OBSERBACION Y CONTAJE MICROSCOPICO

ANALISIS DE JUGO DE NARANJA Y NARANJADA

YORLAIS ARROYO CI: 92.641.956






Republica Bolivariana de Venezuela
La Universidad del Zulia
Facultad Experimental de Ciencias
Maestra en: Microbiologa
Tpico especial en microbiologa de alimentos


Maracaibo, julio, 20011
INTRODUCCION
Los microorganismos estn presentes en el ambiente natural del hombre, incluso
en l mismo y en todos los seres vivos (plantas y animales) de los que se
alimenta. De hecho, cualquier producto alimenticio, transformado o no, que el
hombre consume, puede estar contaminado por microorganismos, los cuales
pueden ser causantes de intoxicaciones y toxiinfecciones graves. (Bourgeois y
col., 1994)
La enfermedad transmitida por los alimentos ha sido definida por la Organizacin
Mundial de la Salud (OMS) como una enfermedad de carcter infeccioso o txico
causada por el consumo de alimentos o de agua. (Adams y Moss, 1997).
Las normas en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad
microbiolgica en trminos de microorganismos indicadores. stos son
organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o
contaminacin que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos
patgenos en alimentos. Adems de que su deteccin en el laboratorio es ms
sencilla, rpida y/o econmica, los microorganismos indicadores permiten un
enfoque de prevencin de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o
contaminacin (Koburger J, 1984).
Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:
Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso: mesfilos
aerobios, cuenta de hongos y levaduras, cuenta de coliformes totales
Indicadores de contaminacin fecal: coliformes fecales, E. coli, Enterococos.
La seleccin de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los
riesgos implicados y de lo que se requiera saber para controlar o mejorar el
alimento.
Mesfilos aerobios:
Esta determinacin indica el grado de contaminacin de una muestra y las
condiciones que han favorecido o reducido la carga microbiana. Desde luego, no
se aplica a alimentos fermentados, y puede dar escasa informacin sobre el
manejo del alimento cuando ste es poco favorable para el desarrollo microbiano
por su pH. Este grupo es un indicador importante en alimentos frescos,
refrigerados y congelados, en lcteos y en alimentos listos para consumir)
(Koburger J, 1984).

Cuenta de hongos y levaduras:
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el
ambiente, por lo que son frecuentes en la microbiota habitual de muchos
alimentos; se dispersan fcilmente por el aire y el polvo. Debido a su crecimiento
lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los
alimentos donde las condiciones no favorecen el crecimiento bacteriano, por
ejemplo: pH cido, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja
temperatura de almacenamiento. Como grupo indicador son tiles para evidenciar
grado general de contaminacin en alimentos con estas caractersticas o cuando
los mesfilos aerobios no son tiles, como en alimentos fermentados (Koburger J,
1984).
Cuenta de coliformes totales
Las bacterias del grupo coliforme se definen como: bacilos cortos, Gramnegativos,
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa a 35 C, en
menos de 48 h, con produccin de cido y gas. Actualmente se consideran un
excelente indicador de la eficiencia de los procesos de sanitizacin y desinfeccin,
as como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos
procesados.













OBJETIVOS

Relacionar las caractersticas de los alimentos con los indicadores que
pueden contaminarlos.

Interpretar los resultados de la presencia de indicadores con la calidad
microbiolgica de los alimentos.

Establecer si un alimento cumple con la normatividad vigente.

Aplicar mtodos de muestreo adecuados para la determinacin de los
indicadores.

Realizar adecuadamente la tcnica de vertido en placa para diversos
grupos microbianos de importancia en alimentos.















METODOLOGIA
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un
alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no
pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de
cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxgeno, permiten
seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes
alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias son un indicador
general de la poblacin que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto,
de la higiene con que ha sido manejado el producto (Camacho, A., et al 2009).
La tcnica se fundamenta en contar las unidades formadoras de colonias o UFC
presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que
desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de
incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un
agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que
las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo
(Camacho, A., et al 2009). (ver figura 1. Donde se describe la tcnica de vertido
en placa).
Los microorganismos indicadores y los medios de cultivo utilizados en la prctica
calidad microbiolgica de jugo de naranja y naranjada fueron los siguientes:
ANALISIS DE JUGO DE NARANJA
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS: El Agar Papa y dextrosa es un medio
utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos,
el cual puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el
crecimiento bacteriano.
La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la produccin
de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos sealan bajar el
pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento
bacteriano.
Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los hongos
crecen como colonias difusas y de varios colores. La cuenta del nmero de
colonias se relaciona con el factor de dilucin de la muestra, para determinar el
nmero de microorganismos por gramo o mililitro de muestra.
CONTEO DE ACIDURICOS: se utilizo el agar thermoaciduranas para el
aislamiento de Bacillus thermoacidurans de los procesos alimentarios
Composicin en g / L:
Proteasa peptona: 5,00
Extracto de levadura: 5.00
Dextrosa: 5,00
Fosfato dipotsico: 4,00
Sulfato de manganeso: 0,20
Agar: 20.00
El pH final (a 25 C): 5.0 0.
ANALISIS DE NARANJADA
RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS: este fue realizado en de agar (PC) el
cual es un medio de cultivo utilizado para evaluar o controlar "total" o viable el
crecimiento de bacterias de una muestra. El PC no es un medio selectivo.
La composicin del PC puede variar pero normalmente contiene
0,5% de peptona
0,25% de extracto de levadura
0,1% de glucosa
1,5% de agar
pH neutro a 25 C .
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS: El Agar Papa y dextrosa es un medio
utilizado para el cultivo de hongos y levaduras a partir de muestras de alimentos,
el cual puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el
crecimiento bacteriano.
La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la produccin
de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos sealan bajar el
pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir el crecimiento
bacteriano.
Las levaduras se observan como colonias de color crema o blanco. Los hongos
crecen como colonias difusas y de varios colores. La cuenta del nmero de
colonias se relaciona con el factor de dilucin de la muestra, para determinar el
nmero de microorganismos por gramo o mililitro de muestra
MEDIO UTILIDADO COMO DILUENTE:
Fue utilizada como diluente el agua Peptonada por ser un medio de
enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solucin
fisiolgica para recuperar clulas daadas por procesos fisicoqumicos, a los que
ha sido sometido el alimento.
Figura 1. Tcnica de vertido en placa
Realizar diluciones decimales empleando tubos con 90 ml
10 ml de muestra en 90 ml 10 ml en 90 del 10 ml en 90 del
del diluente diluente diluente

Muestra 10-1 10-2 10-3
Depositar 1.0 mL de cada dilucin en
Cajas de Petri estriles por duplicado
1.0 ml 1.0 ml 1.0ml


Adicionar de 12 ml de agar fundido y enfriado a 45C en
Homogeneizar la muestra y el Agar mediante

Incubar las cajas en posicin invertida
Contar aquellas placas que tengan entre
25 a 250 colonias y reportar como ufc por ml de muestra
ANALISIS DE JUGO DE NARANJA
Identificacin de la muestra:
La muestra utilizada proviene de jugos de naranja concentrados de venta pblica
en la ciudad de Maracaibo estado Zulia a la cual se le realizo en anlisis para la
identificacin de aciduricos y mohos y levaduras procediendo segn la norma
COVENIN 1126-89.
Preparacin de diluciones decimales
Se mide 10 ml de la muestra y se transfieren a un frasco de dilucin que contenga
90 ml de agua peptonada al 0,1% (diluyente), as se obtuvo la dilucin 1:10. Se
prepararon diluciones decimales a partir de esta primera dilucin, dos veces ms,
y se obtuvo las diluciones 10-2, 10-3 de la misma forma como se realizo la primera
dilucin.
Determinacin de mohos y levaduras:
Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri
por duplicado.
Se aade a cada placa 12 ml del medio PDA previamente fundido a 45
grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una
superficie plana.
Se invierten las placas y se incuban a oscuridad a una temperatura de 20
25 grados durante 3 a 5 das.
Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las
placas donde aparezcan entre 10 y 100 colonias, Con la ayuda de un
cuenta colonias. Se cuentan todas las colonias de mohos y levaduras por
separado y se multiplica por la concentracin correspondiente.
Determinacin de aciduricos:
Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri
por duplicado.
Se aade a cada placa 12 ml del medio thermoaciduranas previamente
fundido a 45 grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren
en una superficie plana.
Se invierten las placas y se incuban a temperatura de 20 a 25 grados
durante 3 a 5 das al abrigo de la luz.
Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las
placas donde aparezcan entre 10 y 100 colonias, Con la ayuda de un
cuenta colonias y se multiplica por la concentracin correspondiente.

ANALISIS DE JUGO DE NARANJADA
Identificacin de la muestra
Segn la norma COVENIN 1701-93 para el anlisis microbiologico de naranjadas
pasteurizadas esta se define como el producto preparado a partir de jugo de
naranja o su concentrado no fermentado, extrados de naranjas maduras, sanas y
limpias de la especie citrus sinensis, adicionando agua potable con o sin
edulcorantes.
El producto utilizado en esta prctica fue jugo de naranja al 60% de la empresa
MERILAC, el cual es un jugo de naranja pasteurizado con registro del MPPS N
A84.070. Envasado por la empresa PANAMERICANA LACTEOS CA. Caja seca
estado Zulia.
Preparacin de diluciones decimales
Se mide 10 ml de la muestra y se transfieren a un frasco de dilucin que contenga
90 ml de agua peptonada al 0,1% (diluyente), as se obtuvo la dilucin 1:10. Se
prepararon diluciones decimales a partir de esta primera dilucin, dos veces ms,
y se obtuvo las diluciones 10-2, 10-3 de la misma forma como se realizo la primera
dilucin.
Determinacin de mohos y levaduras:
Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri
por duplicado.
Se aade a cada placa 12 ml del medio PDA previamente fundido a 45
grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una
superficie plana.
Se invierten las placas y se incuban a oscuridad a una temperatura de 20
25 grados durante 3 a 5 das.
Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las
placas donde aparezcan entre 10 y 100 colonias, Con la ayuda de un
cuenta colonias. Se cuentan todas las colonias de mohos y levaduras por
separado y se multiplica por la concentracin correspondiente.
Determinacin de aerobios mesfilos
Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones respectivas en placas de Petri
por duplicado.
Se aade a cada placa 12 ml del medio PC previamente fundido a 45
grados, se mezcla conveniente mente y se deja solidificaren en una
superficie plana.
Se invierten las placas y se incuban a 32 durante 48 horas.
Finalizado el periodo de incubacin se seleccionan preferentemente las
placas donde aparezcan entre 30 y 300 colonias, Con la ayuda de un
cuenta colonias. Se cuentan todas las colonias y se multiplica por la dilucin
correspondiente y se expresa el resultado como estimado del recuento
estndar.













RESULTADOS
JUGO DE NARANJA: los resultados se expresan como UFC/ml de muestra

1x 10-1 promedio de las 2
Placas x la respectiva dilucin
1x10-2 promedio de las 2
placas x la respectiva dilucin
1x10-3 promedio de las dos
placas x la respectiva dilucion
Aciduricos Muy numeroso 3.1x10
3
1x10
1

Levaduras Muy numeroso 2.6x10
3
1x10
1

Mohos 1x10
1
1x10
1
1x10
1





NARANJADA:


1x 10-1 promedio de las 2
Placas x la respectiva dilucin
1x10-2 promedio de las 2
placas x la respectiva dilucin
1x10-3 promedio de las dos
placas x la respectiva dilucin
Aerobios
mesfilos
1.14x10
3
1x10
1
1x10
1

levaduras 2.15x10
2
1x10
1
1x10
1

mohos 1x10
1
1x10
1
1x10
1










DISCUSIN
La presencia de los microorganismos en los alimentos en ocasiones puede ser
inevitable, por ello es importante conocer a partir de qu lmites o en que
condiciones se torna inaceptable o impropio para el consumo. En Venezuela estos
limites estn regulados por la comisin venezolana de normas industriales
ministerio de fomento (COVENIN).
En esta prctica de laboratorio fueron evaluadas la calidad microbiolgica del jugo
de naranja y un subproducto de este denominado naranjada con las respectivas
indicaciones que sus normas revelaban. Para el anlisis del jugo de naranja fue
utilizada la normativa COVENIN 3123.1994 y 16699:1994 en la cual se exigen el
requisito de anlisis en conteo de aciduricos, mohos y levaduras y para el anlisis
de naranjada se realizo el conteo de aerobios mesfilos, mohos y levaduras como
lo confronta la norma 1701-93.
Para el anlisis de jugo de naranja se encontr un valor de aciduricos en la
dilucin 1:10 incontable para ser reportado. En la dilucin 1:100 el valor fue de
3.1x10
3
el cual al ser confrontado con lo que dice la norma 1x10
3
- 1x10
4
entra o
cabe en el rango establecido para su consumo e inocuidad como alimento. En la
dilucin 1:1000 no se encontr crecimiento por lo cual se reporta como indica la
normativa con un valor menor que uno multiplicado por la menor dilucin utilizada,
en este caso se reporta como 1x10
1
. Cabe mencionar que se utilizo la tcnica de
vertido en placa ya que es la ms utilizada para estos anlisis. La finalidad de
dicha tcnica no es poner en evidencia todos los microorganismos aciduricos que
deterioran los alimentos, sino que nicamente proporciona una estimacin de la
cifra realmente presente y refleja la posible vida de del jugo.
Con referencia a los mohos no fue encontrado resultados de su presencia por lo
que se reporta como valor 1x10
1
como lo sugiere la norma.
Con referencia a las levaduras los valores obtenidos en la primera dilucin 1:10
fueron incontables para su reporte por su crecimiento abundante y no fcil de
contabilizar. En la dilucin 1:100 el valor fue de 2.6x10
3
dicho valor sobrepasa al
valor mximo de aceptacin sugerido por la norma COVENIN 1337- 90 el cual es
de 1x10
3
. La dilucin 1:100 no se obtuvo crecimiento de estos microorganismos
por lo cual se reporta como menor a 1 multiplicado por la menor dilucin (1x10
1)
.
De cierta forma ha de esperarse estos valores altos de lavaduras en estos jugos
ctricos debido a las condiciones de PH acido en la que se encuentran, la cual es
una de las caractersticas fundamental para el desarrollo de estos, otra
caractersticas de esta bebida que podra favorecer su proliferacin es la baja
temperatura de almacenamiento en la que estos se conservan, sin lugar a dudas
es importante realizar estos controles de mohos y levaduras en estas bebidas por
que son indicadores del grado general de contaminacin y tambin de aparicin
de hongos toxignicos.
Con referencia al anlisis de la naranjada esta es definida segn la norma
COVENIN 1701-93 como el producto preparado a partir del jugo de naranja o su
concentrado, no fermentado, extrado de naranjas maduras, sanas y limpias de la
especie citrus sinensis adicionando agua potable ,con o sin edulcorantes sometido
a tratamiento trmico adecuado que asegure su conservacin. La naranjada a
evaluar fue la de la empresa MERILAC la cual ofrece un producto al 60% de jugo
de naranja pasteurizado, con registro en el MPPS N A 84.070.
Los anlisis microbiolgicos utilizados fueron el de aerobios mesfilos, mohos y
levaduras en los cuales se obtuvieron los siguientes resultados.
Para el recuento de aerobios mesfilos fue utilizada la Norma Venezolana
COVENIN 902-87. (Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa de
Petri) El recuento se realizo en las placas que tenan un valor entre 30-300
colonias. En la dilucin 1:10 se encontr un valor de 1.14x10
3
el cual sobrepasa el
valor mximo de aceptacin que es de 1x10
3
. En las diluciones 1:100 y 1.100 no
se encontr microorganismos correspondientes lo cual se reporta como sugiere la
norma menor a uno multiplicado por la menor dilucin (1x10
1
).
Esta determinacin se realiza para conocer el grado de contaminacin de la
muestra y las condiciones que han favorecido o reducido la carga microbiana lo
que nos coloca a pensar si hubo falla alguna en el proceso de pasteurizacin o en
el manejo del producto por sus operadores debido a que las condiciones de PH en
las que se encuentra la bebida son desfavorables para el desarrollo de bacterias.
Para el recuento de mohos y levaduras fue utilizada la norma COVENIN 1337- 90.
(Mtodos para el recuento de mohos y levaduras) la cual indica que el recuento
debe realizarse en las placas que contengan valores de colonias entre 10 y 100.
Con referencia a los mohos en particular no se encontr desarrollo de estos en las
diferentes diluciones reportndose como sugiere la norma menor que uno
multiplicado por la menor dilucin (1x10
1
). Con referencia a las levaduras se
encontr crecimiento en la dilucin 1:10 con valores ufc de 2.15x10
2
el cual

sobrepasa al valor mximo establecido por la norma que es de 1x10
1
.En las otras
diluciones1:100 y 1:100 hubo crecimiento pero estas no se encontraron en el
rango correspondiente que va desde 10 hasta 100. Como se menciono en el
anlisis de jugo de naranja las condiciones propias de estos jugos son un caldo de
cultivo apropiado para el desarrollo de estos microorganismos pero su utilidad
como indicador viene dada a que si estos pueden desarrollarse tambin lo pueden
hacer hongos productores de toxinas que ponen en riesgo a los consumidores.
Es importante resaltar que el producto conocido como naranjada de la empresa
MERILAC no eta proporcionando un producto en reglas con las normativas
venezolanas para el control de alimentos, tambin es claro que afirmar esto no es
a si de simple con solo este estudio se han de realizar muchos mas para llegar a
esta conclusin pero si debe ser una alerta para los medios de control y vigilancia
a tomar unas medidas rigurosas para el control de estos alimentos.





















REFERENCIAS
1. Adams M., Moss M. (1997). Microbiologa de los alimenos. Editorial Acribia.
Zaragoza, Espaa. Pp 176-382. ISBN 84-200-0830-3.

2. Bourgeois C., Mescle J., Zucca J. (1994). Microbiologa alimentaria,
aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial
Acribia. Zaragoza, Espaa. Pp 1, 217, 218. ISBN 84-200-0771-4.

3. Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez.
2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.
Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.


4. Koburger J. & Martha E. (1984) Yeasts and Molds. In: Compendium of
methods for the microbiological examination of foods. 2nd ed. Marvin S.
(Ed.) APHA. USA. 197-199.

5. NORMA COVENIN 1126-89.Alimentos. Identificacin y preparacin de
muestras para el anlisis microbiolgico (PRIMERA REVISION)

6. NORMA COVENIN 1701-93 Para el anlisis microbiolgico de naranjadas

7. NORMA COVENIN 3123.1994.Recuento de microorganismos aciduricos.

8. NORMA COVENIN 1337- 90 .Mtodos para el recuento de mohos y
levaduras.

9. NORMA COVENIN 902-87. Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias
en Placa de Petri

10. NORMA COVENIN 16699:1994.jugo de naranja