Secuencia de nucletidos completa de la gran pTC2 conjugativo plsmido multireplicon codifican el VIM-1

metalo-b-lactamasa
Laurence Drieux1, 2 *, Dominique Decre '2, 3, Lionel Frangeul4, Guillaume Arlet2, 5, Vincent Jarlier2, 6 y
Wladimir Sougakoff2, 6
Objetivos: determinar la secuencia completa de nucletidos del plsmido que codifica VIM-1-pTC2, que era aislado
de la cepa multirresistente una Providencia griega stuartii.
Mtodos: El plsmido pTC2 fue extrado y secuenciado utilizando escopeta y 3 kb bibliotecas de ADN de extremo
vinculado y un enfoque de secuenciacin 454. Despus del montaje en un andamio nico, algunas fueron cerradas por
PCR seguida de la secuenciacin del ADN de Sangre. Las predicciones de genes y anotaciones se realizaron
utilizando la herramienta CAAT-Box y la Servicio de bsqueda de dominio conservado. La comparacin de
secuencias se realiz con la herramienta de comparacin de Artemis.
Resultados: El plsmido PTC2 (180184 pb) se encontr que era un plsmido multireplicon (INCA / C y INCR), con
una gran Inca / C espina dorsal y una regin de resistencia a mltiples frmacos mosaico (MDR), en el que se insert
un fragmento de 13 kb Incr. Gene anotacin permiti la identificacin de un completo sistema de transferencia de
tipo C Inca / y de varios putativo mdulos de mantenimiento, tanto en el esqueleto Inca / C y en el fragmento Incr. La
regin de la MDR complejo contenida 9 secuencias de insercin (7 IS26, 1 IS1 y 1 IS6100), 10 genes de resistencia y
un opern de resistencia al mercurio integrado en la unidad de transposones, transposones compuestos o integrones.
Conclusiones: La pTC2 combina una amplia gama de huspedes, capacidades de transferencia y mantenimiento, la
plasticidad de la MDR regin y una amplia variedad de genes de resistencia, propiedades que pueden contribuir a la
difusin de la resistencia determinante.
Introduccin
Metalo-b-lactamasas (MBL) adquiridos representan una amenaza para el tratamiento de infecciones causadas por
bacterias Gram-negativas, en particular por las enterobacterias que ya producen extendedspectrum b-lactamasas
(BLEE). MBL, representada en su mayora por
Enzimas VIM, IMP y NDM, son enzimas dependientes de zinc que puede hidrolizar todas las clases de antibiticos
b-lactmicos, excepto monobactamas, y no son inhibidas por cido clavulnico y tazobactam.
Durante la ltima dcada, VIM-1 MBL se ha convertido en el sur de Europa pases.1, 2 A pesar de plsmidos que
codifican VIM-1-epidmicos del grupo de incompatibilidad INCN parece contribuir a la propagacin de este MBL
en Grecia, 2 de los mecanismos implicados en este xito tiene no se ha explorado a fondo hasta ahora. Hemos
informado anteriormente sobre la transferencia entre especies de un plsmido producir el VIM-1 de MBL y la SHV-
5 ESBL en el tubo digestivo de un paciente.3 Aqu nos informa sobre la secuencia completa del plsmido pTC2
aislado de un transconjugante cepa obtenida durante los ensayos in vivo de conjugacin en el tracto digestivo de
ratones del.3 gnotobiotic
Mtodos
La extraccin y la secuenciacin del plsmido
El ADN del plsmido se extrajo mediante el Kit de gran Construct Qiagenw (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) y se
secuenci a travs de servicios proporcionados por Genoscreen (Lille, Francia), utilizando escopeta y 3 kb de
secuenciacin de extremo emparejado ejecuta en un 454/Roche GS FLX Analyzer (Roche, Basilea, Suiza). Las
secuencias resultantes se ensamblan en un andamio nico. Las lagunas predichas fueron cerradas por PCR seguida de
secuenciacin de ADN de Sangre utilizando el Kit de Reaccin Grandes Dyew Terminator Cycle Secuenciacin
Listo (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un ADN ABI Prism 310 Secuenciador (Applied
Biosystems).
La anotacin gnica y la secuencia de comparacin
Los genes fueron predichos y anotados usando la herramienta DE CAAT-BOX (Genopole, Pasteur Instituyan, Pars).
Esta anotacin fue completada por la deteccin de dominios estructurales y funcionales en protena pone en secuencia
usando el servicio Conservado de Bsqueda de Dominio. Toda la secuencia de pTC2 fue comparada y alineada para
Incaicos / C plasmids utilizando al Artemisa Comparison
Herramienta (http://sanger.ac.uk). La secuencia del nucleotide ha sido asignada a la base de datos GenBank bajo
JQ824049 de nmero de accesin.

Resultados y discusin
Los plasmidwas PTC2 demostrado ser una molcula de 180.184 pb con un Inca / C backbone estrechamente
relacionado con los reportados en los plsmidos pP99-018 y pP91278 de Photobacterium damselae subsp. piscicida6
y el plsmido pIP1202 de Yersinia pestis7 (Figura 1). Plsmidos pP99-018, pP91278, pIP1202 y pTC2 han aislado en
contextos completamente diferentes y reas geogrficas (Patgeno de peces en Japn para P99-018 y EE.UU. para
pP91278, peste bubnica en Madagascar por pIP1202 y adquirida en el hospital
Enterobacteriaceae en Grecia para pTC2), 3, 6, 7 una caracterstica que ilustra su elevada capacidad de difusin a
travs de varios continentes, en diversos nichos ecolgicos y en diversas especies.
Dentro de la columna vertebral Inca / C conservada, hemos identificado los genes que codifica las funciones de (i) la
replicacin, con la repA (iniciacin de la replicacin ) gen de la protena y el origen de replicacin (oriV) separados
por catorce iterones 20 pb, (ii) la transferencia por conjugacin con dos regiones, Tra1 y Tra2, que estaban completos
y (iii) el mantenimiento, con el sistema de particin ParABIncA / C, una protena de la estabilidad Kfra-como y una
recombinasa de tipo XerD, que podra estar implicado en multmero resolucin (Figura 1a y Tabla S1, disponible
como complementario datos en lnea JAC). Adems de estos sistemas de mantenimiento, la columna vertebral Inca /
C conservada codificado dos pequeas protenas de 116 aminocidos (pTC2_423) y 100 aminocidos (pTC2_425),
respectivamente. La protena pTC2_425 mostr aminocido 32% identidad con Higa, el elemento de la antitoxina del
sistema HigBA de Mycobacterium tuberculosis. La protena fue pTC2_423 encontrado que pertenecen a la
superfamilia de gp49, que contiene varias toxinas.8 relacionados con HigB Adems de la columna vertebral Inca / C,
pTC2 lleva un adicional 13 kb fragmento con un contenido de G+ C de 49,8%, que llev a la repB (protena
iniciacin de la replicacin) de genes, recientemente asignado a un nuevo grupo replicn tipificacin basada en PCR,
IncR.9 Este fragmento exhibido 99% de identidad con una regin descrita en el Pefer plsmido (GenBank nmero
CU928144) y fue aparentemente adquirido junto con parte de la resistencia a mltiples frmacos (MDR) regin
(Figura 1). Por lo tanto, pTC2 exhibi dos replicacin mdulos (repIncA / C y repIncR), cada uno contienen
conjuntos de iterones probablemente implicados en la regulacin de la replicacin, lo que representa la primera
descripcin de una estructura multireplicon Inca / C-Incr. Aunque la funcionalidad de los replicones sigue siendo
establecida, esta observacin plantea la cuestin de la coordinacin de replicacin y regulacin, as como del
fenmeno de incompatibilidad en plsmidos multireplicon. El fragmento kb INCR 13 de pTC2 tambin codifica los
sistemas de mantenimiento, incluyendo una supuesta Sistema de particin Daz, un sistema toxina-antitoxina VagCD
y una Recombinasa resd, que podra estar implicado en multmero resolucin (Figura 1a). El locus parABIncR se
encuentra aguas abajo del replicn repIncR y aguas arriba de un parS putativo sitio centrmeros-como. Cuando se
compara con la particin ParABS sistema de fago P1, que es el arquetipo de tipo de particin Ia sistemas, ParAIncR y
ParBIncR exhibieron 69% y 54% de identidad con ParAP1 y ParBP1, respectivamente. La secuencia parSIncR
compartida 66% de identidad con la secuencia de centrmero como parSP1. Anteriormente puso de manifiesto que se
mantuvo de forma estable pTC2 despus traslado a un nuevo husped durante una transferencia en vivo experiment.3
Por lo tanto, la coexistencia de dos sistemas de particin putativos en este plsmido parece tener ningn impacto
negativo en la dcada de los plsmidos la estabilidad. El locus vagCD de pTC2 comparte identidad 96% con el locus
vagCD de Pefer. La presencia de esta toxina- sistema de antitoxina podra estar implicado en la estabilidad de la
INCR fragmento dentro pTC2. La regin de la MDR pTC2 tena un tamao total de 50 kb (incluyendo el fragmento
INCR) (Figura 2). Se exhibi 10 genes de resistencia, 9 secuencias de insercin (7 IS26, 1 IS1 y 1 IS6100),
compuesto transposones, piezas de transposones de la unidad y dos incompletos integrones de clase 1. Esta compleja
estructura estaba limitada por la extremos exteriores de Tn1696 (repeticin invertida IRtnp y tnpA transposasa gen en
su extremidad izquierda, y repeticin invertida IRMER y una parte de la Mer opern de resistencia al mercurio en su
extremo derecho), que fueron flanqueados por 5 repeticiones directas pb (Figura 2). La Regin MDR interrumpido el
gen RHSD, que es conocido por ser un punto caliente para la integracin en la backbone.7 Inca / C La primera
integrn de clase 1, In-E541, exhibi una truncada 3 ' segmento conservado (3'-CS) y contena cuatro casetes de
genes: blaVIM-1, aacA7, dfrA1 y aadA1 (Figura 2). El segundo integrn contena un gen truncado integrasa intI,
dfrA12, gcuF y aadA2 casetes de genes y una regin 3 'CS truncada por una IS26 copia (Figura 2). Estos dos
integrones se separaron por un gran SHV-5-que codifica transposn compuesto, que ya ha sido descrito en otra
plasmids.7, 10 La regin MDR tambin contena el mdulo de resistencia a los macrlidos que comprende mph (A),
y MRX MPHR genes y un transposn Tn4352 compuesto que lleva el aphA1 gen de resistencia a aminoglucsidos
(Figura 2) .10 El derecho parte de la regin de la MDR comprende un opern mer mosaico con un 5 'medio homloga
al opern mer de Tn1696. El 3 ' mitad de este opern constituido, con el IRt adyacente invertida repetir y el gen tnia
truncada, un fragmento de un transposn Tn21, como se ha observado con frecuencia en otros plsmidos (Figura 2).
La Regin MDR de pTC2 igualada varias secciones del INCN Plsmido VIM-1-encoding pNL194 aislado en Grecia,
pero estos componentes compartidos se organizan de diferentes maneras en los dos plsmidos (Figura 2). Se puede
formular la hiptesis de que este regin compleja MDR fue el resultado de mltiples factores genticos eventos de
reordenamiento, comenzando con la insercin de un -Tn1696 como transposn en el esqueleto de Inca / C. El IS26
ejemplares que se encuentran en pTC2 no estaban flanqueadas por repeticiones directas, lo que sugiere que los
eventos de recombinacin se han producido entre los elementos IS26, ya sea dentro o entre pTC2 pTC2 y otro ADN
molculas. Por lo tanto, es probable que estas secuencias de insercin han contribuido a la estructura de mosaico de
pTC2 ya su alta plasticidad, una caracterstica que facilita la difusin de la resistencia por el intercambio de los genes
con otras molculas de ADN (cromosomas y plsmidos) 0.10 En conclusin, pTC2 se encontr que era un elemento
multireplicon, exhibiendo una gran columna vertebral Inca / C asociada con un fragmento INCR, que probablemente
se origina a partir de eventos de recombinacin

Figura 1. (A) un mapa circular del plsmido pTC2. Los genes estn codificados por colores, en funcin de las
anotaciones funcionales, a saber: la replicacin del plsmido, rojo; el mantenimiento del plsmido, azul; transferencia
de un plsmido conjugativo, verde; transposicin / recombinacin, amarillo; resistencia, de color rosa; otras
funciones, negro; y hipotticas protenas, gris. La regin de la MDR, el fragmento INCR y dos locus de transferencia
(Tra1 y Tra2) se indican. Un elemento IS26 aislado (Fuera de la regin MDR) se indica. Este elemento est
flanqueada por 8 bp repeticiones directas. (B) La comparacin de secuencias de pTC2 con plsmidos Incaicos / C:
pIP1202 (Yersinia pestis, Madagascar, 1995, nmero de acceso de GenBank CP000603), pP99-018 (subsp damselae
Photobacterium. piscicida, Japn, 1999, nmero de acceso GenBank AB277723) y pP91278 (subsp damselae P..
Piscicida, EE.UU., 1991, nmero de acceso GenBank AB277724) 6,7 Las comparaciones se realizaron con la
herramienta de comparacin de Artemis con un punto de corte mnimo de 121 y un mnimo porcentaje de identidad
de corte de 100%. Avance y retroceso partidos son de color rojo y azul, respectivamente. Esta cifra aparece en color
en la versin en lnea de JAC y en blanco y negro en la versin impresa de la JAC.
Entre al menos dos plsmidos distintos, y que combina una capacidades amplia gama de huspedes, traslado y
mantenimiento, alta plasticidad de la regin MDR y una variedad de genes de resistencia.
Tales resultados merecen una mayor investigacin para dilucidar la contribucin del carcter multireplicon y
mantenimiento de sistemas en la capacidad de difusin de pTC2.
Figura 2. La organizacin gentica de la regin MDR de pTC2 y la comparacin con la regin MDR de pNL194
(Grecia, neumonas de potasio., nmero de accesin GenBank GU585907). La comparacin fue realizada utilizando a
la Artemis Comparison Tool con un truncamiento mnimo de puntuacin de 127 y un truncamiento porcentual
mnimo de identidad de 100 % y la figura se traz manualmente. Los fsforos son pintados de gris. El IS26 que los
elementos estn indicados por cajas grises. Los elementos Tn1696 son indicados por cajas incubadas. El fragmento
IncR es indicado por una caja negra y las lneas quebradas que indican su posicin dentro de la regin MDR. R, T, P,
C, Una, D y E indican a merR, merT, merP, merC, merA, merD y meros genes, respectivamente. Las orientaciones
gnicas son indicadas por flechas horizontales. Invertido repite (IRs) y directo repite es representado por tringulos
blancos y negros, respectivamente.

Financiamiento
Este estudio fue financiado por una subvencin del Ministerio de Investigacin de Francia (UPMC ER5).
Declaraciones de Transparencia Nada que declarar.
Datos complementarios
Tabla S1 est disponible como datos complementarios a JAC Online (http://jac. oxfordjournals.org /).
Referencias
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