1

As enzimas de restrio


A Engenharia Gentica possvel graas a um grupo especial de enzimas que cortam o
DNA. Estas enzimas so chamadas de enzimas de restrio ou endonucleases de
restrio. As enzimas de restrio so protenas produzidas por bactrias para prevenir
ou restringir a introduo de DNA exgeno. Elas atuam como tesouras de DNA
cortando-o e inativando-o.
As enzimas de restrio reconhecem e cortam stios especficos ao longo da molcula de
DNA, chamados stios de restrio. Cada enzima de restrio (e existem centenas,
produzidas por muitas bactrias diferentes) tem o seu prprio stio de ao. Em geral, um
stio de restrio uma seqncia palindrmica de 4 ou 6 pares de base. Um DNA
palindrmico uma seqncia na qual a fita lida no sentido 5 a 3 a mesma da fita
lida no sentido 5 a 3 . Por exemplo:


5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5


uma seqncia de DNA palindrmica. Para verificar isto, leia as seqncias das fitas
superior e inferior do final 5 para o final 3 . Esta seqncia tambm um stio de
restrio para a enzima chamada EcoRI. O nome EcoRI vem de uma bactria na qual ela
foi descoberta, Escherichia coli RY 13 (EcoR), e I porque esta foi a primeira enzima de
restrio encontrada neste organismo.
2
A EcoRI corta entre a G e a A em cada fita de DNA (veja abaixo). Assim que os cortes
so feitos, o DNA mantido unido pelas pontes de hidrognio entre as quatro bases do
meio. As pontes de hidrognio so frgeis, e ento o DNA se separa.


+
Stios de restrio: 5 GAATTC 3
3 CTTAAG 5
|
DNA cortado: 5 G AATTC 3
3 CTTAA G 5

A EcoRI no corta diretamente a molcula de DNA. Quando a EcoRI corta uma molcula
de DNA, h a formao de fitas simples como caudas nos finais novos. Este tipo de
final chamado de finais coesivos (sticky end) porque podem se unir facilmente a
outras fitas com finais complementares. Nem todas as enzimas de restrio formam finais
coesivos; algumas cortam as duas fitas de DNA diretamente, produzindo um final
abrupto (blunt end).
Quando os cientistas estudam uma molcula de DNA, uma das primeiras coisas a fazer
solucionar onde esto os stios de restrio. Ento, eles criam um mapa de restrio,
mostrando a localizao dos stios de clivagem para muitas enzimas diferentes. Estes
mapas so utilizados como mapas rodovirios para a molcula de DNA. A figura 1 mostra
um mapa de restrio de um plasmdio.





3












Figura 1. Mapa de restrio do plasmdio YIP5 (5541 pares de
base). O nmero aps cada nome de enzima de restrio indica
em qual par de base o DNA cortado pela enzima.
Abaixo esto demonstrados alguns stios de restrio de diferentes enzimas de restrio.
+ +
EcoRI: 5 GAATTC 3 HindIII: 5 AAGCTT 3
3 CTTAAG 5 3 TTCGAA 5
| |

+ +
BamHI: 5 GGATCC 3 AluI: 5 AGCT 3
3 CCTAGG 5 3 TCGA 5
| |

+ +
SmaI: 5 CCCGGG 3 HbaI: 5 GCGC 3
3 GGGCCC 5 3 CGCG 5
| |

ApaI (2035)
EagI (942)
SmaI (2540)
PvuII (3247)
PvuI (4916)
EcoRI (1/5541)
HindIII (32)
4
Quais destas enzimas formariam finais abruptos? Quais delas formariam finais coesivos?


Exerccio 1
Corte a faixa de papel com a seqncia de DNA ao longo de suas bordas. Esta faixa
representa uma molcula de DNA de fita dupla. Cada seqncia de letras representa a
cadeia fosfodister, e as linhas verticais entre os pares de base representam as pontes de
hidrognio entre as bases.
1. Voc vai simular a atividade da EcoRI. Verifique ao longo da seqncia do DNA 1 at
voc encontrar o stio da EcoRI (utilize a lista de enzimas dada como referncia).
Faa cortes atravs da cadeia fosfo-dister justamente entre a G e a A do stio de
restrio em ambas as fitas. No corte atravs de toda a faixa. Lembre-se que a
EcoRI corta a cadeia de cada fita de DNA separadamente.
2. Agora separe as pontes de hidrognio entre os stios de corte, cortando atravs das
linhas verticais. Separe os dois pedaos de DNA. Analise os finais produzidos pela
EcoRI. Eles so abruptos ou coesivos? Escreva EcoRI nos finais cortados.
Mantenha os fragmentos cortados em sua mesa.
3. Repita o procedimento com a faixa 2, desta vez simulando a atividade da SmaI.
Encontre o stio da SmaI e corte atravs do esqueleto fosfodister nos stios indicados
acima. H alguma ponte de hidrognio entre os stios de restrio? Os finais novos
so coesivos ou abruptos? Marque os novos finais com SmaI e mantenha os
fragmentos de DNA em sua mesa.
4. Simule a atividade da HindIII com a faixa 3. Estes finais so coesivos ou abruptos?
Marque os novos finais com HindIII e mantenha os fragmentos.
5. Repita o procedimento com a faixa 4, simulando a EcoRI novamente.
6. Pegue o fragmento de DNA inicial da faixa 4 (um fragmento) EcoRI e o
fragmento final da HindIII da faixa 3. Ambos os fragmentos tm caudas em
fita simples de 4 bases. Escreva as seqncias de bases das duas caudas e
5
identifique-as EcoRI e HindIII. Marque os finais 5 e 3 . As seqncias de bases
dos finais produzidos pela EcoRI e HindIII so complementares?
7. Tire o fragmento da HindIII e pegue o fragmento final da faixa 1 (cortado com EcoRI).
Compare os finais de fita simples do fragmento produzido pela EcoRI na faixa 1 com o
fragmento produzido pela EcoRI na faixa 4. Escreva as seqncias de bases das
caudas de fita simples e marque os finais 5 e 3 . Eles so complementares?
8. Imagine que voc cortou um fragmento de DNA completamente desconhecido com
EcoRI. Voc acha que os finais de fita simples destes fragmentos sero
complementares queles produzidos nas faixas 1 e 4?
9. Uma enzima chamada DNA ligase refaz as pontes fosfodister entre nucleotdeos.
Para a DNA ligase trabalhar, dois nucleotdeos devem se aproximar com a orientao
apropriada para a ponte (o final 5 de um deve estar prximo ao final 3 do outro).
Voc acha que seria mais fcil para a DNA ligase reconectar dois fragmentos
cortados pela EcoRI ou um fragmento cortado pela EcoRI com outro cortado pela
HindIII? Qual a sua explicao?

Exerccio 2
A figura 1 um mapa de restrio do plasmdio circular YIP5. Este plasmdio contm
5541 pares de bases. H um stio de restrio da EcoRI no par de base 1. As posies
dos outros stios de restrio esto demonstradas no mapa. Os nmeros aps o nome
das enzimas mostram em qual par de base a enzima cliva o DNA. Se voc digerir o YIP5
com EcoRI, voc vai obter um pedao de DNA com 5541 pares de bases.
10. Quais seriam os produtos de digesto com as enzimas EcoRI e EagI?
11. Quais seriam of produtos de digesto com as enzimas HindIII e ApaI?
12. Quais seriam of produtos de digesto com as enzimas HindIII, ApaI e PvuI?
13. Se voc pegar os produtos de digesto da questo 10 e digeri-los com PvuI, quais
seriam os produtos?
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1 1
5 - TAGACTGAATTCAAGTCA - 3

3 - ATCTGACTTAAGTTCAGT - 5


2 2
5 - ATACGCCCGGGTTCTAAA - 3

3 - TATGCGGGCCCAAGATTT - 5


3 3
5 - CAGGATCGAAGCTTATGC - 3

3 - GTCCTAGCTTCGAATACG - 5


4 4
5 - AATAGAATTCCGATCCGA - 3

3 - TTATCTTAAGGCTAGGCT - 5
7
DNA e Eletroforese

Voc j aprendeu sobre as enzimas de restrio e como elas clivam o DNA em
fragmentos. Voc tambm deve ter notado que, em alguns mapas de restrio, uma
enzima pode produzir muitos fragmentos de DNA. Para realizar a digesto com enzimas
de restrio, basta acrescentar ao DNA a enzima desejada e deixa-la agir num tempo e
temperatura apropriados. Antes de a reao comear, a mistura no tubo parece um fluido
claro. Ao trmino da reao, a mistura continua clara! Olhando apenas para o tubo,
como voc pode dizer que aconteceu alguma coisa?
Para verificar o produto de uma reao de digesto com enzimas de restrio, voc deve
ser capaz de visualizar os diferentes fragmentos produzidos. Existem corantes qumicos
que coram o DNA, mas obviamente no bom adicionar estes corantes mistura no
tubo. No laboratrio, os cientistas utilizam um processo chamado eletroforese em gel
para separar os fragmentos de DNA de modo que eles podem visualizar o resultado de
uma digesto (alm de outros procedimentos).
A eletroforese em gel utiliza a natureza qumica do DNA para separar os fragmentos. Sob
circunstncias normais, os grupos fosfato na cadeia do DNA so carregados
negativamente. Ento, as molculas de DNA so muito mais atradas pelo que
carregado positivamente. No gel de eletroforese, as molculas de DNA so colocadas em
um campo eltrico (o qual tem um plo positivo e um plo negativo) e vo migrar para o
plo positivo.
O campo eltrico faz com que as molculas de DNA se movam, mas para que elas se
separem e sejam distinguidas umas das outras, todo o processo ocorre em um gel (da
vem o nome eletroforese em gel). Para separar o DNA, so utilizados diferentes tipos de
gel. O gel mais freqentemente utilizado na eletroforese de DNA chamado de agarose
e se comporta como uma gelatina comestvel, porm sem acar e sem cor. Para fazer
um gel para DNA (ou para moldar um gel), voc deve dissolver a agarose em p em um
tampo fervente, colocar em um recipiente apropriado e deixar resfriar. Enquanto isto
esfria, solidifica.
8
Para aplicar o DNA no gel de agarose, utiliza-se um pente apropriado na agarose ainda
lquida e j disposta no recipiente. Quando a agarose se solidifica e o pente retirado,
permanece uma fila de pequenos orifcios no gel. As amostras de DNA so colocadas
nos poos antes do incio da eletroforese.
Para a eletroforese, todo o gel colocado em uma cuba de eletroforese com um tampo
(gua +sal). aplicada uma corrente eltrica, a qual vai fluir atravs do tampo e do gel.
Quando a corrente aplicada, as molculas de DNA comeam a migrar para o plo
positivo do campo eltrico (Figura 2).







+


Figura 2. Na eletroforese, o gel colocado em uma cuba com soluo salina e aplicada
uma corrente eltrica. O DNA carregado negativamente migra para o plo positivo.

Todo o DNA migra para o plo positivo, mas o material do gel torna a migrao mais difcil
para as molculas de DNA maiores do que para as menores. Ento, em um mesmo
perodo de tempo, um fragmento pequeno de DNA pode migrar muito mais longe do que
um fragmento grande. Voc pode pensar no gel de eletroforese como uma pista de
corrida onde os corredores (as molculas a serem separadas) se separam como












Cuba de eletroforese com
sol uo sal i na



DNA
Fonte de
energia
9
atletas em uma corrida real (Figura 3). As molculas menores correm mais rpidas.
Duas molculas do mesmo tamanho vo correr exatamente juntas.



+
+
+

Figura 3. Na eletroforese, os DNAs pequenos sempre ganham.


Aps algum tempo, a corrente eltrica cortada e o gel colocado em uma soluo
corante. Aps a colorao, o DNA pode ser visualizado. O mtodo mais utilizado pelos
pesquisadores a colorao com brometo de etdio. Quando o brometo de etdio se liga
ao DNA, este fluoresce sob luz ultravioleta (UV). (Obs: O brometo de etdio mutagnico
e requer extrema cautela durante a sua utilizao e recipientes adequados para descarte).
O padro observado uma srie de riscos (bandas) no gel; cada banda composta por
molculas de DNA de um tamanho. Na verdade, existem milhes de molculas de DNA
em uma mesma banda, mas elas so do mesmo tamanho (ou de tamanhos muito
prximos). Aps a digesto com enzimas de restrio, o gel deve apresentar uma banda
para cada fragmento de tamanho diferente produzido na digesto. O fragmento menor
10
ser aquele que migrou mais longe do poo onde foi colocado a amostra e o fragmento
maior ser aquele que migrou menos (Figura 4).



A B
Amostras

9.000 (No h amostras
8.000 no restante do gel)



4.000
3.000

2.000


Figura 4. Uma das finalidades da eletroforese em gel separar produtos de
digesto com enzimas de restrio. (A) Mapa de restrio com o tamanho
dos fragmentos em pares de base. (B) Esquema de um gel aps a
eletroforese.

8.000 2.000 3.000 4.000 9.000
1. Digesto com enzima de restrio
2. Eletroforese
3. Visualizao e anlise do gel
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Atividade
Nas prximas pginas, voc tem trs representaes de uma molcula de DNA (Apndice
1) e o esquema de um gel de eletroforese (Apndice 2). No Apndice 1 esto
representados os stios de trs enzimas de restrio diferentes na mesma molcula de
DNA. Voc vai simular a digesto deste DNA com cada uma das trs enzimas e ento vai
simular a eletroforese dos fragmentos de restrio em um gel de agarose.
1. Corte as trs figuras da molcula de DNA.
2. Simule a atividade da enzima de restrio EcoRI na molcula de DNA que mostra os
stios da EcoRI, cortando a faixa nas linhas verticais que representam os stios da
EcoRI. Aps ter digerido a molcula com a EcoRI mantenha os seus fragmentos
de restrio.
3. Agora voc vai digerir a segunda molcula de DNA com a BamHI. Preserve os
fragmentos de restrio obtidos.
4. Faa o mesmo com a ltima molcula de DNA, utilizando a enzima HindIII.
5. Em seu gel de eletroforese imaginrio, voc vai separar os fragmentos da EcoRI,
BamHI e HindIII como se voc tivesse aplicado estas amostras em poos diferentes e
adjacentes no gel. Arrume os seus fragmentos como se eles estivessem sido
separados atravs de eletroforese em gel de agarose. (Os fragmentos maiores
devem ficar mais prximos dos poos onde as amostras foram aplicadas).
6. Agora, separe os fragmentos BamHI e coloque-os adjacente aos fragmentos EcoRI.
Certifique-se de ter ordenado cada fragmento EcoRI corretamente pelo tamanho com
relao aos fragmentos BamHI que voc j havia disposto.
7. Repita o mesmo procedimento para os fragmentos HindIII. Agora voc deve ter trs
grupos de fragmentos dispostos na sua frente.
8. Agora olhe para o esquema de um gel de eletroforese dado no Apndice 2. Note que
ele tem uma escala de tamanho dado em pares de bases disposta esquerda dos
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poos do gel. Utilizando esta escala como um guia, desenhe o padro obtido com a
digesto que voc realizou. Utilize um poo para a digesto com EcoRI, outro para a
digesto com BamHI e um terceiro para a digesto com HindIII.
9. Utilize as informaes obtidas nas fitas de papel que voc recortou para desenhar as
bandas representando os fragmentos de restrio em pares de bases.
Todos os fragmentos menores no gel esto na frente dos fragmentos maiores? Voc
notou que o tamanho da escala parece no ter intervalos regulares? Isto ocorre porque
os fragmentos de tamanhos diferentes se comportam de forma diferente no gel de
agarose.

13
Apndice 1

Voc tem a representao de trs molculas de DNA com 15.000 pares de bases. Cada
representao mostra a localizao de diferentes stios de restrio (linhas verticais). Os
nmeros entre os stios de restrio mostram os tamanhos (em pares de bases) dos
fragmentos que sero gerados aps a digesto do DNA com as respectivas enzimas.

Stios de restrio da EcoRI




Stios de restrio da BamHI




Stios de restrio da HindIII



4.000 3.500 2.500 5.000
6.000 4.000 3.000 2.000
8.000 4.500 2.500
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Apndice 2

Esquema de um gel de agarose.
EcoRI BamHI HindIII

Escala de tamanho
em pares de bases

8.000

6.000



4.000

3.000


2.000


Amostras
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Plasmdios Recombinantes

Algumas das tcnicas mais importantes em Biotecnologia utilizadas hoje envolvem a
construo de molculas de DNA recombinantes. O material recombinante a reunio de
fragmentos com origens diferentes. Voc pode construir uma bicicleta recombinante
atravs da unio de duas bicicletas diferentes: por exemplo, voc pode colocar os pneus
de uma bicicleta na estrutura de outra. O seu genoma recombinante porque uma parte
veio de sua me e outra de seu pai. As molculas de DNA recombinantes so pedaos
de DNA de fontes diferentes que foram reunidos. Em Biotecnologia, geralmente, uma das
fontes de DNA um plasmdio.
Os plasmdios so pequenas molculas de DNA circulares. Os plasmdios so copiados
pelas enzimas de duplicao de DNA da clula porque eles contm uma seqncia
especial de bases chamada de origem de duplicao . As enzimas de duplicao
reconhecem esta seqncia especial e comeam a sintetizar uma nova molcula de DNA.
Como voc deve imaginar, o cromossomo da bactria e outros cromossomos tambm
apresentam origem de duplicao . As origens de duplicao so essenciais para a
hereditariedade; se a molcula de DNA no tivesse uma origem de duplicao, ela no
poderia ser copiada pela clula e no seria transmitida s geraes futuras.
Os plasmdios freqentemente contm genes para resistncia a antibiticos. Os
antibiticos so substncias naturais produzidas pela maioria dos microrganismos para
matar outros microrganismos quando em competio. A resistncia a antibiticos
tambm um fenmeno natural; os microorganismos que produzem antibiticos devem
ser resistentes pelo menos ao antibitico que produzem! Ns vamos trabalhar com os
genes para resistncia aos antibiticos ampicilina e canamicina.
Nesta atividade, voc vai reunir plasmdios que carregam genes para resistncia
ampicilina e canamicina e ento recombinar os dois plasmdios. Ns chamamos o
plasmdio com resistncia a ampicilina de pAMP, o plasmdio com resitncia canamicina
de pKAN e o plasmdio recombinante de pAMP/KAN. Ns vamos utilizar um modelo de
plasmdios de papel para mimetizar o processo realizado quando da construo de um
DNA recombinante. A tesoura vai substituir as enzimas de restrio. A enzima DNA
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ligase, a qual forma as pontes de fosfodister entre os pedaos de DNA, ser
representada pela fita adesiva (ou cola). Nosso resultado ser uma molcula de DNA
recombinante. Os cientistas colocam os plasmdios recombinantes reais em bactrias,
onde eles vo se multiplicar. As bactrias tambm se multiplicam, fazendo milhes de
cpias de molculas de DNA recombinante e das protenas que elas codificam.

A construo dos plasmdios pAMP e pKAN
Localize as fitas de DNA nos Apndices Modelo de papel do plasmdio pAMP e
Modelo de papel do plasmdio pKAN . Em cada faixa, as seqncias de letras
indicam as bases e as linhas horizontais indicam a cadeia de acar e fosfato da molcula
de DNA. As pontes de hidrognio entre os pares de base esto localizadas no espao em
branco entre as linhas formadas pelas seqncias de letras.
1. Corte ao longo das linhas slidas. Retire cada faixa, deixando as linhas slidas
intactas. Faa um corte vertical para unir o final aberto de cada faixa formada pelas
linhas slidas. Este corte vai remover as marcaes 5 e 3 de cada fita.
2. Aps ter recortado as trs faixas, cole com fita adesiva o final 1 com a rea
cole 1 , cobrindo as linhas verticais. Cole o final 2 ao cole 2 e o 3 ao
cole 3 at que voc complete o modelo circular do plasmdio pAMP.
3. Utilizando o Apndice Modelo de papel do plasmdio pKAN faa o mesmo
procedimento descrito acima, montando agora o modelo circular do plasmdio que
contm o gene de resistncia para a canamicina.

Construindo o plamdio recombinante pAMP/KAN
Agora voc tem os plasmdios pAMP e pKAN preparados. Voc vai usa-los agora como
materiais iniciais para construir um plasmdio recombinante. Corte o pAMP e o pKAN com
as enzimas BamHI e HindIII. Voc vai unir os fragmentos de cada plasmdio, criando um
plamdio pAMP/KAN.
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1. Primeiro, simule a atividade da enzima de restrio BamHI. Lendo da posio 5
para a 3 (esquerda para a direita) ao longo da fita superior do seu plasmdio pAMP,
encontre a seqncia de bases GGATCC (stio de restrio da BamHI). Note que
esta uma seqncia palindrmica. Corte atravs da cadeia de acar e fosfato
entre as duas G; pare no centro da rea em branco que contm as pontes de
hidrognio (no corte atravs de todo o papel). Faa o mesmo com a fita oposta.
Agora corte atravs das pontes de hidrognio entre os dois cortes anteriores e abra o
plasmdio em uma tira. Cada final da tira deve ter uma pequena seqncia de fita
simples 3 CTAG 5 . Marque no final de cada faixa BamHI .
2. Agora, simule a atividade da enzima de restrio HindIII. Lendo da posio 5 para
a 3 (esquerda para a direita) ao longo da fita superior do seu plasmdio pAMP,
encontre a seqncia de bases AAGCTT (stio de restrio da HindIII). Note que esta
tambm uma seqncia palindrmica. Corte atravs da cadeia de acar e fosfato
entre as duas A; pare no centro da rea em branco que contm as pontes de
hidrognio (no corte atravs de todo o papel). Faa o mesmo cortando entre as
duas A do stio de restrio da fita oposta. Agora corte atravs das pontes de
hidrognio entre os dois cortes anteriores e abra o plasmdio em uma tira. Cada final
da tira deve ter uma pequena seqncia de fita simples; uma o final BamHI e a
outra a seqncia 3 TCGA 5 . Agora voc tem dois pedaos de DNA do pAMP.
Reserve-os.
3. Utilizando o modelo de plasmdio pKAN, repita os passos 1 e 2. O plasmdio pKAN
deve resultar em duas partes com os finais marcados.
4. Pegue o pedao de plasmdio que contm o gene de resistncia ampicilina e rena
ao pedao contendo o gene de resistncia canamicina utilizando a DNA ligase
(fita adesiva). Certifique-se da complementaridade de bases quando voc fizer a
ligao. Note que o final BamHI no vai parear com o final HindIII, mas vai parear
com o outro final BamHI. Da mesma forma, o final HindIII deve parear com o outro
final HindIII.

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Lembre-se de que o DNA tridimensional. Em nosso modelo, as letras representando as
bases podem parecer uma em cima da outra, mas no DNA real isto no acontece. Ento,
nesta simulao no papel, as letras representando as bases no precisam
necessariamente estar logo acima umas das outras. Certifique-se da direo 5 3
da fita e que os pares de base estejam corretos.
Agora voc criou um plamdio recombinante pAMP/KAN.
Transformao
possvel introduzir os plasmdios em bactrias utilizando o processo de transformao.
As bactrias que podem ser transformadas (podem receber DNA exgeno) so chamadas
de clulas competentes. Algumas bactrias so competentes naturalmente. Outras
podem se tornar competentes por meio de um tratamento qumico ou fsico. Quando a
bactria incorpora o plasmdio, ela passa a expressar a resistncia ao antibitico que
estiver "instrudo" no DNA recm adquirido. As bactrias que expressam protenas novas
desta forma so chamadas de transformadas. As enzimas de duplicao de DNA da
clula sintetizam cpias novas do plasmdio, que ser, ento, transmitido s clulas-filhas
quando a bactria se multiplicar. Neste processo so geradas muitas cpias idnticas de
genes novos, ento, dizemos que estes so genes clonados.
Aps a transformao por plasmdios contendo genes de resistncia a antibiticos, as
bactrias transformadas podem ser detectadas quando so cultivadas em placas
contendo o(s) antibitico(s). No meio de cultura contendo antibitico, apenas as bactrias
que expressarem o novo gene de resistncia ao antibitico vo formar colnias (as
bactrias transformadas). Este mtodo de selecionar transformantes (porque eles no
so os nicos que podem crescem em meio de cultura) vantajoso porque, normalmente,
a transformao um processo bastante ineficiente. Em um experimento tpico, apenas 1
clula em cada 1.000 ser transformada.

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Questes
1. Um stio de corte feito pela BamHI vai se ligar apenas a um corte que tenha sido feito
por BamHI. O mesmo verdade para cortes feitos pela HindIII e pela maioria dos
stios de corte das enzimas de restrio. Se voc usa dois fragmentos de uma vez,
quais combinaes diferentes poderiam ser formadas a partir dos quatro fragmentos
que voc obteve no exerccio 3? Quais destes poderiam ser detectados em colnias
de transformantes em meio de cultura contendo antibitico?
2. Supondo que voc fez a atividade com DNA real e pretende transformar bactrias
com o seu plasmdio pAMP/KAN. Descreva um experimento para crescer as
bactrias transformadas em placas e selecionar aquelas que tenham sido
transformadas por pAMP/KAN. Inclua os controles que podero lhe dizer quais
bactrias formaro colnias e se o antibitico est ativo.
3. Com relao questo 2, descreva um procedimento para distinguir as bactrias que
foram transformadas por outras molculas de DNA que se formaram durante o
processo de ligao (voc descreveu estas molculas na questo 1).
4. Freqentemente, os cientistas combinam um gene de resistncia a um antibitico com
seja qual for o gene que eles esto tentando clonar. Este gene ento associado a
um gene de resistncia a um antibitico. Qualquer bactria que contenha o gene de
interesse ser, portanto, resistente ao antibitico. Na maioria dos casos, os cientistas
no tm interesse na protena que destri o antibitico. Porque ento os cientistas
combinam os genes desta forma?


19
Model o de papel do pl asmdi o pAMP


1 Gene de resistncia ampicilina
5' AATTCGATGAATTCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAATTCTGAAGGTTCGAAGCGCTAT
3' TTAAGCTACTTAAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCTTAAGACTTCCAAGCTTCGCGATA


2
5' GTCGGATCCAGATCCGAAGTCTCTCTAGGACCTTGCGAAGCCACGTAGTTCAGATTAATGCCTGAT
3' CAGCCTAGGTCTAGGCTTCAGAGAGATCCTGGAACGCTTCGGTGCATCAAGTCTAATTACGGACTA


3 Origem de duplicao
5' CGCTACAAGCTTATAGCGGCCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAATATTGCGCAGTCTTAGCACTCC
3' GCGATGTTCGAATATCGCCGGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTATAACGCGTCAGAATCGTGAGG
20
Model o de papel do pl asmdi o pKAN

1 Origem de duplicao
5' TACTCGATGAAATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTATGTTCTGAAGGATCCATATAGCGC
3' ATGAGCTACTTTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGATACAAGACTTCCTAGGTATATCGCG



2 Gene de resistncia kanamicina
5' ATGACCGTCAGATCCGATGCTTCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGAACGTACGGTCCGA
3' TACTGGCAGTCTAGGCTACGAAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTTGCATGCCAGGCT


3
5' GATCACATGCTTATAAATATTGCGAAGCTTCAGTCAGCGCGTAGCACTCCTTAACGCGATGCATTAA
3' CTAGTGTACGAATATTTATAACGCTTCGAAGTCAGTCGCGCATCGTGAGGAATTGCGCTACGTAATT
21

22
Anlise de Restrio

A combinao da digesto com enzimas de restrio e a eletroforese em gel
freqentemente chamada de anlise de restrio, pois a informao obtida destes
procedimentos pode ser utilizada para analisar a estrutura da molcula de DNA. A
anlise de restrio importante especialmente para verificar a estrutura de molculas de
DNA recombinante e na anlise de DNA desconhecido. Os exemplos a seguir mostram
alguns problemas tpicos de anlise de restrio encontrados pelos pesquisadores.

Desafio de anlise de restrio I
Voc deseja inserir um fragmento de restrio EcoRI de 1.500 pares de bases em um
plasmdio (Figura 1). Voc digere o plasmdio com EcoRI, pra a digesto, adiciona o
fragmento de 1.500 pares de bases e liga. Voc sabe que este procedimento vai gerar
uma mistura de plasmdios originais e plasmdios recombinantes. Delineie um
procedimento de anlise de restrio que voc poderia utilizar para distinguir entre o vetor
regenerado e o vetor recombinante. Estabelea o tamanho dos fragmentos esperados.
Utilize o esquema de gel fornecido para mostrar os produtos esperados na sua anlise
(um produto por poo). Marque cada poo com o tipo de molcula de DNA (plasmdio ou
plasmdio recombinante) e os tamanhos dos fragmentos esperados.

Desafio de anlise de restrio II
Voc deseja remover o fragmento de restrio EcoRI do plasmdio e substitu-lo por um
fragmento EcoRI diferente mas tambm de 1.500pb. Voc digere o plasmdio com EcoRI,
pra a digesto, adiciona o fragmento de 1.500 pares de bases e liga (Figura 2).
23

Vetor incial Esquema do Gel
A distncia entre os stios de restrio dada em pares de bases.








Fragmento a ser inserido no vetor
EcoRI EcoRI

Figura 1. Informao e esquema do gel de eletroforese para o desafio de anlise de restrio I.

Vetor incial Fragmento EcoRI a ser inserido
A distncia entre os stios de restrio dada em pares de bases.
EcoRI BamHI EcoRI




Figura 2. Informao e esquema do gel de eletroforese para o desafio de anlise de restrio II.
1.500 pb
2.000 pb
EcoRI
BamHI
3.000 pb
1.000 pb 500 pb
2.000 pb
EcoRI
BamHI
3.000 pb
EcoRI
1.500 pb
Origem
24

Atividade
A. Desenhe os produtos que voc poderia gerar que apresente uma origem de
duplicao e menos de 7.000pb. (Sugesto: o que so todos os fragmentos presentes
na reao de ligao?). Marque os produtos A, B, etc. e indique as distancias entre
os stios de restrio.
B. Descreva um procedimento de anlise de restrio que levar voc a identificar o
maior nmero de produtos possvel aps uma nica digesto. Voc pode usar mais
de uma enzima de restrio na digesto. Estabelea o tamanho dos fragmentos
esperados para cada um dos seus produtos de IIA.
C. Use o esquema de gel de eletroforese da figura 3 para desenhar o padro de gel
esperado de sua proposta de anlise para cada um dos produtos mostrados em IIA.
Marque os poos do gel com o produto (A, B, etc). Marque as bandas com o tamanho
dos fragmentos (com base na escala fornecida).

Tamanho do
Fragmento (pb)

7.000


4.000


2.000


1.000


Figura 3. Esquema de um gel de eletroforese para o desafio de anlise de restrio IIC.

25
Desafio de anlise de restrio III
Quando os pesquisadores estudam um fragmento de DNA desconhecido,
freqentemente, a primeira coisa a se fazer colocar junto a um mapa de restrio. O
mapa ento utilizado como um guia quando eles vo estudar os genes codificados por
este segmento. Como o fragmento colocado junto ao mapa de restrio? Deve-se
digerir o DNA com enzimas nicas e com combinaes de enzimas. Observando-se os
tamanhos dos fragmentos produzidos, os pesquisadores determinam as localizaes dos
stios de restrio que poderiam resultar no padro de bandas obtido.
Agora voc vai montar um mapa de restrio (como um quebra-cabea). Um fragmento
de DNA linear digerido com a enzima de restrio EcoRI e resulta em trs segmentos:
um com 3.000, outro com 3.600 e outro com 3.400 pb. Quando digerida com a BamHI, a
molcula de DNA gera fragmentos de 4.500, 3.000 e 2.500pb. Um digesto dupla com
EcoRI e BamHI resulta em fragmentos de 2.500, 500, 3.600, 3.000 e 400 pb.
Desenhe um mapa de restrio do fragmento de DNA desconhecido, mostrando as
localizaes dos stios de restrio EcoRI e BamHI. Indique as distncias entre os stios
de restrio em pares de bases. Indique tambm a distncia e a posio de cada um
destes stios com o respectivo nome da enzima.


26
Deteco de Seqncias Especficas de DNA
Parte 1. Procurando um gene

Imagine que voc um cientista e acabou de extrair um DNA. Voc precisa saber se este
DNA contm o gene para fibrose cstica. Voc sabe pouco sobre o gene da fibrose
cstica, ento, como voc pode dizer se o tem em sua amostra?
Quando um cientista procura por um determinado segmento de DNA, ele pode utilizar um
DNA especial denominado sonda (probe). Normalmente uma sonda um fragmento de
DNA de fita simples. Se um pedao de DNA de fita simples encontra outro segmento de
DNA tambm de fita simples e com exatamente a mesma seqncia de bases, eles vo
se parear formando um DNA de dupla hlice. Os cientistas utilizam um termo especial
para o pareamento de duas fitas simples de DNA para constituir uma fita dupla: hibridao
(Figura 1).




Figura 1. Hibridao de uma sonda com uma seqncia dentro do DNA de fita simples.

Para saber se um gene est presente na amostra de DNA, os cientistas utilizam uma
sonda com a mesma seqncia de uma parte do gene. Ela adicionada amostra de
DNA para saber se vai hibridar em algum local. Como eles sabem quando a sonda
hibridou? Se a sonda hibridar com a amostra, ir grudar com o DNA da amostra. Se
no, a sonda pode ser retirada facilmente. Aps a lavagem da amostra, os
cientistas conseguem saber se a sonda hibridou com a amostra ou no. Se ocorrer a
hibridao porque a seqncia de DNA da sonda est presente na amostra. Se a
sonda um pequeno segmento do gene, ento, provavelmente o gene est presente na
amostra.

Gene de interesse
Sonda
Complementaridade de
bases
27
Atividade
No Anexo 1 voc tem uma longa seqncia de DNA representando a sua amostra. Voc
tambm tem uma seqncia curta que uma sonda para o gene da fibrose cstica. Voc
vai utilizar a sonda para determinar se o gene da fibrose cstica est em sua amostra de
DNA.
A amostra de DNA dada de fita simples. Para saber se a sonda vai hibridar com a
amostra, necessrio separar as fitas de DNA de modo que a sonda possa encontrar a
seqncia de bases complementar.
1. Recorte as sondas.
2. Verifique a seqncia de DNA para ver se a sonda vai hibridar com a sua amostra.
3. O gene da fibrose cstica est presente em sua amostra de DNA? Se voc encontrou
uma seqncia onde a sonda poderia se hibridar, marque-a na seqncia de DNA.

Questes
1. O que hibridao?
2. Como voc pode utilizar a hibridao para saber se uma certa seqncia de DNA est
presente em sua amostra de DNA?
3. Determine uma sonda com 10 pares de bases (pb) que poderia se hibridar com a
seqncia de DNA a seguir.

5' AATGCAGGCCCTATATGCCTTAACGGCATATGCAATGTACAATGCAAGTCCAACCGG 3'
28
Anexo 1. Sequncia de DNA de fita simples e sonda.
Sonda: 3' GGATGCTACCATAGC 5' 3' GGATGCTACCATAGC 5'
Amostra de DNA (a sequncia est escrita no sentido 5' 3'):
1
GGATCAGACTTCTAGCAGGCTCTTGACCAATGATCACAGCTTCCGATCTAG
2
AGCTCGATCTCTTGATCTCGATCTCGTGTCGGAATCTAGCCCGGGTCAGC
3
TATCGCTAAGATAGACCGGAATCGAGAATTCCGGATCGATCGATTGTGCGA
4
CCGCGATTATTCGATCGTTTGCCCGGGATCTAGCTTTCCGATCTAGCTGTG
5
TCAAGCTAGTGGAATCGAATTCGGAACTCGGCCCGATCTTGATCTCCCGGG
6
ACAATTGTCGATCTGATGCTAGCTGAATCGATGTGCCTAAGTGCTAGCCCGG
7
GCGATCTGGGATCGATTCCCGGGATCTAGGCCTACGATGGTATCGTTAGC
8
TAGCTCTCTAGCTTAGCTCTCAAGTGATCTACCCGGGTAGATCTAGTATATTG
9
TATCGATATTTTCGCTTAGCTAGCCCGGGCTAGCTCTCTCTAGCTAATAGATAG
10
TCTAGCTAGCTAGCTAGCTGTGTCTAGTCGATCGTTTGTCGATCTTCGATC

29
Deteco de Seqncias Especficas de DNA
Parte 2. Combinando a anlise de restrio e a hibridao

A anlise de hibridao que voc aprendeu em Procurando um gene pode indicar se
uma dada seqncia de DNA est presente em sua amostra. Algumas vezes, este
simples "pedao" de informao tudo o que necessrio. Contudo, um teste de
hibridao positiva no d nenhuma informao sobre onde a seqncia de interesse est
localizada na molcula de DNA de sua amostra.
Para se ter informao sobre a presena e a localizao de uma determinada seqncia
de DNA, os pesquisadores combinam a anlise de restrio com a de hibridao.
Basicamente, a amostra de DNA digerida com uma (ou mais) enzima de restrio e os
fragmentos so separados por eletroforese. Aps a eletroforese realizada a hibridao
nestes fragmentos. Apenas o fragmento (ou os fragmentos) nos quais a sonda se hibridar
ser detectado (Figura 1).








Gel corado Resultado da anlise de hibridao
Figura 1. A anlise de hibridao mostra quais fragmentos de restrio hibridaram com a sonda.

30
H alguns detalhes tcnicos importantes sobre este processo. Primeiro que a eficincia
no boa se voc simplesmente colocar a agarose em contado com a soluo de sonda.
Em 1975, um cientista chamado Southern desenvolveu um procedimento para transferir
os fragmentos de DNA de um gel diretamente para uma membrana, de forma que a
disposio dos fragmentos no gel fosse preservada. Aps os fragmentos terem sido
transferidos para a membrana, eles poderiam ser testados na anlise de hibridao com a
sonda. Este mtodo de transferncia chamado de Southern blotting; e a combinao de
anlise de restrio, transferncia para uma membrana e hibridao com uma sonda
chamado de "Anlise de hibridao por Southern".
Atividade
1. Recorte a seqncia de DNA da atividade anterior ao longo das linhas pontilhadas.
Cole a fita 1 na fita 2 e esta na fita 3 sucessivamente at a fita 10, formando uma
molcula longa e linear. Esta molcula poderia ser um cromossomo como um dos
nossos.
2. Agora simule a atividade da enzima de restrio SmaI. Esta enzima corta o DNA nas
seqncias 5' CCCGGG 3' entre a C e a G no meio da seqncia. Corte a sua
seqncia em todos os stios de restrio SmaI. (Os seus fragmentos esto em fita
simples antecipadamente para facilitar a hibridao. Na realidade, a digesto e a
eletroforese so realizadas com o DNA em fita dupla; apenas aps a eletroforese e a
transferncia para a membrana que os fragmentos sero separados ou
desnaturados).
3. Agora, simule a eletroforese dos seus fragmentos. Distribua-os por ordem de
tamanho e disponha-os em sua mesa como se eles estivessem em um gel.
4. Utilize o esquema dado no Anexo 1 e desenhe a disposio dos seus fragmentos no
gel.
5. Marque com um asterisco a(s) banda(s) onde houve hibridao com a sonda.
6. Lembre-se de que o padro de fragmentos de DNA no seu gel ser transferido
exatamente da mesma forma para a membrana. Na membrana, os fragmentos sero
testados para a hibridao com a sonda e apenas o(s) fragmento(s) que hibridou com
a sonda ser detectado (como foi demonstrado na Figura 1). Desenhe o que ser
detectado aps a hibridao no quadro marcado "Resultado da anlise de
hibridao".
31

Questo
1. possvel recortar uma banda de um gel de eletroforese, purificar o DNA que estiver
nesta banda e clonar este DNA. Suponha que voc tem uma sonda para um gene
viral que voc gostaria de clonar, mas voc no sabe onde ele se encontra no
cromossomo de 40.000 pb do vrus. Como a anlise de hibridao poderia ajud-lo a
clonar este gene?


32
Anexo 1. Esquemas para a eletroforese em gel e para o resultado da anlise de
hibridao.
Gel de eletroforese corado Resutado da anlise de hibridao

Tamanho dos Tamanho dos
fragmentos Amostra fragmentos
(pb) (pb)

100 100

90 90

80 80
70 70


60 60



50 50



40 40




30 30




20 20
33
Deteco de Seqncias Especficas de DNA
Parte 3. Hibridao por Southern
Problema A
Voc est analisando o DNA de um vrus recm-descoberto. Voc j construiu um mapa
de restrio com 26.500 pb, demonstrado no Anexo 1. J que voc est interessado em
enzimas DNA polimerases, voc conduziu a anlise de hibridao do DNA do vrus X
utilizando um gene de DNA polimerase de outro vrus como sonda. Voc acredita que
esta seqncia relacionada com o vrus X. Para sua alegria, a sonda hibridou com o
DNA do vrus X. Voc acredita que a seqncia de DNA do vrus X na qual a sonda
hibridou seja o gene da DNA polimerase do vrus X.
Agora voc gostaria de determinar a localizao do gene da DNA polimerase do vrus X e,
para isto, realizou a anlise de hibridao por Southern. Voc digeriu o DNA viral com
EcoRI e BamHI separadamente, separou os fragmentos em um gel, transferiu-os para
uma membrana e realizou a hibridao utilizando a mesma sonda do gene da DNA
polimerase.
No Anexo 1 h uma figura dos fragmentos no gel de eletroforese e o padro obtido aps a
hibridao com a sonda na membrana.

Questes
1. Marque os fragmentos no gel com os seus respectivos tamanhos em pares de bases.
2. Indique, nos mapas de restrio, a regio do DNA do vrus X na qual est localizado o
gene da DNA polimerase.
3. A que distncia da esquerda o gene poderia estar, em termos de stios de restrio?
E a que distncia da direita?
4. Porque o gene da DNA polimerase de um outro vrus poderia hibridar com fragmentos
de DNA do vrus X?


34
Problema B
No Anexo 2 voc encontra um mapa de restrio do Bacterifago lambda. Voc digeriu
uma amostra de DNA do fago com as enzimas BamHI e HindIII separadamente e
submeteu os fragmentos digeridos eletroforese.
Agora voc transferiu os fragmentos para uma membrana e realizou a anlise de
hibridao utilizando um fragmento de 4.878 pb do lambda digerido com EcoRI (referido
no mapa) como uma sonda.
1. Desenhe o resultado do gel de eletroforese no esquema dado no Anexo 2 (os dois
fragmentos menores da HindIII vo correr para fora do gel).
2. Indique quais fragmentos vo hibridar com a sonda de 4.878 pb (A hibridao vai
ocorrer mesmo que ocorra uma complementaridade apenas parcial da sonda com o
fragmento de restrio).
3. No segundo quadro, desenhe o que poderia ser visto aps a deteco da sonda na
membrana.

35
Anexo 1. Mapas de restrio e anlise de hibridao do vrus X para a deteco de
seqncias especficas do DNA Parte 3.

O mapa de restrio superior mostra os stios de restrio EcoRI e o inferior mostra os
stios de restrio BamHI. Os tamanhos dos fragmentos so dados em pares de bases.
O gel de eletroforese corado mostra os fragmentos EcoRI e BamHI do vrus. A anlise de
hibridao mostra quais as bandas que hibridaram com a sonda.
Mapa de restrio EcoRI
9.000 5.500 4.000 2.000 6.000

Mapa de restrio BamHI
3.000 7.500 10.500 5.500

Gel corado Resultado da anlise de hibridao
EcoRI BamHI EcoRI BamHI
Tamanho, pb

10.000
8.000




4.000



2.000
36
Anexo 2. Mapas de restrio e anlise de hibridao do bacterifago lambda para a
deteco de seqncias especficas do DNA Parte 3.
Os stios de restrio do bacterifago lambda para as enzimas BamHI, HindIII e EcoRI
esto demonstrados abaixo. Os tamanhos dos fragmentos so dados em pares de
bases. Os esquemas do gel e da anlise de hibridao so fornecidos para o seu uso.

Mapa de restrio BamHI
5.505 16.841 5.626 6.527 7.233 6.770

Mapa de restrio HindIII
23.130 9.416 6.557 4.361

Mapa de restrio EcoRI
21.226 4.878 5.643 7.421 5.804 3.530


Gel corado Resultado da anlise de hibridao
EcoRI BamHI EcoRI BamHI
Tamanho, pb

10.000
8.000




4.000



2.000
2.027 2.322
564 125
37
Sequenciamento do DNA: os finalizadores

A determinao da seqncia de bases de um segmento de DNA um passo crtico em
muitas aplicaes da Biotecnologia. O mtodo mais utilizado hoje emprega componentes
chamados de "finalizadores de cadeia", um termo que descreve o efeito letal destes
componentes na sntese do DNA e a natureza das enzimas DNA polimerases. Estas
enzimas lem a seqncia de uma fita simples de DNA e sintetizam uma fita
complementar. Os finalizadores de cadeia nos permitem verificar a ordem na qual as
enzimas DNA polimerases incorporam as bases nova fita de DNA, e ento, deduzir a
seqncia da fita molde.
O que so estes "finalizadores de cadeia" e como eles bloqueiam a sntese do DNA? Os
"finalizadores de cadeia" so molculas muito semelhantes aos nucleotdeos normais,
mas sem o grupo essencial hidroxila (OH) na posio 3' (Figura 1). Na duplicao do
DNA, um nucleotdeo complementar base molde incorporado na devida posio. A
DNA polimerase incorpora este nucleotdeo fita de DNA em formao inserindo uma
ponte de fosfodister entre o grupo fosfato na posio 5' do novo nucleotdeo e o grupo
OH na posio 3' do ltimo nucleotdeo da cadeia. A DNA polimerase no pode sintetizar
o DNA sem um grupo 3' OH preexistente para ser usado como um ponto inicial (da a
necessidade de um fragmento inicial - primer - para o incio da sntese de DNA). Se a
DNA polimerase incorpora erroneamente um finalizador de cadeia no lugar de um
nucleotdeo normal, nenhum nucleotdeo poder ento ser adicionado posteriormente e a
sntese do DNA estar finalizada.








O
OH H
HO CH
2
base
Deoxinucleosdio
O
H H
HO CH
2
base
Dideoxinucleosdio
38







Figura 1. Um deoxinucleotdeo normal com os "finalizadores de cadeia".
Todos so incorporados ao DNA em sua forma trifosfato.

Os finalizadores de cadeia utilizados no sequenciamento do DNA so os
dideoxinucleotdeos (Figura 1). Como os dideoxinucleotdeos nos levam a identificar a
seqncia de bases de uma molcula de DNA? A reao de sequenciamento contm a
amostra de DNA a ser sequenciada, os iniciadores (primers) e os deoxinucleotdeos
normais radioativos (deoxiadenosina [dA], dG, dC, dT). Esta soluo inicial dividida em
4 partes e cada parte ento acrescida de um dideoxinucleotdeo diferente:
dideoxiadenosina (ddA), ddG, ddC ou ddT. Adiciona-se ento a enzima DNA polimerase
e sero sintetizadas novas molculas de DNA. Contudo, ocasionalmente inserido um
dideoxinucleotdeo no lugar de um deoxinucleotdeo normal e a cadeia de DNA pra de
ser sintetizada. Na soluo de reao contendo ddA (a reao A), alguma porcentagem
das novas molculas vo adicionar um ddA onde houver uma T na fita molde. O
resultado um grupo de novas molculas as quais terminam em cada T que aparece na
fita molde. Similarmente, na reao G, algumas das novas molculas vo terminar a cada
C da fita molde. Na reao C, algumas das novas molculas vo terminar a cada G da
fita molde e na reao T, as molculas terminam a cada A da fita molde.
Ao seu trmino, as reaes de sntese (reao-A, -G, -C e -T) so desnaturadas pelo
calor e submetidas eletroforese em um gel de poliacrilamida. As molculas recm-
sintetizadas so separadas de acordo com o seu tamanho e visualizadas pela exposio
do gel a um filme fotogrfico (lembre-se de que os novos nucleotdeos so radioativos). A
reao-A vai mostrar bandas que correspondem, em tamanho, s posies das T na fita
molde. A reao-G vai mostrar bandas cujos tamanhos correspondem s posies das C
O
N
3
H
HO CH
2
base
Azidotimidina
O
H OH
HO CH
2
base
Aciclovir
39
e assim por diante. A seqncia da nova fita de DNA "lida" na seqncia de bandas
que aparecem no gel a partir da poro inferior (final do gel), onde esto os fragmentos
menores.
Esta explicao pode parecer confusa. No se preocupe. Faa agora a simulao de um
sequenciamento (Anexo 1) e ento volte a ler esta introduo. S ento responda as
questes a seguir.




40
Atividade (esta atividade deve ser realizada em classe)

1. Recorte os iniciadores (primers) dados no Anexo 1 (quatro "molculas" por
estudante). A fita mais longa a fita molde e a mais curta, pareada com a fita molde,
o iniciador.
2. Separe clipes de papel de 5 cores diferentes: 20 de cada uma de quatro cores e 4 de
uma cor que ser o "finalizador de cadeia". Os clipes vo representar os novos
nucleotdeos radioativos.
3. Reserve 4 copos plsticos e marque em cada um A, C, G ou T. Determine quais
cores de clipes vo representar a A, C, G e a T. A classe deve ser dividida em 4
grupos: grupo A, grupo C, grupo G e grupo T. Cada grupo vai conduzir apenas uma
reao de sequenciamento nas 4 fitas-molde. Os estudantes do grupo A devem
colocar 20 clipes da cor pr-determinada nos copos G, C e T e no copo plstico A
devem colocar 16 clipes da cor A e os 4 clipes "finalizadores de cadeia" e mistur-los
com os demais. Neste caso, os 4 clipes diferentes representam as molculas de
dideoxiadenosina (ddA). Os estudantes do grupo G devem separar 20 clipes A, C e
T; no copo G devem colocar 16 clipes G e 4 clipes "finalizadores de cadeia". Os
grupos C e T devem fazer as suas "reaes" seguindo este mesmo raciocnio.
4. Agora todos devem comear a sintetizar a nova fita de DNA a partir do final 3' do
primer. Os nucleotdeos devem ser incorporados de acordo com a
complementaridade com a fita molde. Os nucleotdeos devem ser pegos ao acaso
(de olhos fechados); se voc pegar um "finalizador de cadeia" este deve ser
incorporado nova fita, mas nenhum outro nucleotdeo poder ser adicionado. Cada
estudante deve construir uma nova fita de DNA quatro vezes (uma para cada fita
molde).
5. Agora voc deve desnaturar as suas amostras e realizar a eletroforese. Desnature as
amostras cortando o papel entre a fita molde e o primer (voc deve ficar com o primer
juntamente com a fita nova de DNA [clipes] que voc construiu).
6. Em uma folha grande, desenhe o esquema do gel de sequenciamento da seguinte
forma (onde P =primer):

A G C T
P +16
P +15
P +14
-
41
-
-
P +3
P +2
P +1

7. Os estudantes de cada grupo devem montar apenas um "gel" e "aplicar as suas
amostras" no poo correspondente ao seu tipo de reao de sequenciamento (A, G, C
ou T).
8. Cada estudante deve contar quantos nucleotdeos (clipes) foram incorporados ao
primer (P) em cada uma das quatro fitas de DNA produzidas e ento colocar cada fita
em seu devido lugar no gel de acordo com o guia de referncia de tamanho das
molculas (P+1, P+2, etc).
9. Agora deve ser montado um nico gel. Quando todos os grupos terminarem, um
representante de cada grupo deve desenhar as bandas obtidas pelos demais.
10. Agora a seqncia do gel pode ser totalmente lida. Confira o resultado com a fita
molde.


Questes
1. A seqncia inteira da molcula de DNA molde (representada pela fita de DNA de
papel) est presente no gel de sequenciamento?
2. Se voc acrescentar alguns dideoxinucleotdeos no meio de uma cultura de clulas,
qual (se h algum) processo celular seria o mais afetado?
3. (Texto a seguir) Os dideoxinucletdeos e outras molculas "finalizadoras de cadeia"
so utilizados na Medicina como drogas no combate AIDS. Porque?
42
Os "terminadores de cadeia" so utilizados como drogas anti-virais.

As substncias qumicas utilizadas inicialmente em laboratrios de pesquisa, encontram
freqentemente uma utilizao na Medicina. Componentes que afetam os processos
biolgicos so importantes na pesquisa bsica e algumas vezes tm utilidade teraputica.
Os finalizadores de cadeia so um bom exemplo de tais componentes. Inicialmente eles
foram utilizados no sequenciamento do DNA (1995) e, posteriormente, como uma droga
anti-AIDS e como a melhor droga disponvel anti-herpes (desta classe de componentes).
Como os finalizadores de cadeia so utilizados na luta contra a AIDS e infeces pelo
vrus do herpes? As infeces virais so combatidas da mesma forma que realizado o
sequenciamento: finalizando a sntese de DNA. Para que um vrus estabelea uma
infeco, ele necessita multiplicar o seu cido nuclico. Bloquear esta duplicao uma
forma potencialmente eficaz de combater a infeco pelo vrus, mas o bloqueio da sntese
do DNA pode ser prejudicial tanto para o vrus como para o paciente. O combate ao vrus
do herpes e ao vrus da AIDS pode ser feito usando-se drogas que inibem a duplicao
porque eles codificam as suas prprias enzimas de sntese de DNA, as quais tm
propriedades nicas que podem ser exploradas.
O vrus da AIDS (Human Immunodeficiency Virus - HIV) um vrus de RNA. Ele codifica
uma enzima especial, chamada transcriptase reversa, que sintetiza o DNA utilizando o
RNA viral como molde. Este passo essencial para a infeco pelo HIV. Os
finalizadores de cadeia vo interferir neste passo. A enzima transcriptase reversa um
bom alvo para as drogas finalizadoras de cadeia porque uma enzima descuidada: ela
incorpora mais facilmente nucleotdeos errados ou os finalizadores de cadeia do que uma
polimerase humana. Alm disso, a transcriptase reversa no tem a propriedade de rever
os nucleotdeos incorporados e remover aqueles incorretos.
H outros aspectos importantes na utilizao das drogas finalizadoras de cadeia alm da
sensibilidade das polimerases virais. A droga deve permanecer no corpo e ser absorvida
pelas clulas-alvo. A forma trifosfato ativa dos finalizadores de cadeia (demonstrada na
Figura 2 pelo nucleotdeo que est sendo incorporado na cadeia) no absorvida pelas
clulas, de forma que as drogas so ministradas na forma desfosforilada (demonstrada na
Figura 1). Quando estes componentes entram na clula, as enzimas humanas so
capazes de adicionar grupos fosfato (fosforilar as molculas) para ativ-las. Diferentes
componentes so absorvidos e fosforilados com eficincias diferentes. Ento o
43
desenvolvimento de uma nova droga depende no apenas de sua toxicidade para o vrus,
mas tambm de como ela metabolizada no corpo humano.
Os finalizadores de cadeia freqentemente empregados contra o vrus da AIDS so:
azidotimidina (AZT), dideoxicitosina (ddC; o mesmo componente usado no
sequenciamento do DNA) e dideoxinosina (ddI) (Figura 1). O AZT, um anlogo da
timidina, incorporado cadeia de DNA que est sendo sintetizada no lugar da citosina.
A inosina um anlogo de nucleotdeo que idntico adenosina, exceto pela presena
de um grupo amino. As clulas sintetizam inosina e esta convertida diretamente em
adenosina. Quando a ddI ministrada como droga, ela entra na clula e convertida
rapidamente em ddA. A ddA incorporada pela transcriptase reversa no lugar da
adenosina normal.
Estas drogas tm efeitos colaterais aos pacientes. Embora a DNA polimerase humana
seja menos sensvel s drogas do que a transcriptase reversa, a sntese de DNA nas
clulas humanas normais tambm afetada. O AZT txico particularmente medula
ssea, enquanto o ddC e o ddI afetam os nervos perifricos. Infelizmente, o HIV adquire
resistncia a estes componentes.
Os vrus do herpes so vrus de DNA com genomas relativamente grandes. Eles
codificam muitas de suas prprias enzimas de duplicao, incluindo a DNA polimerase.
Aps a infeco inicial, o vrus do herpes permanece no corpo no estado inativo (latente),
do qual ele pode ser ativado e causar a doena. Os vrus do herpes simples 1 (HSV-1) e
2 (HSV-2) causam herpes labial e genital, respectivamente. O vrus do herpes (Varicella-
zoster virus) causa a catapora.
O vrus do herpes simples 1 pode ser tratado com o terminador de cadeia aciclovir (Figura
1). O aciclovir (conhecido comercialmente como Zovirax) relativamente atxico para o
corpo humano porque as nossas clulas no conseguem fosforilar esta droga que
permanece na forma inativa. Contudo o vrus do herpes codifica uma enzima que fosforila
o aciclovir de forma que este se tornar ativo apenas naquelas clulas infectadas pelo
vrus. O aciclovir um anlogo da guanina (G) e incorporado onde houver uma citosina
na fita molde. Uma vez incorporado o aciclovir finaliza a sntese do DNA viral e inibe a
atividade da polimerase do vrus do herpes.
44
Iniciadores e fita molde para o Sequenciamento do DNA





















5 CGAACATC
3 GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
5 CGAACATC
3 GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
5 CGAACATC
3 GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
5 CGAACATC
3 GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
45
Reao em Cadeia da Polimerase
(Polymerase Chain Reaction - PCR)

Uma das dificuldades dos pesquisadores frente anlise baseada no DNA a escassez
deste. Na medicina forense pode-se ter em mos apenas uma gota de sangue ou de
saliva para testar; um evolucionista pode querer analisar um exemplar de um museu sem
destru-lo. Mesmo que se tenha uma grande quantidade de tecido, seria trabalhoso
purificar o DNA em larga escala.
Em 1985, foi introduzida uma tcnica revolucionria. Esta tcnica permite gerar uma
grande quantidade de cpias de um fragmento de DNA especfico. Ela foi inventada por
um cientista de indstria farmacutica chamado Kary Mullis, que teve sua inspirao
inicial numa noite em 1983 quando ele estava dirigindo e pensando sobre um problema
tcnico que ele estava enfrentando em seu trabalho.
A essncia da idia de Mullis o seguinte: se voc pudesse colocar em um tubo uma
reao na qual a DNA polimerase duplicasse uma nica fita-molde de DNA em 2
molculas, estas em 4, ento em 8, 16, 32, etc, voc teria um nmero virtualmente infinito
de cpias da molcula original. Cada ciclo da sntese de DNA dobraria o nmero de
molculas iniciais: uma reao em cadeia produzindo fragmentos especficos de DNA. A
nova tcnica de Mullis foi chamada de reao em cadeia da polimerase (Polymerase
Chain Reaction) ou PCR.
Naturalmente, Mullis fez mais do que apenas perceber que a DNA polimerase pode copiar
uma hlice de DNA em duas. Voc tambm j sabia disto. O que ele fez foi imaginar
como realizar a reao in vitro e como utilizar esta reao para copiar um segmento de
DNA de interesse.
O mtodo de Mullis se baseia nas caractersticas das enzimas DNA polimerases e no
processo de hibridao. Lembre-se de que as DNA polimerases devem ter um iniciador
(primer) pareado a uma fita molde para sintetizar uma fita complementar e tambm que a
hibridao um processo espontneo no qual as bases formam pares complementares.
Voc pode separar duas fitas de uma hlice pelo calor, mas se resfri-las, elas tornaro a
se unir.
Mas como Mullis utilizou a DNA polimerase e a hibridao para realizar a reao em
cadeia de sntese do DNA? Siga a Figura 1 durante a explicao.
46
Primeiro voc deve decidir qual segmento do DNA voc deseja duplicar (os
pesquisadores dizem amplificar ao invs de duplicar porque eles esto fazendo muitas
cpias). Ento voc sintetiza duas molculas de DNA de fitas simples curtas (20 a 28
nucleotdeos) e complementares s extremidades do segmento que voc escolheu. Estas
duas molculas pequenas devem ter caractersticas especficas. Observe o incio da
figura 1 (ciclo 1). Esto esquematizadas uma fita dupla de DNA e duas cpias de duas
molculas pequenas de DNA de fita simples. Cada uma das molculas de fita simples
complementar a apenas uma fita do DNA parental e cada uma complementar apenas
poro final do segmento. Alm disso, se voc imaginar estas molculas pequenas
pareadas s regies complementares respectivas na fita-dupla, os seus finais 3' vo
apontar um para o outro. Estas molculas pequenas e de fita-simples so chamadas de
iniciadores (primers).
Para realizar a PCR uma grande quantidade de iniciadores e de molcula-molde so
misturadas em um tubo contendo um tampo e muitos deoxinucleotdeos trifosfatados.
Esta mistura aquecida at quase a ponto de ebulio e ento as fitas das molculas-
molde desnaturam (se separam uma da outra).
Depois, esta mistura resfriada. Eventualmente, as fitas da molcula parental de DNA se
renem, mas como h uma grande quantidade de iniciadores na mistura, alguns deles
encontram seus stios complementares nas fitas-molde antes que estas se renam
(Hibridao do primer com a fita-molde na figura 1).
Agora a DNA polimerase adicionada reao. Os iniciadores hibridados molcula-
molde so os pr-requisitos para que a DNA polimerase inicie a sntese do DNA. A DNA
polimerase comea a adicionar os deoxinucletdeos no final 3' dos iniciadores, formando
uma nova fita complementar (Sntese do DNA na figura 1).
Aps um curto espao de tempo, a mistura novamente aquecida. Agora, as duas fitas-
molde novas desnaturam, resultando em quatro fitas-simples (Desnaturao no ciclo 2 da
figura 1). A mistura resfriada e os iniciadores se hibridam s molculas de fita simples
(Hibridao, ciclo 2). A DNA polimerase adicionada reao e os deoxinucleotdeos
so adicionados ao final 3' dos iniciadores hibridados, formando quatro molculas de fita-
dupla (Sntese de DNA, ciclo 2). Note que duas das fitas recm-sintetizadas comeam e
terminam nos stios de hibridao dos iniciadores.
Este processo de desnaturao, hibridao e sntese de DNA se repete de 25 a 45 vezes,
resultando em um grande nmero de molculas. A grande maioria das molculas recm-
sintetizadas vai de um stio de hibridao do iniciador ao outro. Ento, o pesquisador
47
pode escolher qual segmento ser amplificado atravs da escolha dos iniciadores. Hoje a
PCR utilizada rotineiramente para muitos propsitos diferentes: para amplificar um
fragmento especfico de DNA para clonagem, para gerar um fingerprint de uma amostra
muito pequena de DNA, para o diagnstico de doenas, etc.
Um aperfeioamento tcnico do processo tornou a PCR muito mais fcil. Voc notou que
a DNA polimerase foi adicionada antes de cada sntese de DNA? Isto porque as
primeiras PCR utilizavam a DNA polimerase da Escherichia coli, a qual inativada sob
alta temperatura. Ento, a enzima deveria ser acrescentada a cada ciclo de sntese.
Posteriormente, foram isoladas enzimas de microrganismos que vivem em guas
ocenicas profundas. Estas enzimas no so inativadas pelo calor e resistem s
temperaturas elevadas necessrias para a sntese do DNA. Hoje a PCR realizada com
DNA polimerases resistentes ao calor, e ento adicionada apenas uma vez no incio da
reao. A DNA polimerase mais utilizada a Taq DNA polimerase (proveniente da
bactria Thermus aquaticus).
Quando a PCR foi desenvolvida, utilizava-se trs banhos-Maria com as temperaturas
necessrias para desnaturao, hibridao e sntese do DNA. Os pesquisadores
transferiam os tubos de um banho para outro. Posteriormente foi desenvolvida uma
mquina que altera rapidamente as temperaturas necessrias, chamada de termociclador.
Hoje a PCR realizada atravs da adio de DNA, iniciadores, tampo,
deoxinucleotdeos e DNA polimerase em um tubo e este levado ao termociclador, que
pode ser programado com as temperaturas e o nmero de ciclos necessrios, e espera-
se at que os ciclos tenham sido completados (cerca de 2 a 4 horas).
Porm, s se aprende a fazer PCR com a prtica. E por isso voc vai simular uma PCR e
um teste diagnstico baseado em PCR no papel (voc pode pintar o DNA-molde, os
iniciadores e as molculas recm-sintetizadas para facilitar a sua compreenso).




48
Ciclo 1 Ciclo 2
Fita-dupla de DNA parental Desnaturao



Iniciadores
de fita simples


Desnaturao

Hibridao



Hibridao




Sntese do DNA

Sntese do DNA





Figura 1. PCR
TCGAA 3
3 GGGCC
5 CCCGG AGCTT 3
5 CCCGG AGCTT 3
5 GGGCC TCGAA 3
CCCGG
5
CCCGG
5
TCGAA
3
TCGAA
3
5 CCCGG AGCTT 3
TCGAA
5
5 GGGCC TCGAA 3
CCCGG
5
3 GGGCC
5 CCCGG AGCTT 3
TCGAA
5
5 CCCGG AGCTT 3
5 GGGCC TCGAA 3
5 GGGCC TCGAA 3
5 TCGAA 3
CCCGG
3 GGGCC
TCGAA
5
5 GGGCC TCGAA 3
5 TCGAA 3
CCCGG
5 CCCGG AGCTT 3
TCGAA
5
3 GGGCC
TCGAA
5
CCCGG
5
5 TCGAA 3
CCCGG
TCGAA
5
5 GGGCC TCGAA 3
CCCGG
5
5 CCCGG AGCTT 3
TCGAA
5
3 GGGCC
TCGAA
5
CCCGG
5
3 GGGCC
5 TCGAA 3
CCCGG
TCGAA
5
TCGAA 3
5 GGGCC TCGAA 3
CCCGG
5
etc
49

Questes
1. O que um cientista deveria saber antes de desenvolver um teste de diagnstico
baseado na PCR para o vrus X?
2. Como um cientista pode se assegurar de que os iniciadores que ele desenvolveu vo
hibridar apenas com o segmento de DNA que ele deseja amplificar?
3. Escreva uma expresso matemtica que prediz o nmero de molculas geradas a
partir de uma nica fita-dupla de DNA aps n ciclos de sntese.
4. Prediga o nmero de fitas de DNA produzidas que no so delimitadas pelos
iniciadores e que seriam geradas a partir de uma molcula de DNA de fita-dupla aps
n ciclos de sntese.
5. Voc poderia amplificar um DNA utilizando apenas um iniciador? Quais seriam os
produtos aps um ciclo? Dois ciclos? Quatro ciclos?

50
Molcula de DNA parental e iniciadores para a PCR



















5 TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
5 TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
5 TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
5 TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
5 CCCGG 5 CCCGG
5 CCCGG 5 CCCGG
51
Amostras de DNA e iniciadores para o diagnstico baseado na PCR





























3 ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
3 ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
3 ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
3 ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
3 TCGAA
3 TCGAA
3 TCGAA
3 TCGAA
52
GENTICA MOLECULAR

1. A bactria Xenobacterium giganticus produz uma endonuclease de restrio. Segundo
a conveno para a denominao destas enzimas, como voc poderia classific-la?
2. A seqncia abaixo representa um pequeno fragmento de DNA que contm um stio de
reconhecimento palindrmico de 6 bases:
GACGATATCAACT
Qual a seqncia deste stio de reconhecimento?
3. Algumas enzimas de restrio reconhecem stios de 5 bases no DNA. Qual a
freqncia destes cinco stios de bases?
4. Abaixo esto os stios de reconhecimento de 4 enzimas de restrio:
Obs.:Os stios de clivagem esto indicados pelas setas.
Quais destas enzimas criaro finais coesivos (complementares) compatveis? Qual a
seqncia deste final compatvel?


+
BamHI GGATCC
CCTAGG
|

+
EcoRI GAATTC
CTTAAG
|

+
HindIII AAGCTT
TTCGAA
|


+
BglII AGATCT
TCTAGA
|

53
5. Suponha que voc corte duas seqncias de DNA diferentes, uma com BamHI e ento
ligue-os atravs de seus finais coesivos compatveis. Uma vez unidos, voc poderia
separar estes dois DNAs novamente com outra enzima de restrio. Por que sim ou
por que no?
6. Suponha que voc transforme uma bactria com um DNA recombinante e, por um erro,
plaqueie as clulas transformadas em um meio faltando qualquer antibitico. Qual o
resultado que voc observaria. Por que?
7. possvel usar antibiticos para determinar se o plasmdeo pBR322 recebeu um DNA
inserido em seu stio de EcoRI? Porque sim ou no?


54
GENTICA MOLECULAR

1. Voc est aconselhando um casal grego porque os dois indivduos so portadores de
|-talassemia. Eles tm um filho cuja anlise demonstrou normalidade (no portador) e
desejam saber se na gestao atual o feto afetado. Voc obtm o DNA fetal por
amniocentese. Usando uma sonda de 10Kb 5 do gene |, que detecta um RFLP HincII,
voc obtm o seguinte padro:

7,6

1 2 6,0


3,0
3 4
1 2 3 4

Analise o padro de bandas e verifique se o feto normal, portador ou afetado.

2.O stio da enzima de restrio BclI TGATCCA. Suponha os cromossomos 1 e 2. No
cromossomo (1) h trs stios de reconhecimento da enzima BclI com 5Kb e 2Kb de
tamanho. O cromossomo (2) apresenta apenas um fragmento de 7Kb aps a digesto
por essa enzima. Usam-se sondas especficas que reconhecem seqncias de 5Kb e
de 2Kb assim como uma sonda intermediria entre 5 e 2Kb. Esquematize os
resultados de um Southern blotting para os indivduos 1.1, 1.2 e 2.2 para os trs tipos
de sondas.






55
3. Qual a seqncia do fragmento de DNA abaixo:

ddATP ddCTP ddTTP ddGTP



























4. Voc deseja clonar um gene que se expressa no fgado e suspeita que esteja envolvido
numa doena gentica. Tanto a biblioteca do DNA genmico como a biblioteca do
cDNA esto disponveis. Qual delas voc escolheria e por que?
5. Quais so as vantagens ou desvantagens de tecnologia da PCR para o diagnstico de
doenas genticas em comparao com a tcnica de Southern blotting?
6. Em quais dos tecidos abaixo relacionados possvel obter amostras de DNA para
procedimentos diagnsticos: bipsia de tecidos, linfcitos, clulas cultivadas de lquido
amnitico, clulas vermelhas, fio de cabelo, ossos de cadveres, tecido em parafina.
7. Suponha que voc deseja clonar o gene de um organismo X, que codifica um certo
tRNA. Voc possui o tRNA purificado, um plasmdio de E. coli que contm um nico
stio de reconhecimento pela enzima EcoRI e tambm confere resistncia a ampicilina.
Como voc clonaria o gene de interesse?
56
8. Molculas de DNA de trs diferentes fontes so desnaturadas pelo calor. A razo de
GC/AT foi (1,0), (0,88) e (1,2). Qual amostra se dissociar em temperaturas mais
baixas e mais altas? Por que?
9. Voc deseja isolar a seqncia codificadora de determinado gene, mas todas as
tentativas iniciais falharam. Voc capaz de determinar a estrutura primria da
protena codificada por este gene. Qual a soluo para o problema?



57
GENTICA MOLECULAR

01. Voc isolou e clonou um segmento de DNA que conhecido como sequncia nica
no genoma. Este segmento est mapeado prximo ao telmero do cromossomo X e
tem 10Kb de comprimento. Voc marcou o final 5 com
32
P e clivou a molcula com
EcoRI. Voc obteve dois fragmentos: um com 8.5Kb e outro com 1.5Kb. Voc
separou o fragmento de 8.5Kb em duas fraes, digerindo um deles com HaeIII e o
outro com HindII. Aps a separao de cada amostra em um gel, obteve-se os
seguintes resultados por auto-radiografia:

HindII HaeIII








origem

Tire o mapa das enzimas de restrio da molcula completa de 10Kb.

02. Voc purificou uma molcula de DNA e deseja mapear os stios das enzimas de
restrio. Aps a digesto com EcoRI voc obteve os fragmentos 1,2,3 e 4. Aps a
digesto de cada um desses fragmentos com HindII voc obteve o fragmento 3 com
dois subfragmentos (3.1 e 3.2) e o fragmento 2 com trs subfragmentos (2.1, 2.2 e
2.3). Aps a digesto da molcula inteira com HindII voc encontrou quatro pores
(A, B, C e D). Quando essas pores so tratadas com EcoRI, o pedao D contm os
fragmentos 1 e 3.1; A contm os fragmentos 3.2 e 2.1 e B contm 2.3 e 4. O pedao C
idntico a 2.2. Tire o mapa de restrio.

03. A doena de Huntington (HD) uma desordem neurodegenerativa letal com herana
autossmica dominante. Pelo fato dos sintomas geralmente no surgirem at a
terceira, quarta ou quinta dcadas, os pacientes com HD geralmente j tiveram filhos e
58
alguns deles j herdaram o alelo mutante. Uma sonda clonada (G8) revelou um
polimorfismo de DNA relevante HD. A sonda e seus quatro tipos de hibridizao com
o DNA so mostrados abaixo, as linhas verticais representam os stios de corte da
enzima HindIII.



17.5 3.7 1.2 2.3 8.4
DNA A
17.5 4.9 2.3 8.4
DNA B
15 3.7 1.2 2.3 8.4
DNA C
15 4.9 2.3 8.4
DNA D
************************************* Homologia da sonda G8


(a) Tire o Southern blot esperado das clulas das pessoas que so homozigotas (AA,
BB, CC e DD) e de todos os heterozigotos. Eles so todos diferentes?
(b) Quais diferenas existem em termos de stios de restrio?
(c) Uma familia com HD foi checada para determinar seu tipo de hibridizao sonda G8.
Os resultados so os mostrados abaixo, onde os smbolos negros indicam a presena
da doena. Quais ligaes voc visualiza?
(d) Como estes dados podem ser teis na descoberta do defeito primrio?
(e) Poderiam estes dados ser teis no aconselhamento gentico de outras doenas que
no a HD?
(f) H indivduos excepcionais na genealogia? Quais e por que?
(g) Se uma mulher de 20 anos da genealogia abaixo deseja aconselhamento gentico, o
que voc faria e o que poderia prever de cada gestao?



59
04. Estudos de DNA so feitos numa grande famlia que mostra uma certa doena
autossmica dominante que aparece ao redor dos 40 anos. Uma amostra de DNA de
cada famlia foi digerida com a enzima de restrio TaqI e foi submetida eletroforese.
Um Southern blot foi ento feito usando uma sonda radioativa. A auto-radiografia
mostrada abaixo:
1 2





3 4 5 6 7 8 9 10 11



Autoradiograma
(migrao)
5Kb

3Kb
2Kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11


(a) Analise totalmente a relao entre a variao de DNA, a sonda e o gene da doena.
Mostre as regies cromossmicas relevantes.
(b) Como voc explicaria o ltimo filho (II-11)?
(c) Quais desses resultados poderiam ser usados no aconselhamento gentico
de pessoas dessa famlia que subseqentemente se casariam?


60
Extrao de DNA de linfcitos do sangue perifrico
Mtodo no fenlico

1. Coletar sob condies estreis 5-10mL de sangue perifrico com anticoagulante.
Transferir todo o volume para um tubo de centrfuga de 50mL e adicionar 15mL de
PBS.
2. Centrifugar a 2200rpm durante 10 minutos. Descartar o sobrenadante.
3. Adicionar tampo de lise de clulas vermelhas. Completar para 45mL. Ressuspender e
centrifugar a 1500rpm durante 30 minutos.
4. Descartar o sobrenadante. Repetir esta etapa (3) at a obteno de um pellet limpo.
5. Ressuspender o pellet em 5ml de tampo de lise de clulas brancas (Tris-EDTA-
SDS). Manter em banho-Maria 60C durante 10 minutos.
6. Adicionar um volume igual de acetato de amnio 4M e agitar vigorosamente.
7. Adicionar igual volume de isopropanol e agitar suavemente at o aparecimento do
precipitado de DNA.
8. Secar temperatura ambiente. Ressuspender em gua destilada estril.

Sol ues:
1. Tampo de lise de clulas vermelhas (concentrao 10X):
Tris-base 6,05g
MgCl2 2,39g
NaCl 2,90g
gua qsp 1L

2. PBS (concentrao 10X):
NaCl 8,5g
Na2HPO4 1,115g
KH2PO4 0,2g
gua qsp 100mL

3. Tampo de lise de clulas brancas:
100mM de Tris-HCl pH 8,0
50mM de EDTA pH 8,0
500mM de NaCl

4. Soluo de SDS (Sodium Dodecil Sulphate) a 20%.
5. Soluo de acetato de amnia 4M.
61
Receita caseira para isolar o DNA de uma cebola

1. Pegue uma cebola grande, com cerca de 250g, e pique-a em pedaos quadrados com
cerca de 5mm.
2. Em outro recipiente, misture 100mL de detergente de louas, 30g de sal de cozinha e
complete com gua at formar 1L de soluo.
3. Mexa bem.
4. Separe 100mL dessa soluo e junte a ela a cebola picada.
5. Coloque em banho-Maria a 60C por 15 minutos.
6. Em seguida, resfrie rapidamente a mistura colocando o recipiente em uma bacia de
gelo; mexa-a bem.
7. Coe a mistura em um filtro de papel para caf; jogue fora o bagao e coloque o
lquido resultante em um tubo de ensaio.
8. Despeje delicadamente etanol (95%) no tubo de ensaio; o DNA sobe para o etanol,
no qual no solvel, ficando preservado.




62
Preparo do DNA para o mini-gel

1. Acrescentar 2,5 volumes de etanol 95% (gelado), para cada volume de soluo de
DNA.
2. Tampar o recipiente e colocar no freezer por duas horas.
3. Colocar na centrfuga (10000rpm) por 25 minutos.
4. Lavar com etanol 75% (gelado).
5. Gelar at secar o etanol.
6. Acrescentar 2mL de tampo T.E.
7. Gelar durante uma noite.
8. Acrescentar 1L de corante para cada 8L de soluo.
9. Levar ao mini-gel durante uma hora.