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CRECIMIENTO MICROBIANO
1. CICLO CELULAR Y CRECIMIENTO POBLACIONAL
Crecimiento se define como el incremento de componentes celulares, es decir el
aumento de masa y volumen. Desde el punto de vista poblacional el crecimiento es el
aumento del nmero de clulas.
El ciclo celular es la secuencia de sucesos que ocurren desde la formacin de una
nueva clula hasta la siguiente divisin. En la mayora de los procariotas esta secuencia
se le conoce como fisin binaria, algunos lo hacen por otros procesos. La fisin binaria
como su nombre lo indica es la divisin de la clula en dos y se trata de un proceso
relativamente simple: la clula se alarga, replica su cromosoma, estas molculas de
ADN migran hacia las futuras clulas hijas (los polos), se forma un septo transversal y
finalmente se separan las dos clulas hijas.


Figura 1. Fisin binaria

2

El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes
perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del
crecimiento mediante diversas metodologas.
Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas
individuales, esto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se
considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es
entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas.
Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de
formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos
viables, esto es capaces de crecer indefinidamente.
Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del
crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un
incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una
medida del crecimiento.
Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez
limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema
enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa.
2. CURVA DE CRECIMIENTO
La curva de crecimiento es la representacin grfica que se usa para estudiar el
crecimiento poblacional en un cultivo discontinuo. Se diferencian cuatro fases.

Figura 2. Grfica de la curva de crecimiento


3

2.1. Fase de latencia:
A este periodo se le conoce tambin como Fase lag y sucede cuando se han
introducido microorganismos en un medio de cultivo fresco, no se produce un
aumento de clulas. A pesar de no haber un aumento del nmero de clulas, si existe
un aumento de la biomasa debido a que los microorganismos estn sintetizando
nuevos componentes. La duracin de esta fase depende del estado de los
microorganismos y de la naturaleza del medio, esto se refiere si las clulas son viejas o
no, tambin a la composicin qumica del medio al que se han transferido.
2.2. Fase exponencial:
Conocida tambin como fase logartmica (log), sucede cuando los microorganismos se
multiplican a la velocidad mxima que les permite sus caractersticas propias (potencial
gentico, metabolismo, etc.) y las del medio (naturaleza del medio, condiciones de
cultivo, etc.).
La velocidad de crecimiento es constante, los intervalos de divisin celular son
regulares. En la grfica se presenta como una elevacin progresiva. Esta fase es ideal
para los estudios bioqumicos, debido a su uniformidad en sus caractersticas
poblacionales.
Esta fase se produce un crecimiento equilibrado, en donde los componentes celulares
son fabricados a tasas constantes. El traspaso de un cultivo de un medio pobre en
nutrientes a uno ms rico (shift up) o de modo contrario, de un rico en nutrientes a
uno pobre (shiftdown), se produce un crecimiento desequilibrado debido a que los
microorganismos necesitan adaptarse a las nuevas condiciones (sntesis de ribosomas,
de protenas y/o enzimas), por lo tanto en estos casos se produce una fase de latencia
ms larga antes de comenzar la fase exponencial.
Cuando el crecimiento microbiano se ve limitado por la baja concentracin de un
nutriente esencial, el crecimiento neto final es proporcional a la concentracin inicial
del nutriente limitante.

4


Figura 3. Efecto de las variaciones de la concentracin de un nutriente limitante sobre el
crecimiento y su efecto sobre la velocidad de crecimiento.

2.3. Fase estacionaria:
Esta fase se manifiesta en la grfica como una lnea horizontal. Se alcanza cuando la
poblacin tiene unas 10
9
clulas por mililitro. El tamao real de la poblacin depende
de la disponibilidad de nutrientes y de otros factores del medio. Esta fase se da
porque la divisin celular y la muerte celular se encuentran en equilibrio, otra
posibilidad es que la poblacin sigue siendo metablicamente activa, pero ya no se
multiplica.
2.4. Fase de Senescencia y Muerte
Desde un punto de vista clsico se deca que se alcanzaba esta fase cuando haba
cambios ambientales perjudiciales como la privacin de nutrientes y la acumulacin de
desechos txicos que causaban daos irreparables los cuales hacan que se perdiese la
viabilidad. Adems las clulas no se lisaban (su nmero permanecan constante), solo
moran.
Actualmente existen dos posiciones que ponen en duda esta visin clsica de esta fase.
Algunos expertos piensan que las clulas no han perdido su capacidad de reproducirse,
sino que son las condiciones de laboratorio las que no las permite crecer. A estas
clulas se les denomina clulas viables pero no cultivables (VBNC) y se piensa que
llegan a este estado producto de la activacin una clase de protenas conocidas como
protenas del hambre las cuales producen cambios fisiolgicos que permite la
supervivencia de los microorganismos en condiciones desfavorables. Las clulas VBNC
pueden reanudar la divisin cuando las condiciones les son ms favorables.
5

La otra postura hace referencia a la muerte celular programada. Propones que algunas
clulas estn genticamente programadas para activar su muerte celular y as
suicidarse para liberar sus nutrientes en beneficio de otras clulas.

Figura 4. Posturas sobre la Fase de muerte
3. MEDIDAS DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

3.1. Medida del nmero de clulas

3.1.1. Mtodos Directos

3.1.1.1. Cmaras de recuento: Petroff-Hausser
Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la
ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los
recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento
microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos
contados.
Para los recuentos microscpicos directos se usa un portaobjetos especialmente diseado
llamado Cmara de Petroff-Hausser. Una cavidad de volumen conocido esta excavada en la
superficie del portaobjetos y se cubre con un vidrio fino marcado con cuadros de un rea
conocida. La cavidad se llena con la suspensin bacteriana. Se calcula la medida del nmero
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de bacteria de cada una de las series de cuadrados y se multiplica por un factor que
proporciona el recuento por milmetro.
Las bacterias mviles son difciles de contar por este mtodo y como pasa con otros mtodos
microscpicos, las clulas muertas son demasiado similares a las vivas que se quieren contar.
Adems se requiere una concentracin bastante alta de bacterias, de unos 10 millones de
bacterias por mL. La principal ventaja es que no se necesita ningn tiempo de incubacin. Su
uso se reserva en situaciones en que el tiempo es el factor principal.

Figura 5. Cmara de recuento de Petroff-Hausser.
3.1.1.2. Contadores electrnicos de partculas

A. Contador de Coulter:
Un contador Coulter tpico posee uno o ms microcanales que conectan dos cmaras
conteniendo una solucin electroltica sobre las cuales hay aplicada una diferencia de
potencial. La solucin es forzada a fluir de una cmara a otra, arrastrando consigo las
partculas en suspensin que al atravesar el microcanal producen un breve cambio en
la resistencia del lquido. El contador detecta estos cambios en la resistencia elctrica.
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Las clulas, al tratarse de partculas muy poco conductoras, alteran la seccin
conductiva del microcanal, causando que la resistencia entre los extremos del
microcanal aumente y por lo tanto provocando que la corriente elctrica que atraviesa
el canal disminuya por un breve perodo de tiempo.
Al llevar un registro de los pulsos que ocurren en la corriente elctrica, se puede contar
el nmero de partculas presentes en un determinado volumen de fluido. La amplitud
del cambio en la corriente que atraviesa el microcanal se encuentra directamente
relacionado al volumen de la partcula, permitiendo medir la distribucin del tamao
de las partculas contadas.

Figura 6. Contador de Coulter
B. Citometra de flujo
La citometra de flujo es una tecnologa biofsica basada en la utilizacin de luz lser, empleada
en el recuento y clasificacin de clulas segn sus caractersticas morfolgicas, presencia de
biomarcadores, y en la ingeniera de protenas. En los citmetros de flujo, las clulas
suspendidas en un fluido atraviesan un finsimo tubo transparente sobre el que incide un
delgado rayo de luz lser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las clulas a travs
del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de deteccin, permitiendo hacer inferencias
en cuanto a tamao y complejidad de las clulas. Tambin permite el anlisis multiparamtrico
simultneo de otras caractersticas fsicas y qumicas, evaluando en promedio ms de dos mil
partculas por segundo.
8


Figura 7. Esquema del sistema de deteccin de un citmetro de flujo.
3.1.2. Mtodos indirectos:

3.1.2.1. Recuento de viables en placa
Es un mtodo de recuento de clulas viables (Clula viable es aquella capaz de dividirse
y originar descendencia). Se cuentan las clulas de una muestra que son capaces de
formar colonias cuando se inoculan en un medio de cultivo solido adecuado. Unas vez
inoculadas las placas se incuben a la temperatura adecuada y cuando aparecen, se
cuentan las colonias. Normalmente, una celula origina una colonia, pero con el fin de
evitar errores a la hora de dar el resultado se suele hablar de Unidades Formadoras de
Colonias (UFC), en lugar de clulas, el resultado se expresa como UFC/ml.

Existen dos formas de sembrar en placa:
Mtodo de extensin en placa

- Un cierto volumen de cultivo diluido, que no suele ser superior a 0.1 ml, se
extiende sobre la superficie de una placa con medio slido utilizando una
asa estril de extensin.
- La placa se incuba despus hasta que aparecen las colonias y se cuenta su
nmero.
9

- Para esto es importante que la superficie del medio este seca, de modo
que el lquido de la muestra se pueda absorber.
- No se suelen usar volmenes mayores de 0,1 ml porque el exceso de
lquido no es absorbido, y puede ser la causa de que las colonias se unan al
formarse, dificultando su recuento.

Mtodo del vertido en placa o mtodo de vaciado en placa

- Se pipetea un volumen conocido (normalmente 0,1-1,0 ml) de cultivo en
una placa petri estril
- Sobre la que se aade el medio con agar fundido y se mezcla bien
mediante un suave movimiento giratorio de la placa sobre la superficie de
la mesa, antes de dejar que se solidifique.
- Como la muestra se mezcla con el medio fundido, se pueden usar
volmenes de inoculo mayores que en el mtodo de recuento por
extensin.
- Sin embargo, para poder hacer uso de este mtodo, el organismo que se
cuenta debe ser capaz de resistir brevemente la temperatura del agar
fundido a 45C, sin perder su viabilidad.

Figura 8. Mtodos de siembra para el recuento en placa.
En la mayora de los casos antes de realizar la siembra las muestras tienen que diluirse
(diluciones seriadas):
Es importante que el numero de colonias que aparezcan en las placas no sea
demasiado grande, ya que en placas muy atestadas algunas colonias se podran
fusionar, provocando clculos errneos. Tambin es importante que el numero de
10

colonias no sea demasiado bajo para que el clculo sea estadsticamente significativo.
En la prctica, el nmero de colonias por placa oscila entre 30 y 300.
- Para obtener el nmero apropiado de colonias casi siempre se diluye la
muestra.
- Como raramente se sabe de antemano el nmero de clulas viables,
normalmente se hace ms de una dilucin. Es comn usar varias diluciones
decimales de la muestra.
- Para hacer una dilucin de 10-1 se mezclan 0,5 ml de la muestra con 4,5 ml de
diluyente o 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente. Si se necesita una
dilucin de 10-2, se puede mezclar 0,05 ml de la muestra con 4,95 ml del
diluyente o 0,1 ml con 9,9 ml.
- Por otra parte, una dilucin 10-2 se puede hacer de modo seriado haciendo
sucesivamente dos diluciones de tipo 10-1.
- En la mayora de casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la
dilucin final que se desea, por ejemplo si se requiere una dilucin 10-6, se
puede lograr haciendo tres diluciones sucesivas de 10-2 o seis sucesivas de 10-
1.
- El lquido usado para hacer las diluciones es importante y lo mejor es que sea
idntico al lquido utilizado para preparar el medio solidificado, aunque por
economa, es posible usar soluciones estriles de sales inorgnicas o un
amortiguador de fosfatos.
- Cuando se hacen diluciones es importante que se utilice una pipeta diferente
para cada dilucin, aun cuando sea de la misma muestra.

Figura 9. Diluciones seriadas.
Fuentes de error en el Recuento en Placa
El nmero de colonias que se obtiene en una determinacin de viables no solo
depende del tamao del inculo, sino tambin:
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- De lo adecuado que sea el medio de cultivo
- De las condiciones de incubacin,
- De la duracin de la incubacin.

o Las clulas depositadas en la placa no se desarrollaran todas en colonias a la
misma velocidad, y si se emplea un corto tiempo de incubacin, se
obtendrn menos colonias de las posibles.

o El tamao de las colonias no siempre es el mismo, y si se desarrollan
colonias muy pequeas pueden pasar desapercibidas en el recuento.

o Es habitual establecer las condiciones de incubacin (medio, temperatura y
tiempo) que permitan obtener el mayor numero de colonias para un
determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones.

o La determinacin de viables puede estar sujeta a grandes errores, y si se
desean recuentos precisos, se deben hacer con cuidado, y hacer las placas
de las diluciones por duplicado.

o Una agrupacin de dos o ms clulas solo producir una colonia, de modo
que el recuento de viables ser errneamente menor.

o El recuento de viables se expresa a menudo como unidades formadoras de
colonias obtenidas, ms que como nmero de clulas viables (ya que una
unidad formadora de colonias pudo originarse a partir de una o ms clulas
inciales).
Pese a estas dificultades el recuento de viables suministra buena informacin
sobre el nmero de clulas viables y este procedimiento se usa ampliamente.

Anomala del Recuento en Placa

o A pesar de ser una tcnica muy sensible, el recuento en placa puede ser
irrealizable cuando se trata del recuento de muestras naturales, tales como
suelo, o agua.

o El recuento directo en muestras naturales suele dar un nmero mucho
mayor de organismos que los que se obtienen en cultivo en placas de
cualquier tipo de medio de cultivo, algunos microbilogos se refieren a
este hecho como la gran anomala del recuento en placa, pero por qu
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los recuentos en placa dan menores nmeros de clulas que los recuentos
directos al microscopio? Esto se debe a una combinacin de factores:

- El hecho de que los mtodos microscpicos cuentan clulas
muertas, mientras que los mtodos de viables no.
- El hecho de que diferentes organismos, incluso en una muestra muy
pequea, tienen ciertos requerimientos nutricionales y de cultivo
muy diversos.

o Por lo tanto, aunque los recuentos en placa especficos con medios
altamente selectivos, como el anlisis microbiano de aguas residuales o de
alimentos, puede dar resultados fiables, los recuentos del nmero total de
clulas, pueden ser subestimados en varios rdenes de magnitud.

Figura 10. Tcnica del Recuento en placa.

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3.1.2.2. Recuento sobre filtros de membrana:
Los mtodos que dependen de la formacin de colonias (recuento en placa) o del
desarrollo de turbidez (nmero ms probable) pueden detectar una nica clula
microbiana viable, pero debido a razones prcticas, slo se utiliza alrededor de un
mililitro de la muestra como inculo para la placa o para el tubo. Por lo tanto, no se
detectan las poblaciones con menos de una clula por mililitro. Supongamos que
queremos determinar las bacterias que existen en una piscina. La muestra debe
concentrarse antes de proceder al recuento.
Son utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45
mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una
placa del medio de cultivo apropiado.

En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de la muestra a
travs de un filtro de membrana de tamao adecuado para retener a las bacterias
(0.22-0.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de
cultivo slido y se incuba. El recuento del nmero de colonias formadas sobre el filtro
determina el nmero total de bacterias en la muestra filtrada. Generalmente, los
resultados se expresan como organismos presentes por litro. Se utiliza con frecuencia
para determinar el nmero de bacterias en agua.



Figura 11. Tcnica de filtracin en membrana.


14

3.1.2.3. Nmero Ms Probable:
El mtodo del nmero ms probable (NMP), al igual que el mtodo de recuento en
placa, nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una
nica clula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio.
El NMP requiere la realizacin una serie de diluciones seriadas al dcimo de la muestra
de cultivo, en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo.
Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema.
Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se
examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o ms clulas
microbianas a partir de la muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no
recibieron ninguna clula permanecern transparentes.
A medida que se aumenta el factor de dilucin, se alcanzar un punto en el cual
algunos tubos contendrn tan slo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la
probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna clula, se puede determinar el
nmero ms probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando
para ello una tabla estadstica.
La precisin del nmero ms probable aumenta con el nmero de tubos que se usan,
aunque cinco tubos por dilucin se consideran como una relacin apropiada entre la
precisin y la economa.

El mtodo del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difciles de cultivar
en medio slido. Tambin se usa para determinar el nmero de clulas de un cultivo
mixto que pueden crecer en un medio lquido determinado.










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Figura 11. Diluciones para la tcnica NMP
3.1.2.4. Contadores de colonias:
Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias
o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar. Los primeros contadores
slo eran superficies iluminadas sobre las que se colocaba la placa, con las colonias
marcadas con un rotulador en la superficie externa de la placa mientras el operador
realizaba el recuento manual. Los contadores ms recientes intentan contar las
colonias por va electrnica, mediante la identificacin de reas individuales de
oscuridad y luz, de acuerdo a los umbrales definidos por el usuario, contando los
puntos en los que se aprecia contraste, o de modo automtico mediante registro
electrnico tras presionar con cualquier tipo de marcador.
Estos contadores se utilizan para estimar la densidad de microorganismos en un cultivo
lquido. Una dilucin adecuada, o varias diluciones en serie dentro del rango estimado
apropiado, se propaga utilizando una tcnica estril en la placa de agar, que se incuba
en las condiciones adecuadas para el crecimiento hasta que aparecen las colonias
individuales. Cada colonia marca el lugar donde se coloc un solo organismo
originalmente, con lo que el nmero de colonias en la placa es igual al nmero de
organismos en el volumen de lquido existente en la placa. Esta concentracin se
extrapola a partir de la dilucin practicada sobre el cultivo original, para estimar la
concentracin de organismos existentes en ese cultivo inicial.


Figura 12. Contador de colonias.
3.2. Medida de la masa celular:
La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada
frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un
constituyente metablico o qumico.
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Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero
pueden volverse complicados si se busca la exactitud.
3.2.1. Mtodos directos:

3.2.1.1. Determinacin del peso hmedo:

Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego
de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin.

Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas
bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular
que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y
deformacin celular.

Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que
queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin,
para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el
Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden
atravesar las paredes bacterianas.


3.2.1.2. Determinacin del peso seco:

El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se
encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un
horno a 105C hasta peso constante.

Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que
diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero
de bacterias.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula
pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la
muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el
ambiente tiene una humedad relativa alta.

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3.2.2. Mtodos Indirectos

3.2.2.1. Actividad metablica:
La magnitud de una actividad metablica concreta del cultivo es funcin de la masa
celular y por tanto es un mtodo indirecto de la estimacin de la masa del cultivo que
desarrolla dicha actividad.
La actividad metablica puede utilizarse, mediante varios procedimientos, para medir
indirectamente la cantidad de clulas microbianas. La tasa de formacin de productos
metablicos, tales como gases o cidos, que produce un cultivo, refleja la masa de
clulas presente en el mismo, Asimismo, la tasa de utilizacin de un substrato, como el
oxgeno o la glucosa, refleja la masa celular.
Finalmente, la tasa de reduccin de determinados colorantes, es otra forma de estimar
la masa microbiana. Por ejemplo, el azul de metileno se vuelve incoloro cuando es
reducido por los componentes de la cadena de transporte de electrones de los
microorganismos. Consecuentemente, en ausencia de oxgeno, que oxida el azul de
metileno, la tasa de decoloracin de este compuesto mide la masa microbiana. La tasa
de reduccin del colorante es una medida muy indirecta y, por lo tanto, no es una
medida precisa de la masa microbiana. Sin embargo, la tcnica puede utilizarse con
materiales complejos, como el suelo o la leche, sin necesidad de usar instrumentos.
3.2.2.2. Mtodo turbidomtrico:
La base comn de este mtodo consiste en la medicin de la cantidad de luz
dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.
Las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea
suspendida en agua (efecto Tyndall).
La dispersin de la luz es, dentro de ciertos lmites, proporcional a la masa del cultivo.
Cuantas ms clulas estn presentes, mayor ser la luz dispersada, y por lo tanto
mayor ser la turbidez.
A. Espectrofotmetro:
Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o
Bioqumica.
Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz
transmitida a travs de la suspensin).

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Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de
absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema; la sensibilidad de la
tcnica aumenta pues a longitudes de onda () cortas.
Es una tcnica exacta y precisa, ya que se basa de aspectos fsicos y qumicos de las
bacterias. Es un mtodo de recuento automatizado que da resultado con clculos
matemticos.
Sin embargo, presenta desventajas como:
La presencia de precipitado u otras sustancias producidas por las bacterias,
puede aumentar la turbidez.
Este mtodo no puede medir bacterias mviles.
No distingue clulas vivas de muertas.
Es impreciso si el nmero de microorganismos es escaso.

Figura 13. Espectrofotmetro.

B. Nefelmetro:
Es un instrumento para medir partculas suspendidas en un lquido, es un aparato
similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de
la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada
directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.
19


Figura 14. Nefelmetro.
3.2.2.3. Escala de MacFarland:
La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un
patrn. La finalidad, es establecer una relacin entre una precipitacin qumica y una
suspensin bacteriana.
Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados, 10 estndares.
Consiste en varios tubos de vidrio hermticamente cerrados que contienen 1% de
Cl
2
Ba + cantidades crecientes de SO
4
H
2
al 1%, por lo tanto en cada tubo se origina un
precipitado de SO
4
Ba, el que da origen a la turbidez, esto servir para crear un recta
patrn, de tal forma que se pueda detectar la concentracin de las diluciones
bacterianas de manera aproximada, ya que depende de factores como el tamao de la
bacteria.

Figura 15. Mtodo de MacFarland.

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Tabla 1. Tabla usada para la escala de MacFarland.

4. PARMETROS DE CRECIMIENTO
Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide a intervalos constantes.
Por ejemplo, supongamos que se inocula un tubo de ensayo con una clula que se
divide cada 20 minutos. La poblacin ser de 2 clulas despus de 20 minutos, de 4
clulas a los 40 minutos, y as sucesivamente. Como la poblacin se duplica en cada
generacin, el aumento de poblacin ser siempre de 2
n
, donde n es el nmero de
generaciones. El aumento de poblacin resultante es exponencial o logartmico.

Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de
individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de
generacin (). De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al cabo de
un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente:

N
0
= Nmero inicial de la poblacin
N
t
= Nmero final de clulas en un tiempo t
n = Nmero de generaciones en un tiempo t

Podemos inferir:

4.1 Nmero de generaciones (n).-

Es la cantidad de generaciones que ocurre en la fase exponencial.
Para expresar n a partir de la ecuacin N = N
0.
2
n
, se necesita hacer las siguientes
transformaciones:
N =N
0
2
n

logN = log N
0
+ n log 2
TUBO Cl
2
Ba 1% SO
4
H
2
1% u.f.c/ml
1 0,1 9,9 3,0x10
8

2 0,2 9,8 6,0x10
8

3 0,3 9,7 9,0x10
8

4 0,4 9,6 1,2x10
9

5 0,5 9,5 1,5x10
9

6 0,6 9,4 1,8x10
9

7 0,7 9,3 2,1x10
9

8 0,8 9,2 2,4x10
9

9 0,9 9,1 2.7x10
9

10 1,0 9,0 3,0x10
9

21

l o g N l o g N
0
= n l o g 2

Expresando n en funcin de trminos fcilmente medibles como N y N
0
, se
pueden calcular los tiempos de generacin y la velocidad de crecimiento.

4.2 Tiempo de Generacin (Tg).-
El tiempo de generacin es el tiempo requerido para que se duplique el nmero
de clulas, por lo que al tiempo de generacin se le llama tambin TIEMPO DE
DUPLICACION. Debemos tomar en cuenta que durante una sola generacin, se
han duplicado no solo la cantidad de clulas, sino tambin la masa de estas.El
tiempo de generacin g, de la poblacin celular se calcula como:

Donde t indica simplemente las horas o minutos de crecimiento exponencial.
Por lo tanto, sabiendo el nmero inicial y final de clulas en una poblacin que
est creciendo exponencialmente, es posible calcular n;y conociendo ny t, calcular
el tiempo de generacin Tg.
Como ejemplo para realizar estos clculos podemos usar los datos siguientes: N=
10
8
, N
0
= 5 x 10
7
y t= 2. Por tanto,
n = 3, 3 [l og10
8
- l og (5 X 10
7
)]
n = 3, 3 (8 - 7, 69) = 3, 3(0, 301)
n = 1
As, el tiempo de generacin Tg, que definimos como t/n, ser
Tg = t/n=

= 120 min.
Los tiempos de generacin varan dependiendo del organismo, citando como
ejemplo a la E. coli se puede completar un ciclo en 20 minutos, pocas bacterias
crecen ms rpido, pero muchas s lo hacen ms lento; como Mycobacterium
tuberculosis cuyo tiempo de duplicacin es de 18 horas.
TIEMPO DE GENERACIN EN CONDICIONES PTIMAS
Microganismo Tiempo Generacin (min)
Bacilluscereus 28
Escherichiacoli 12.5
Staphylococcusaureus 27-30
Mycobacterium tuberculosis 792 932
Treponema pallidum 1,980
22

Tabla: Tiempo de generacin de diferentes microorganismos
El tiempo de generacin tambin se puede calcular a partir de la pendiente de la
recta obtenida en la representacin semilogartmica del crecimiento exponencial,
pues la pendiente tiene un valor de 0,301/g.





4.3 Velocidad De Crecimiento (V).-

Cambio en el nmero de clulas o en la masa celular experimentado por unidad de
tiempo.

Las unidades de la velocidad es: generaciones/ horas.

Por ejemplo: teniendo 36 generaciones de una poblacin, con t=10 horas;
podemos deducir que:

4.4 Constante De La Velocidad De Crecimiento.-
Medida del nmero de generaciones que ocurren por unidad de tiempo
La constante de la velocidad de crecimiento se expresa como

m = ln2/g = 0.693/g
(expresado en h--1)

Una constante de crecimiento de 4.3 h-1, una de las ms grandes registradas,
significa que cada gramo de clulas produce 4.3 g de clulas por hora durante este
periodo del crecimiento.
23

La constante de la tasa de crecimiento calculada se puede usar paa determinar la
magnitud del crecimiento que ocurrir en un periodo especifico o para calcular el
tiempo requerido para un crecimiento determinado.

5. CINTICA DE CRECIMIENTO
5.1 Cultivo Discontinuo ( Batch Culture )
Cuando una fraccin de clulas de un cultivo puro se inocula en un determinado
volumen de medio fresco, despus de una incubacin, se produce un incremento de la
biomasa hasta un valor mximo denominado crecimiento total. Este proceso comporta
crecimiento celular propiamente dicho y aumento del nmero de clulas por
autoduplicacin. La biomasa es un catalizador de una reaccin que produce ms
biomasa idntica a la de partida.
Para poder cuantificar el aumento del nmero de clulas de la poblacin, es
importante limitarnos aqu a microorganismos que se multiplican por divisin binaria,
tal y como sucede con la mayora de las bacterias. Si consideramos el crecimiento de
una nica clula en condiciones ambientales que no imponen ninguna restriccin a su
multiplicacin, el crecimiento de dicha clula, que se divide de forma binaria, sigue una
progresin geomtrica de base 2, es decir :
2
0
2
1
2
2
2
3
2
n
Si la poblacin inicial, en vez de estarformada por una clula, est formada por N
0
clulas, el nmero final de clulas que habr en un momento dado (N
1
) depender,
obviamente, del nmero de generaciones que hayan tenido lugar (n), y ser :
N
1
= N
0
.2
n

O, tomando logaritmos:
logN
1
= log N
0
+ n. log.2
Conociendo experimentalmente N
0
y N
1,
el nmero de generaciones n puede
determinarse por la ecuacin:

Como el log 2 es igual a 0, 301, puede escribirse tambin:
n= 3, 32 (log N
1
log N
0
)
Estos clculos permiten determinar con facilidad el nmero de generaciones que ha
tenido lugar en una poblacin que ha incrementado su nmero de clulas de N
0
a N
1
.
24

Es importante resaltar aqu que estas frmulas son vlidas para cualquier organismo
vivo que prolifere por divisin binaria.
El factor que puede introducirse ahora hace referencia al tiempo necesario para que
N
0
clulas se conviertan en N
1
. Este factor s que es caracterstico de cada
microorganismo y puede variar enormemente de uno a otro. La introduccin del factor
tiempo (t) implica necesariamente la aparicin del concepto de velocidad de
multiplicacin (R), o nmero de generaciones por unidad de tiempo:

Si el valor de n se obtiene de la ecuacin, tenemos:

Un concepto que suele utilizarse para caracterizar el crecimiento microbiano es el
llamado tiempo de generacin g que es el tiempo necesario para que se duplique la
poblacin:
g = 1/R = t/n
El planteamiento matemtico realizado hasta ahora es un modelo terico, que si bien
nos posibilita una aproximacin interesante para la determinacin de una serie de
parmetros que caracterizan el crecimiento microbiano, presenta algunas limitaciones.
Por ejemplo, hay que tener en cuenta que no todas las clulas de un cultivo se dividen,
por lo que, en conjunto, el cultivo presentar un valor de g algo mayor que el calculado
a partir de la ecuacin.
Una aproximacin matemtica ms precisa se basa en considerar el mismo sistema
referido anteriormente, es decir, clulas creciendo en condiciones no restrictivas,
como un sistema autocataltico y analizar los cambios que se producen en la biomasa
en intervalos infinitesimales de tiempo en lugar de estudiar el promedio de cambios en
el nmero de clulas que tienen lugar a lo largo de un periodo de tiempo. En estas
condiciones, el aumento de biomasa a lo largo del tiempo es proporcional a la biomasa
existente, porlo que sigue la cintica de una reaccin de primer orden.
En trminos matemticos, esto puede expresarse como:
dN/dt =N
Aqu y en adelante, N puede ser cualquier parmetro que refleje la biomasa, como el
nmero de clulas, pero tambin podra ser la cantidad de protena, de cidos
nucleicos, etc. Por otro lado, es el tiempo y una constante de proporcionalidad que
se denomina constante de la fase de crecimiento o velocidad especfica de
25

multiplicacin. Es importante mencionar que aqu que no es la velocidad de
crecimiento (dn/dt), sino un valor que refleja la capacidad del microorganismo de
incrementar su biomasa en un medio determinado.
Si integramos la ecuacin entre N
0
y N
1
, tenemos :
ln (N
1
/ N
0
) = t
Tambin con este planteamiento matemtico puede calcularse el tiempo de
generacin, g, a partir de la ecuacin. Si g es el tiempo necesario para la duplicacin de
la poblacin, tendremos que N
1
=2 N
0
y t = g. Sustituyendo:
ln 2=.g, o

0,693 /
Si comparamos las ecuaciones :
g = 1/R g = 0,693/
entonces:
= 0,693 . R
Esto significa que R es mayor que . Este hecho hay que interpretarlo pensando que
refleja la tasa de crecimiento de crecimiento instantnea, y que esta se toma como si
se mantuviese constante desde el momento en que una clula resultante de una
divisin empezase a crecer. En la prctica, al final del ciclo celular, la tasa de sntesis de
biomasa es prcticamente el doble que al principio. Por ello R, que representa el
promedio de lo que ocurre durante el perodo de duplicacin, es mayor que .
Otra pregunta interesante es si vara con la concentracin del sustrato de
crecimiento ([). Si los valores de obtenidos con diferentes concentraciones de
sustrato se representan grficamente, se obtiene:

La curva obtenida es muy parecida a la descrita para la catlisis enzimtica. Monod
demostr que la ecuacin de esta curva es :
26

[

Donde
m
es la velocidad especfica mxima de crecimiento para valores de [S] no muy
alejados de aquellos para los que deja de ser limitante para el crecimiento. K
s
es la
constante de saturacin, igual a la concentracin de sustrato que reduce la velocidad
especfica de crecimiento a

m
.
La ecuacin se parece mucho a la ecuacin de Michaelis-Menten para la cintica de
los sistemas enzimticos. De este modo tambin puede aplicarse el mtodo de
Lineweaver-Burk para la determinacin mas precisa de K
s
y
m
. La ecuacin puede
expresarse tambin como:

Llevando a una grafica los valores de 1/ como ordenadas y los de 1/[ como
abscisas, puede calcularse la K
s.

A la hora de establecer una relacin entre la concentracin de sustrato y la tasa de
crecimiento bacteriana, es muy importante tener en cuenta que las bacterias
incorporan la mayora de los nutrientes por mecanismos de transporte activo o de
translocacin de grupo. Ello implica que incluso cuando un nutriente esta
notablemente diluido en el medio, su concentracin citoplasmtica es mxima . Por
ello, bajas concentraciones de sustrato proporcionan ya una
m
. As, Escherichiacoli ya
crece con una tasa mxima de crecimiento en medios con una concentracin de
glucosa de 0.004 mM (0.72mg.1
-1
).
Monod tambin demostr experimentalmente que existe una relacin constante entre
el crecimiento de un cultivo y la cantidad de sustrato utilizado:

Donde Y es el llamado factor de produccin. Durante la fase exponencial.
Y= peso de biomasa formada/ peso de sustrato consumido
Cuando se conocen los valores de
m
, K
s
e Y se tiene una descripcin cuantitativa
completa del desarrollo de un ciclo de cultivo discontinuo.
5.2 Cultivo Continuo
En la prctica, las condiciones de crecimiento no restrictivas indicadas en el apartado
anterior solamente perduran durante un tiempo limitado. Tanto el agotamiento de los
nutrientes como la produccin de metabolitos inhibidores del crecimiento por parte de
la biomasa en desarrollo producen condiciones en las que el crecimiento microbiano
27

cesa. Una alternativa para mantener la poblacin indefinidamente en crecimiento en
condiciones no restrictivas lo constituye el cultivo continuo. El cultivo continuo se inicia
del mismo modo que el discontinuo. Si cuando se alcanza la fase logartmica se aade
medio fresco a una velocidad adecuada para mantener la densidad de poblacin en un
valor constante e inferior al valor mximo de la fase estacionaria, el crecimiento puede
continuar indefinidamente. Sin embargo, la velocidad de entrada y el volumen de
cultivo crecern exponencialmente con la biomasa, a no ser que se vaya eliminando un
volumen de cultivo igual al del medio fresco que va entrando. El sistema de volumen
constante tiene un intercambio energtico fijo y la biofase produce un mnimo de
entropa.
En un quimiostato los microorganismos crecen a una velocidad especfica constante
inferior a
m
. En el recipiente de cultivo, que tiene un volumen V, entra un flujo
constante F de medio de cultivo fresco. Este medio tiene todos los nutrientes a una
concentracin limitante para una velocidad de crecimiento determinada. El volumen V
se mantiene constante porque simultneamente se elimina un flujo F de medio
modificado por la actividad metablica que adems lleva clulas producto del
crecimiento. El caudal de entrada F, determina la velocidad de dilucin:
D = F/V
La velocidad especfica de multiplicacin depende de la dilucin, esto es el nmero
de volmenes de cultivo que pasan por el recipiente de cultivo en la unidad de tiempo.
Si la dilucin es constante, la concentracin de sustrato tambin ser constante y
habr una velocidad especfica de crecimiento = D que determina un estado
estacionario que puede mantenerse indefinidamente.
La concentracinefectiva de sustrato puede expresarse por:
[
x
= [S]
0
- [S]
donde [S]
0
es la concentracin de sustrato en el depsito de medio fresco y [S] la
concentracin en el recipiente de cultivo. Si [S]
x
= 0, el sustrato no esutilizado y no hay
crecimiento. Para que haya crecimiento, [S]
x
debe ser mayor que 0. Aumentando [S]
0,
puede conseguirse un valor de [S] que d una prxima a
m.

La velocidad especifica de crecimiento ser prxima a
m
si puede satisfacerse las
siguientes condiciones: (a) medio de cultivo perfectamente agitado, (b) cultivo
homogneo, (c) que las propiedades de cultivo sean prcticamente constantes a altas
concentraciones de sustrato (S>>K
s
) y (d) que todos los dems componentes del medio
estn en exceso. Recordando la ecuacin:

28

Si N es ahora compensado por la salida de biomasa del volumen de cultivo DN, el
cambio neto de concentracin de biomasa con el tiempo ser:
Incremento = Crecimiento Prdida


Si > D, dN/dt ser positivo y la concentracin de microorganismos en el cultivo
aumentar con el tiempo. Si < D, dX/dt ser negativo y la concentracin celular
disminuir, esto es, el cultivo se ir lavando fuera del recipiente de cultivo. nicamente
cuando = D ser dN/dt = 0 y la concentracin de microorganismos en el recipiente de
cultivo permanecer constante. Esta es la situacin de estado estacionario, en la que:

(
[

[
)

El estado estacionario no es difcil de conseguir, porque, al estar limitada por el
suministro del sustrato, la velocidad especfica de crecimiento cambiara con la
dilucin. Si esta ltima es constante, el sistema tiende a equilibrarse.
Cuando la velocidad de dilucin aumenta, D > y, entonces,dX/dt se hace negativo y la
biomasa decrece. Esto conduce a una menor utilizacin del sustrato, lo cual, para <

m
, conduce a un aumento de la velocidad de crecimiento por incremento de. La
velocidad de crecimiento no puede sobrepasar
m
y, por lo tanto, hay una dilucin
crtica D
c
por encima de la cual el cultivo ser definitivamente lavado.
Puesto que depende de [S], es necesario considerar no slo el efecto de la dilucin
sobre la velocidad especfica de crecimiento, sino tambin el efecto de la dilucin
sobre la concentracin de sustrato [S] y la biomasa (N) en el cultivo.
El sustrato entra en el recipiente de cultivo a la concentracin [S]
0
, es consumido por el
microorganismo y emerge en el afluente a la concentracin [S]. De este modo, el
cambio neto en la concentracin de sustrato es:
Incremento de sustrato = Entrada Salida Consumo
[ [

[
[ [

[
Reordenando la ecuacin y sustituyendo por la ecuacin:
[

(
[

[
)
De modo semejante, puede ser sustituida en la ecuacin (a), con lo cual tendremos :
(a)
(A)
29


Las ecuaciones, (A) y (B) definen cuantitativamente el comportamiento del cultivo en
el quimiostato y la capacidad autorreguladora del sistema.
En estado estacionario, las ecuaciones (A) y (B) son 0 y por lo tanto, los valores de N y
[S] pueden ser calculados. En la ecuacin (A) tenemos:

Y enB :
D=
m
([S]/(K
s
+[S]))
con lo que, operando :
(C)
Y
(D)
Los valores de K
s
,
m
e Y pueden determinarse en un cultivo discontinuo y aplicarse a
las ecuaciones (C) y (D). Entonces pueden variarse [S]
0
y D para obtener un gran
nmero de estados estacionarios para distintas concentraciones celulares (N). La nica
restriccin es que [S]
0
debe permanecer dentro del margen que permita que el
sustrato sea el factor limitante del crecimiento.
El quimiostato controla la velociad de crecimiento con ayuda de dilucin y una
sustancia limitante del crecimiento. Para diluciones grandes la estabilidad de la
poblacin es difcil. Cuando la velocidad de crecimiento no resulta estrechamente
ligada a la densidad de poblacin, el estado estacionario tampoco resulta fcil.
Entonces puede utilizarse otro recurso que permite una regulacin directa de la
densidad de poblacin mediante una clula fotoelctrica que emite seales al
desviarse de una determinada turbidez, las cuales permiten aumentar o disminuir la
entrada de medio fresco para volver al valor deseado. Estoconstituye el fundamento
del cultivo continuo en el turbidostato, que puede utilizarse en conjuncin con el
quimiostato incluso cuando el sustrato no es el factor limitante del crecimiento.


(B)
30

BIBLIOGRAFIA

Madigan, M., J. Martinko y J. Parker, Brock Biologa de los microorganismos-
8va Edicin-Ed. Prentice May-1064pp.
Pares, Ramn; Juarez, Antonio. Bioqumica de los microorganismos. Editorial
Revert. Barcelona. Espaa.2002
Prescott,L., J. Harley, D. Klein. 1999. Microbiologa. 4 Edicin. Ed. Mc Graw Hill.
Mexico.1112pp.



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LINKOGRAFIA
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/12crecimiento.htm
http://www.slideshare.net/jochoa/6crecimiento-microbiano-1719474
http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales%20teoricos/cre
cimiento_2010.pdf