Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean como

fuente de energa, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos son los
nutrientes.
Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo, Cu y Zn.
REQUERIMIENTOS DE LOS MICROORGANISMOS
REQUERIMIENTOS ENERGTICOS
En funcin de la fuente de energa, los microorganismos se clasifican en :
Fottrofos
Quimitrofos: Oxidan compuestos qumicos.
REQUERIMIENTOS DE CARBONO
En funcin de la fuente de carbono, los microorganismos se clasifian en :
Auttrofos: CO2
Hetertrofos: Compuestos orgnicos carbonados.
Uniendo ambas clasificaciones, podemos clasificar los microorganismos en cuatro grupos:
Fotoauttrofos: Luz + CO2. Bacterias fotosintticas.
Fotohetertrofos: Algunas bacterias fotosintticas.
Quimioauttrofos o quimiolitotrofos: Descubiertos por Winogradsky, usan como fuente de energa
compuestos inorgnicos reducidos: NH4, NO2, H2, SH2, Fe++...
REQUERIMIENTOS DE NITRGENO
Los microorganismos son muy verstiles en cuanto a la forma de conseguir el N:
Algunos organismos son capaces de fijar nitrgeno atmosfrico (N2).
Otros lo toman en forma de NH4+.
Otros son capaces de usar NO3- o NO2- como fuente de amonio, reducindolo.
Algunos son capaces de utilizar aminocidos como fuente de nitrgeno.
REQUERIMIENTOS DE AZUFRE
El azufre forma parte de dos aminocidos; es esencial. Los microorganismos lo obtienen:
En forma S.
En forma de SO42-.
En forma orgnica (aminocidos)
REQUERIMIENTOS DE FSFORO
Los microorganismos lo toman a partir de fosfatos disueltos en el medio.
REQUERIMIENTO DE MACRO Y MICRONUTRIENTES
Los macronutrientes son requeridos por los microorganismos en concentraciones de entre 10-3 y
10-4 molar. Son Ca, Na, K y Mg . Son asimilados en forma de sales: MgSO4, CaCl2, etc.
Los micronutrientes (oligoelementos) son: Cu, Zn, Mo, Mn, Cr, Fe, etc. Y son necesarios en
concentraciones de 10-5 a 10-6 molar. Se aportan a los medios de cultivo aadiendo una solucin
de elementos traza.
REQUERIMIENTO DE FACTORES DE CRECIMIENTO
Los factores de crecimiento son componentes que los microorganismos utilizan como precursores
o constituyentes de su materia celular, y que pueden sintetizar a partir de formas de carbono ms
sencillas.
Son esenciales y deben ser aadidos como nutrientes en funcin del microorganismo que
cultivemos:
Aminocidos.
Bases pricas y pirimidnicas.
Vitaminas, que actan como coenzimas de distintos complejos enzimticos. Ej. B2 (riboflavina) es
esencial para la sntesis de FAD.
La necesidad de un factor de crecimiento se denomina auxotrofa, y la prototrofa implica que un
microorganismo no requiere ningn factor de crecimiento para desarrollarse.
PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo pueden ser:
Lquidos
Slidos
Semislidos
MEDIOS LQUIDOS
Se preparan todos los constituyentes en una disolucin acuosa (agua destilada). Una vez disueltos,
se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor.
MEDIOS SLIDOS
Hacemos lo mismo que para los medios lquidos, pero, al disolver en agua destilada, aadimos de
15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas petri cuando est a unos 60.
Cuando alcance los 50, ya ser slido.
MEDIOS SEMISLIDOS
Su apariencia es de gel. Slo llevan 5 g/l de agar.
RELACIN DE LOS MICROORGANISMOS CON EL OXGENO
El oxgeno, como constituyente del agua, es esencial para todos los organismos. Sin embargo, el
oxgeno molecular es requerido de diferentes maneras por los microorganismos:
MICROORGANISMOS AEROBIOS
El oxgeno acta como aceptor final de electrones en la respiracin aerbica. Existen dos grupos
de organismos aerbicos:
Aerobios estrictos. Requieren oxgeno en concentraciones similares a la atmosfrica (20%)
Aerobios microaerfilos. Requieren oxgeno en concentraciones inferiores a las de la atmsfera; 5-
10%. Presentan enzimas como la hidrogenasa, que son activadas por las presiones parciales del
oxgeno. La hidrogenasa proporciona energa para crecer. En concentracin atmosfrica, la
hidrogenasa no se activa y la clula no crece y muere.
MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
Son aquellos organismos que no requieren oxgeno. Distinguimos entre:
Anaerobios facultativos. Crecen en ausencia y en presencia de oxgeno, pero crecen mejor con
oxgeno. En ausencia, realizan la fermentacin, y en presencia, la respiracin aerbia. Esta ltima
es mucho ms rentable, y por ello crecen mejor.
Anaerobios estrictos. Aquellos que, no solo no requieren oxgeno, sino que su presencia los
destruye. Su metabolismo no requiere oxgeno, o realizan fermentacin o respiracin anaerobia.
Anaerobios aerotolerantes. Aquellos que no requieren oxgeno pero lo toleran; no mueren en su
presencia. Son microorganismos fermentativos, y se diferencian de los facultativos en que no
crecen ms con oxgeno.
CULTIVO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS ESTRICTOS
En placas petri sobre medios slidos. La superficie del medio de cultivo est en contacto con el
oxgeno atmosfrico, luego no hay ningn problema para cultivar este tipo de microorganismos.
En medio lquido, el microorganismo crece en la disolucin, donde la concentracin de oxgeno es
menor, y disminuye en funcin del crecimiento del microorganismo. Para evitar esa disminucin
de oxgeno, utilizamos dos recursos:
Agitacin
Adicin de aire u O2 estril mediante burbujeo
CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS ESTRICTOS
En medio lquido, aadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el
agua y forman H2o. Estos agentes son cistena o tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es
bombeando CO2 o N2 libre de 02 al medio, mediante burbujeo.
En medio slido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas-Pak. Su tamao es similar al de
un termo. En su interior se colocan las placas petri invertidas. El recipiente se cierra con una tapa
hermtica. En la parte inferior hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis,
introducimos sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al aadir agua
al sobre, se libera H2 y CO2. El oxgeno presente se reduce a agua. Para verificar la anaerobiosis
hay un indicador, que consiste en una tira de papel impregnada con azul de metileno. En
condiciones aerbicas, la tira es azul, pero sino, es transparente. En la tapa hay un manmetro con
el que medimos la presin interna, ya que se estn desprendiendo CO2 y H2.
MEDIOS DE CULTIVO
En funcin de su composicin, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:
Medios sintticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias
orgnicas e inorgnicas puras disueltas en agua destilada.
Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composicin
indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura,
bovril... La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por
lo que podemos cultivar en l gran nmero de microorganismos. El inconveniente es que no
conocemos lo que el microorganismo est consumiendo. Ejemplos:
Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua
Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS ENRIQUECIDOS
Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo normales. Para
cultivarlos necesitamos aadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos de
tejidos animales... Estos medios son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en
ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos. Ejemplo: agar-sangre.
MEDIOS SELECTIVOS
Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de
microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram +. Otra manera es
modificar la fuente de carbono; si sustitumos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos
microorganismos capaces de digerirla.
MEDIOS DIFERENCIALES
Contienen distintos compuestos qumicos o indicadores sobre los que determinados
microorganismos adquiere coloraciones especficas o reaccionan de una manera determinada.
Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten
diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde
claro, mientras que enterobacter forma colonias de color rosa salmn.
MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES
Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares. Es un medio especfico para
enterobacterias. Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hace que slo se desarrollen
las gram - que puedan tolerar estas sales; las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es
rojo a pH cido e incoloro a pH bsico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa.
Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla, libera cidos,
por lo que se crea un medio cido y el indicador se pone rojo. Salmonella no tolera la lactosa, por
lo que no formar cidos y formar colonias incoloras.
CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIN
Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterognea o mixta. Cuando queremos
estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo.
Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos
cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola clula (son clones). Hay
diferentes mtodos para obtenerlas:
MTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRA
Necesitamos:
Placa petri con medio de cultivo
Muestra (slida o lquida)
Asa de siembra de platino
Con el asa estril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el
asa de siembra y extendemos parte de la extensin anterior en otra direccin. Volvemos a
esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensin en otra
direccin. Esterilizamos y repetimos la operacin.
Incubamos a 37 durante 24 horas y, en la primera zona, habr un amasijo de clulas. En la
segunda, parte de la primera zona estar mejor extendida, y en la tercera y en la 4 mejor an.
Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.
MTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS
Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas clulas que, tras inocularse en un medio
de cultivo, generen colonias aisladas. Metodologa:
Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo.
Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 C durante 24 horas.
En la primera dilucin habr un amasijo de colonias. En la siguiente habr diez veces menos
nmero de colonias, y as sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas.
Este mtodo nos permite calcular el nmero de microorganismos viables que existen en la
muestra que estamos analizando:
N=C 1/D 1/i donde:
N es el nmero de microorganismos presentes en la muestra
C es el nmero de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias)
D es la dilucin
I es el inculo
Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una
contaminacin) y, si hay ms, no estn aisladas.
TCNICA DEL CULTIVO POR ENRIQUECIMIENTO
Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa
aislar. Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias fotoauttrofas. Tomamos un matraz con agua y sales
y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoauttrofas.
Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolittrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como
fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoauttrofos.
Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37, mientras que para incubar
otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45.
CONSERVACIN DE CULTIVOS PUROS
ALMACENAMIENTO A TEMPERATURAS BAJAS
Ponemos las bacterias con glicerol al 20 - 50% a -70 y podemos mantenerlas as durante aos,
dcadas...
LIOFILIZACIN
Es un mtodo ms eficaz. En un vial de liofilizacin ponemos leche desnatada y las bacterias, lo
congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilizacin.
La liofilizacin es una evaporacin por condensacin. Se basa en el punto triple del agua; podemos
pasar de slido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias.
Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante dcadas.
COLECCIONES DE CULTIVO
En todos los pases hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos puros o
tipo. En Espaa existe la C.E.C.T (Coleccin espaola de cultivos tipo), que est en Valencia. La ms
grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).