pewarnaan gram

1.1 Pengertian dan Tujuan Pewarnaan

Salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan
untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Telah dikembangkan prosedur-prosedur pewarnaan untuk :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar.
2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa.
(Pelczar dan Chan, 1986).

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung
(bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari
pewarnaan tersebut ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada
akan dapat diketahui.
(Suriawiria, 1995)
Pewarna (stain) merupakan garam-garam yang tersusun atas ion positif dan negatif, yang
salah satunya berwarna dan disebut kromosfor (chromosphore). Bila kromosfor berada pada ion
positif disebut pewarna basa (basic dye) dan bila kromosfor berada pada ion negatif disebut sebagai
pewarna asam (acidic dye) (Pratiwi, 2008).
1.2 Macam dan Fungsi Pewarnaan

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain),
pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain). Pada pewarnaan
sedarhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh sel
mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terlihat (Pratiwi, 2008).

Menurut Zubaidah (2006), yaitu banyak senyawa organik berwarna (zat pewarna) digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis. Telah dikembangkan prosedur-
prosedur pewarnaan untuk :
1. Mengamati dengan lebih baik tampang morfologi mikroorganisme secara kasar
2. Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme
3. Membantu mengidentifikasi dan membedakan organisme yang serupa.
Macam-macam pewarnaan adalah :
1. Pewarnaan sederhana : pemberian warna pada bakteri atau jasad-jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis atau olesan yang sudah difiksasi,
dinamakan pewarnaan sederhana.
2. Pewarnaan diferensial : prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel
mikroba disebut pewarnaan diferensial.
3. Pewarnaan gram : salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas
digunakan untuk bakteri ialah pewarnaan gram. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini
dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif
(Pelczar dan Chan, 1986).


1.3 Perbedaan Gram Positif dan Negatif, beserta contohnya
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metil ungu pada metode
pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci
dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Bakteri gram positif adalah bakteri yang
mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan
berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah
atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel (Annisa, 2010).

Perbedaan warna antara bakteri gram positif dan bakteri gram negatif disebabkan oleh
adanya perbedaan struktur dan dinding selnya. Dinding bakteri gran positif banyak mengandung
peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida
(Pratiwi, 2008).

Menurut Pelczar dan Chan (1986), perbedaan bakteri gram positif dan gram nehatif adalah :

Gram Positif Gram Negatif
Ungu kristal Sel berwarna ungu Sel berwarna ungu
Larutan Iodium
Kompleks UK-Y
terbentuk di dalam sel,
sel tetap berwarna
ungu
Kompleks UK-Y
terbentuk di dalam sel,
sel tetap berwarna
ungu
Alkohol
Dinding sel mengalami
dehidrasi, pori-pori
menciut, daya rembes
dinding sel dan
membran menurun,
UK-Y tak dapat keluar
dari sel, sel tetap ungu
Lipid terekstrasi dari
dinding sel, pori-pori
mengembang,
kompleks UK-Y keluar
dari sel, sel menjadi
tak berwarna
Safranin
Sel tak terpengaruhi,
tetap ungu
Sel menyerap zat
pewarna ini, menjadi
merah




1.4 Mekanisme Penyerapan Zat Warna oleh Gram Positif dan Gram Negatif

Reaksi gram dapat dikonfirmasi dengan uji kelarutan kalium hidroksida (kori). Ambillah satu
OSE penuh kultur bakteri yang sedang tumbuh aktif dan campur dengan setetes larutan KOH 3% di
atas kaca objek yang bersih dan aduk hingga diperoleh suspensi yang rata. Angkat OSE beberapa
centimeter dari kaca objek. Jika benang lendir bakteri itu terangkat oleh OSE(kira-kira 5-20 mm
panjangnya), maka bakteri itu adalah gram negatif. Jika dihasilkan suspensi berair dan tidak tampak
adanya benang lendir setelah OSE digerakkan berulang-ulang maka kultur bakteri itu adalah gram
positif. Perusakan dinding sel organisme gram negatif yang diikuti dengan pembebasan DNA, yang
sangat kental di dalam air, menghasilkan benang lendir. Dinding sel bakteri gram positif lebih tahan
terhadap KOH dan tetap melekat sehingga tidak ada DNA yang dibebaskan (Soekirno, 2008).

Pada pewarnaan gram ini, bakteri yang telah di fiksasi dengan panas sehingga membentuk
pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai
seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer (primary stain). Selanjutnya mordant
(penajam). Setelah iodin dicuci dengan baik, bakteri gram positif maupun gram negatif tampak
berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing
agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri twertentu dapat menghilangkan warna
ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang
merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke
dalam gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam gram negatif
(Pratiwi, 2008).

Mikroorganisme gram positif adalah mikroorganisme yang berwarna violet dimanan warna
tersebut tidak hilang jika mikroorganisme disiram dengan aseton atau alkohol. Sedangkan
mikroorganisme gram negatif adalah mikroorganisme yang akan kehilangan warna violetnya jika
mikroorganisme tersebut disiram dengan aseton atau alkohol dan kemudian akan berwarna merah
muda dengan carbol fuchsin atau merah netral (Gibson, 1996).