorescencia lineal tambin es
observada en pacientes con herpes
gestationis (banda de C3 ms fre-
cuente que la IgG), y en epidermo-
lisis ampollar adquirida (ver foto NQ
13 en el Anexo).
Dermatitis herpetiforme. En
esencialmente todos los casos de
dermatitis herpetiforme se observa
un precipitado granular fluorescente
en la ude de piel peri-Iesonal, en el
cual predomina la IgA. La fiuorescen-
ca granular frecuentemente forma
una banda continua, pero con mayor
intensidad en laspuntasdelaspapilas
drmicas. Las pruebas indirectas con
sueros son negativas para antcuer-
pos que reaccionan con componen-
tes en la ude (ver foto NQ 14 en el
Anexo).
Enfermedades del tejido
92
conectivo
Lupus eritematoso. Noventa
por ciento o ms de las lesiones de
lupus eritematoso sistmico (LES)
y LE discoideo crnico (LEDC) pre-
sentan una banda continua o
discontinua de fluorescencia granu-
lar en la ude. Se observa el mismo
patrn en las lesiones ampollares
de lupus. En algunos casos se ob-
serva fluorescencia sobre los n-
cleos de la epidermis; igualmente
se pueden observar depsitos gra-
nulares al nivel de los vasos sangu-
neos. Pruebas indirectas con suero
demuestran IF sobre los ncleos de
la epidermis en los casos con nive-
les significativos de anticuerpos an-
tinucleares. Por lo tanto, la IF obser-
vada en la ude no refleja una reac-
cin autoinmune contra antgenos
presentes en la ude; ms bien, in-
munocomplejos circulantes se acu-
mulan en la ude debido a la presin
hidrosttica al nivel de los vasos
capilares cutneos. Normalmente
los anticuerpos predominantes per-
tenecen a la clase IgG (ver foto NQ
15 en el Anexo).
Se observa el patrn granular de
fluorescencia en la piel sana, no
expuesta al sol, en aproximadamen-
te e150% de los casos de LES. Este
hallazgo recibe el nombre de la prue-
ba para la banda lpica ("Iupus band
test"). La positividad de esta re.ac-
cin en piel sana ha sido asociada
con una frecuencia mayor de nefro.
pata y otros hallazgos que contribu-
yen a un pronstico peoren la enfer-
medad. La piel clnicamente sana
en LEDC no presenta estos depsi-
tQs granulares de IF .
lnmunofluorescencia en Enfermedades de fa Piel
cuencia se ha observado un patrn
moteado, similar al patrn de IF
observado en pruebas indirectas.
Al1rjtis reumatoi{/ea (AR). Po-
cos estudios reportan depsitos in-
munofluorescentes en la piel de pa-
cientes con AR. Nuestra experiencia
es similar a lo observado en esclero-
dermia; hemos observado fluorescen-
cia sobre los ncleos de la epidermis
en algunos pacientes con ttulos ele-
vados de MN sricos, sin otros ha-
lIazgos importantes.
Recientemente se ha descrito un
patrn de IF distinto en LE subagudo,
caracterizado porlapresencia defluo-
rescencia granular o particulada en la
epidermis inferior y dermis superior
(8). Un patrn similar fue observado
en piel aparentemente sana, expues-
ta o no al sol, en los pacientes con LE
subagudo.
La presencia de depsitos de in-
munoglobulinas en la piel lesionada o
clnicamente sana de pacientes con
LE no es un criterio til para seguir la
respuesta teraputica en las diferen-
tes formas de esta enfermedad; di-
chos depsitos no muestran una bue-
na correlacin con la actividad cl nica,
y pueden persistirdurantemuchotiem-
po en pacientes que reciben este-
roides. Igualmente, las pruebas indi-
rectas para anticuerpos antinuclea-
res (AAN) demuestran una correla-
cin limitada con la actividad clnica y
la respuesta teraputica.
La literatura presenta discrepan-
cias con respecto a la presencia o
ausencia de depsitos de IF granular
en sndromes de LE inducidos por
medicamentos (por ejemplo, hidra-
lazina o procainamida). En todo
caso, los depsitos no persisten por
mucho tiempo despus de la elimi-
nacin del medicamento.
Esclerodermia y mor/ea. La
mayora de los autores reportan IF
negativa en la piel lesionada y sana
de personas con esclerodermia. En
nuestra experiencia, hemos obser-
vado IF sobre los ncleos de la
epidermis en un 25% de los pacien-
tes con esclerodermia, reflejo de la
presencia de AAN. Con cierta fre-
Otras enfermedades
Vasculitis. La nica forma de
vasculitis cutnea que demuestra
IF en un alto porcentaje de las
biopsias examinadas en nuestro la-
boratorio ha sido la prpura de
Henoch-Schonlein. El hallazgo ms
frecuente en esta enfermedad es un
depsito granular de IgA en los va-
sos cutneos. La presencia de
inmunoglobulinas y componentes de
complemento ha sido reportada con
frecuencia en lesiones nuevas de
vasculitis leucocitoclstica; la toma
de la muestra en el momento opor-
tuno (con menos de 24 horas de
evolucin) y la utilizacin de varios
conjugados indudablemente influ-
yen en el xito en demostrar
inmunocomplejos en los procesos
de vasculitis.
Para finalizar este captulo, la Ta-
bla I presenta un resumen de los
hallazgos de IF ms importantes en
enfermedades con compromiso cut-
neo.
(/~
lnmunofluorescencia en Enfermedades de la Piel
Tabla
lnmunojluorescencia directa en enfermedades dermatolgicas
Enfermedad Patrn y otras caractersticas
Enfermedades ampollares
Pnfigo vulgar y superficial
Penfigode ampollar
Herpes gestations
Epidermolisls ampollar adquirida
Dermatitis herpetiforme
IF intercelular en la epidennis; IgG
yC3.
Banda lineal en la ude; IgG y C3.
Banda lineal en la ude; C3 ms
frecuente que IgG.
Banda lineal en la ude; IgG y C3.
Banda granular en la ude; IgA.
Enfermedades del tejido conectivo
LES
LEDC
LE subagudo
Esclerodermia, morfea, artritis reumatoidea
Vasculitis
Banda de IF granular en la ude;
IgG, C3. Positiva en :t 50% de las
biopsias de piel sana.
IF granular en la ude; negativa en
piel sana.
IF granular en la ude y clulas de
la epidennis
IF sobre los ncleos de la epider-
mis en algunos casos
IF granular en vasos cutneos en
algunos casos; IgA en prpura de
Henoch-Schonlein.
Od
lnmunofluorescencia en Enfermedades de fa Piel
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