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13-3-2014

Extracción de ADN plasmídico por el
método de lisis alcalina (Sambrock) e
identificación de corte con enzimas de
restricción en E. coli

Jaral H.D.M., Landin A.M.A., Ramírez C.M., Soto A.C.A





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Dr. Gabriela Medina Ramos
BIOINGENIERÍA

Universidad Politécnica de Guanajuato
Departamento de Ingeniería Agroindustrial, Av. Universidad, localidad Juan Alonso
s/n, (38483), Cortázar, Guanajuato, México.
Jaral H.D.M., Landin A.M.A., Ramírez C.M., Soto A.C.A.

PRACTICA 1: Extracción de ADN plasmídico por el método de lisis
alcalina (Sambrock) e identificación de corte con enzimas de
restricción en E. coli.

OBJETIVO
Extraer ADN plasmídico por el método Sambrock, realizar digestión de ADN con enzimas
de restricción EcoRI y aplicar electroforesis horizontal en geles de agarosa.
RESUMEN
En la Universidad Politécnica de Guanajuato se realizó extracción de ADN bacteriano por
él método de lisis alcalina (Sambrock). Se llevó acabo un corte con enzimas de restricción
y posteriormente se realizó una electroforesis.
INTRODUCCIÓN
El ADN es una estructura química cuyos elementos fundamentales (nucleótidos) se
organizan de manera lineal generando enormes secuencias de información genética de
los seres vivos. El ADN puro se le puede dar diferentes usos, puede ser utilizado para
investigación, para detección de rasgos de interés como resistencia a enfermedades o
virus, la secuenciación y clonación de ADN, la conservación de la biodiversidad, etc.
Existen distintos métodos para la extracción y secuenciación de ADN algunos de ellos son
extracción de ADN de suspensiones bacterianas, corte con enzimas de restricción y
electroforesis (Coll, 2014).
E. coli
Existe una variedad de E. coli, denominada 0157:H7, causa una diarrea hemorrágica, y a
veces puede provocar insuficiencia renal e incluso la muerte, especialmente en niños y en
adultos con sistemas inmunológicos debilitados. En 1982 se identificó el primer brote de
E. coli O157:H7 por comer carne de hamburguesas contaminadas con la bacteria. Desde
entonces, las epidemias de E. coli O157:H7 han sido asociadas con otros tipos de
alimentos (Sanz, 2014).
Extracción de ADN en suspensiones bacterianas
De todas las muestras biológicas que podemos someter a un proceso de extracción de
ADN, las suspensiones bacterianas, son quizás las que ofrecen menos problemas por la
homogeneidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones densas de bacterias
gramnegativas pueden liberar cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves
como pueden ser una simple ebullición, congelación o una combinación de ambas (frezze
& thaw) (Parque Cientifico de la Udg, 2009).
Corte con enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se
podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica.
Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que
reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia específica para cada
enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se
posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia (MEJÍA,
2009).
Electroforesis
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica
controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a
través de una matriz gelatinosa.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero
de composición homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 °C y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras
poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las
moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000
nucleótidos (M. Somma, 2008).
MATERIALES Y MÉTODOS
Se inoculo una colonia de E. coli y se tomaron 2ml y se incubo toda la noche a 37ºC.
Una vez realizada la incubación se pasó a tubos eppendorf y se centrifugo por 5 minutos
a 8000 rpm (figura 1) y se eliminó el sobrenadante del medio LB.

Figura 1. Centrifuga

Soluciones
Solución 1 Glucosa -50mM Tris pH 8.0 -25nM EDTA pH 8.0 -10mM
Solución 2 NaOH 0.2N SDS 1%
Solución 3 Acetato de potasio 3M pH 5.2
Tabla 1. Preparación de soluciones
Se resuspendio el pellet celular con 100 µl de solución 1 y se homogenizo con vortex por
60 segundos, se mantuvo por 10 minutos a 4ºC (Figura 2).

Figura 2. Homogenizador Vortex
Se adiciono 200 µl de solución 2, se resuspendio y se homogenizo en el vortex por 60
segundos mantenerlos por 10 minutos a 4ºC.
Posteriormente se adiciono 150 µl de solución 3 y se homogenizo con vortex mantenerlos
por 10 minutos a 4ºC. Enseguida se centrifugo a 10 000 rpm durante 10 minutos a 4ºC, se
recato el sobrenadante y se adiciono 1 µl de ARNasa, se incubo por 30 min a 37ºC
(Figura 3).

Figura 3. Incubadora
Lavados
El primer lavado se realizó con fenol relación v/v vertiendo 240 µl de fenol en 240 µl de la
muestra, se mezcló con vortex y se centrifugo a 10 000 rpm por 5 minutos, recuperando la
fase superior en un tubo eppendorf limpio obteniendo un volumen 480 µl
El segundo lavado fue con solución fenol-cloroformo relación v/v se mezcló y centrifugo a
10 000 rpm por 5 minutos (figura 4) recuperando la fase superior en un tubo eppendorf
limpio.

Figura 4. Segundo lavado
En el último lavado fue cloroformo en una relación v/v se mezcló y centrifugo a 10 000
rpm por 5 minutos recuperando la fase superior en un tubo eppendorf limpio
Al sobrenadante rescatado se le adiciono 2.5 v de etanol absoluto (-20ºC) adicionando
300 µl de sobrenadante y 500 µl de etanol y se almacenándolo 1 hra a (-20ºC) en el
freezer (Figura 5).

Figura 5. Freezer a -20°C
Después de haber pasado el almacenamiento se centrifuga a 13 000 rpm por 15 minutos
descartando el sobrenadante.
El precipitado fue resuspendido en etanol al 70% en concentración del precipitado de 1 v
y se almaceno por 24 gras en freezer. Al día siguiente se centrifugo a 13 000 rpm por 15
minutos y se descartó el sobrenadante.
La pastilla que quedó en el tubo se dejó secar y se
resuspendio en agua destilada estéril (Figura 6).






Enzimas de restricción
En un tubo eppendorf nuevo se añadió:
 5 µl de ADN
 1.5 µl de buffer 3 10
x

 8 µl de agua estéril
 0.5 µl de enzima EcoRI

La muestra obtenida se incubo 2 horas a 37ºC.
Una vez obtenidas las muestras de ADN completo y ADN digerido con la enzima de
restricción se procedió a la elaboración del gel de agarosa en concentración al 1% para la
técnica de electroforesis.
Electroforesis
Se preparó 200ml de agarosa al 1% disuelta en solución TAE 1X se dejó fundir en un
microondas, después se enfrió hasta que la piel soporte la temperatura (aproximadamente
a 40°C), obteniendo una apariencia cristalina. En una base de acrílico se colocó un peine
de dientes que sirven para formar los carriles, se vertió una pequeña cantidad de agarosa
liquida para formar una película (tipo gel) de no más de 1 cm de altura.
Se programó el equipo de electroforesis a 80v, introduciendo el gel en la cámara donde
fue inundada por TAE 1X que tiene la función de conducir corriente para que puedan
migrar los fragmentos de ADN.
En el primer carril se puso 10 µl de marcador peso molecular (1kb), en el siguientes
carriles se colocaron mezclas de 4µl de buffer de carga Orange G 6x con 10 µl de
muestra, siendo la primer muestra para el segundo pozo el ADN bacteriano y la segunda
mezcla para el tercer pozo fue la muestra de ADN cortada por la EcoRI y la tercer muestra
en el cuarto pozo una segunda muestra de ADN cortada por la EcoRI.
Carriles Indicadores
Carril 1 Marcador 1kb
Figura 6. Pastilla puesta a secar





Una vez colocadas las muestras en los carriles, se puso en funcionamiento el equipo de
electroforesis por un tiempo de 1 hora 20 minutos.

Figura 7. Equipo de electroforesis
Procedente a ello se recuperó el gel y se analizó en un foto-documentador en el cual es
expuesto a radiaciones UV para facilitar la visualización de los fragmentos de ADN y
apoyado de un software analizar dichos fragmentos.

RESULTADOS

Al termino de la electroforesis el gel se colocó en una solución para que se generara una
tinción y por medio de una cámara fue expuesto a radiaciones UV para facilitar la
visualización de los fragmentos de ADN y con la ayuda de un software se analizó dichos
fragmentos como se observa en la figura 8.

Figura 8. Electroforesis de bacteria. En el carril 1 (izquierdo) se muestra el marcador
molecular, en el carril 2, 3 y 4 siguente no se observa la presencia de ADN, indicando que
la prueba es negativa.
Carril 2 DNA plasmídico bacteria
Carril 3 Corte con EcoRI
Carril 4 Corte con EcoRI
Tabla 2. Orden de los carriles con su respectivo indicador

Carga (-)
Carga (+)

DISCUSIÓN
Deacuerdo a los resultados obtenidos se puede apreciar que la tecnica tiene su grado de
dificultad, por lo tanto si no es ejecutada adecudamente no se obtendran los resultados
esperados, ya que como se pudo observar en la electroforesis teniamos la presencia de
cristales de agarosa que no se fundieron bien al preparar el gel, al igual que al
resuspender el pellet, no fue en la cantidad adecuada de agua que eran 50 µl que
afectaron el resultado final. En comparación con el reporte de investigación del Perfil
plasmídico en aislados intrahospitalarios de Klebsiella spp el procedimiento se siguió de
manera puntual y el pellet a diferencia del nuestro, fue resuspendido en 15 µl agua que
confirman que la ausencia de ADN en la electroforesis pudo verse debido al exceso de
agua recomendada y la poca cantidad de material genético obtenido o a errores de
manipulación (MOREY, 2010) .

CONCLUSIÓN
La técnica empleada para la extracción de ADN no se manipulo de manera
adecuadamente como consecuencia no hubo presencia de ADN bacteriano en el análisis
electroforético.
Un punto crítico dentro de la metodología es la pureza del DNA ya que la reacción de
enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol,
cloroformo, etanol en altas concentraciones inhiben la digestión con enzimas de
restricción, otro aspecto es que no se obtuvo una cantidad significativa de ADN para ser
leída por el método de electroforesis, se sugiere la adición de cloranfenicol para amplificar
el número de copias de plásmidos y por tanto el rendimiento final.

BIBLIOGRAFÍA
Coll, V. B. (11 de marzo de 2014). Estructuras y Propiedades de los Ácidos nucleicos.
Obtenido de Estructuras y Propiedades de los Ácidos nucleicos:
www.uv.es/tunon/pdf_doc/AcidosNucleicos_veronica.pdf
M. Somma, M. Q. (2008). Electroforesis en Gel de Agarosa. Electroforesis en Gel de
Agarosa.
MEJÍA, L. Y. (Septiembre de 2009). INGENIERÍA GENÉTICA AGROPECUARIA. Enzimas
de restricción y secuencias de corte. Bogota, Colombia. Obtenido de Enzimas de
restricción y secuencias de corte .
MOREY, J. R. (2010). PERFIL PLASMÍDICO EN AISLADOS INTRAHOSPITALARIOS DE
Klebsiella spp. CUMANA.
Parque Cientifico de la Udg. (Enero-Febrero de 2009). La extracción y purificación del
ADN para el análisis por PCR.Mitos y realidades. Informaciones sobre Analisis
Microbiologicos por PCR, págs. 1-5.
Sanz, E. (11 de Marzo de 2014). Muy interesante ¿Qué es la bacteria E.Coli? . Obtenido
de Muy interesante ¿Qué es la bacteria E.Coli? :
http://www.muyinteresante.es/salud/preguntas-respuestas/ique-es-la-bacteria-ecoli