INSTITUTO TECNOLGICO

DE CELAYA
DEPARTAMENTO DE IBQ

PRODUCCIN DE PHA MEDIANTE PSEUDOMONA
PUTIDA USANDO COMO SUSTRATO CIDOS GRASOS

PRESENTAN:
Csar Augusto Aboytes Noria
Sandra Olgun Resndiz
PROCESOS BIOTECNOLGICOS
DR. FRANCISCO VILLASEOR
INTRODUCCIN
Los plsticos de origen petroqumico son ampliamente utilizados debido a su fcil
moldeamiento y alta resistencia qumica, pero son un problema ambiental, debido a su alto
peso y conformacin molecular, la accin de los microorganismos en los procesos
degradadores es mnima, por lo cual permanecen en el ambiente durante amplios periodos
de tiempo.
Las medidas que se han adoptado para solucionar el problema de acumulacin de basuras
plsticas engloba desde el reciclaje hasta la incineracin de las mismas, las cuales no son
soluciones muy viables debido a que los procesos son costosos, no abarcan todos los
desechos y generan emanaciones gaseosas nocivas para el ambiente, las cuales en los
ltimos aos estn siendo ms restringidas por las nuevas legislaciones medioambientales.
La sobrepoblacin humana, combinado con el actual estilo de vida exige el uso racional,
eficiente y auto sostenible de fuentes naturales para producir sustancias amigables para el
medio ambiente como los Polihidroxialcanoatos (PHA).
Los polihidroxialcanoatos (PHA) constituyen una familia de polisteres acumulados
intracelularmente, en forma de grnulos, los cuales representan una alternativa
biotecnologa para la produccin de plsticos biodegradables y biocompatibles.
Los PHA poseen una amplia gama de propiedades que permiten su aplicacin en diversas
reas. Son termoplsticos, insolubles en agua, no txicos, biocompatibles y biodegradables.
Estos polisteres son una alternativa ecolgica a los plsticos derivados del petrleo.
Estos polmeros son clasificados en dos grandes grupos dependiendo de su conformacin:
PHASCL (short chain length), los cuales estn constituidos por monmeros de 3 a 5
carbonos; y PHAMCL (mdium chain length) que de 6 hasta 16 carbonos.
La posibilidad de usar diferentes sustratos renovables para la produccin de PHA hace ms
atractivo el proceso, ya que dentro de las grandes posibilidades se encuentran el uso de
carbohidratos, pasando por alcoholes, hasta aceites vegetales, los cuales estn constituidos
por triglicridos y radicales con cadenas de cidos grasos saturados e insaturados.
Dentro de los diferentes PHA producidos, el primero en ser descubierto y caracterizado fue
el poli-3hidroxibutirato (P3HB), siendo objeto de varios estudios los cuales revelaron, entre
otros resultados, una gran diversidad de microorganismos producen este polmero de
caractersticas cristalinas y pertenecientes al grupo de PHASCL..
Los PHAMCL son polisteres que presentan propiedades elastiomricas. Son producidos por
diferentes especies de Pseudomonas y presentan caractersticas diferentes al P3HB y a sus
co-polmeros, los cuales son cristalinos. Es por esto que los PHAMCL son necesarios para
cubrir las necesidades que el P3HB y sus co-polmeros no abarcan.
Para la produccin sostenible de poli-hidrxialcanoatos de cadena media, se buscan
sustratos que cumplan con las condiciones para la obtencin del polmero, por lo cual, entre
las mejores opciones, est el uso de cidos grasos derivados a partir de aceites vegetales,
debido a que son de bajo costo, son renovables y adems, su constitucin presenta
insaturaciones, las cuales sirven como precursores de monmeros insaturados para la
incorporacin al polmero, modificando sus propiedades qumicas y as proporcionarle
caractersticas propias que amplan su aplicacin industrial. Adem, las insaturaciones
sirven como blanco para modificaciones qumicas posteriores.
Este trabajo tiene como propsito evaluar la produccin de PHAMCL conteniendo
monmeros insaturados por mutantes de P. putida (IPT046) afectados en el crecimiento en
cido 4-pentenico.

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la incorporacin de monmeros insaturados a PHAMCL producidos
Pseudomonas putida IPT 046 y algunos mutantes afectados en el crecimiento en
cido 4pentenico.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Determinar la composicin de los PHA producidos por los mutantes de P. putida IPT
046 incapaces de crecer en acido 4-pentenoico utilizando como fuente de carbono
cido linolico.
Evaluar el efecto de la complementacin de los mutantes obtenidos a partir de
Pseudomonas putida IPT 046 con el gen fadH1.

MARCO TERICO
BIOPOLMEROS
Una amplia variedad de polmeros son sintetizados a partir de materia viva, productos
agrcolas y de procesos biotecnolgicos Dependiendo de su estructura qumica, estos
polmeros se clasifican en: cidos nuclicos, poliamidas, polisacridos, polisteres,
politiosteres, polianhdridos, poli-isoprenoides y polifenoles (STEINBCHEL, 2001). Los
bioplsticos son polisteres producidos por una amplia variedad de microorganismos,
cultivados bajo unas condiciones especficas (MADISON & HUISMAN, 1999). Las
propiedades fsico-qumicas de estos materiales dependen del microorganismo productor
y del sustrato suministrado (HA & CHO, 2002).
Adems de su obtencin natural, los bioplsticos son de gran importancia gracias a su
biodegradabilidad, la cual es debida al metabolismo de organismos presentes en la
naturaleza, que transforman los materiales polimricos en compuestos de bajo peso
molecular como CO2 y H2O.
Los plsticos biodegradables son clasificados en 3 grandes grupos:
1. Polmeros qumicamente sintetizados: son susceptibles a la accin de microorganismos
y no pueden ser usados con fines comerciales debido a su alta tasa biodegradativa y
propiedades fsicas. Ej.: cido poligliclico, poli (e-caprolactona), alcohol polivinlico,
etc. (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004).
2. Plsticos biodegradables a base de almidn: en este tipo de plstico, el almidn acta
como complemento y a la vez sirve como relleno y agente adherente para crear una
mezcla entre almidn y plstico (almidnpolietileno). Las bacterias del suelo degradan
el almidn y tambin alteran la matriz del plstico, aumentando la biodegradabilidad
pero generando nuevos compuestos recalcitrantes que quedarn en el ambiente
durante largos periodos de tiempo (KHANNA & SIVRASTAVA, 2004).
3. Polihidroxialcanoatos: Son los nicos polmeros 100% biodegradables (KHANNA &
SIVRASTAVA, 2004).
POLI-HIDROXIALCANOATOS
Los Poli-hidroxialcanoatos (PHA) son una familia de polisteres compuestos principalmente
de cidos R-3 hidroxialcanoicos acumulados en forma de grnulos intracelulares, que
pueden representar hasta el 80% de la masa seca celular (Fig. 1), los cuales sirven como
fuente de carbono, energa y equivalentes reductores. (MADISON & HUISMAN, 1999) Son
producidos bajo condiciones desbalanceadas de cultivo, es decir, con exceso en la fuente
de carbono y limitacin en los elementos esenciales (N, S, O, P, Mg) (ANDERSON & DAWES,
1990).

Microfotografa electrnica de P. putida con grnulos de PHA (Luengo et al. 2003)
La acumulacin de este polmero se puede considerar una estrategia desarrollada por las
bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Adems de servirle a la clula
como fuente de carbono, los PHA tambin sirven como fuente de energa para el proceso
de enquistamiento (Azotobacter sp.) y de esporulacin (Bacillus sp.), para la proteccin de
complejo nitrogenada en las bacterias fijadoras de nitrgeno, ya que el PHA acta como
compuesto oxidable y tambin es constituyente de la membrana citoplasmtica de
bacterias (ALMEIDA et al., 2004; ANDERSON & DAWES, 1990, FILIPOV, 2000).
Los PHA pueden ser clasificados en dos grandes grupos:
1. Cadena corta (HASCLHydroxyAcids of Short-Chain-Length), teniendo de 3 a 5 tomos
de carbono en la cadena principal.
2. Cadena media (HAMCL-HydroxyAcids of Medium-ChainLength) teniendo de 6 a 16
tomos de carbono en la cadena principal (STEINBCHEL & VALENTIN, 1995).
Historia y Produccin El primer hidroxialcanoato en ser estudiado fue el poli 3-
hidroxibutirato (P3HB), el cual fue descubierto por Lemoigne en 1926 (LEMOIGNE, 1926).
En 1964 se identific El cido 3-hidroxi-2-butenico producido por una bactria del gnero
Nocardia (ANDERSON & DAWES, 1990). En 1972, a partir de estudios en aguas residuales,
se confirm la presencia de otras sustancias como los cidos 3hidroxivalrico (3HV), 3-
hidroxihexanico (3HHx) y 3-hidroxiheptanico (3HHep) mediante la extraccin con
cloroformo (WALLEN y ROHDWEDDER, 1974). En 1976, la empresa inglesa Imperial
Chemical industries (ICI) empez estudios para producir poli-hidroxibutirato (P3HB) a partir
de Ralstonia eutropha, depositando en 1981, una patente para la produccin del
copolmero P (3HB-co-3HV). Este copolmero es conocido como BIOPOL y es obtenido a
partir de glucosa y cido
propinico (BYROM, 1990). Cargill Dow Polymers comercializa sus resinas EcoPla in Japn.
Algunas de las marcas que estn en el mercado actualmente son NODAXTM (Copolmero
de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y BIOCYCLETM (homopolmero de hidroxibutirato,
copolmero de hidroxibutirato e hidroxivalerato) producido por la empresa brasilera PHB
Industrial S.A. desde el ao 2000, con una capacidad inicial de produccin de 50 toneladas
por ao, la cual se encuentra en fase de ampliacin (NONATO et. al., 2001) (LEMOS et. al.,
2006).
HISTORIA Y PRODUCCIN
El primer hidroxialcanoato en ser estudiado fue el poli 3-hidroxibutirato (P3HB), el cual fue
descubierto por Lemoigne en 1926 (LEMOIGNE, 1926). En 1964 se identifico El cido 3-
hidroxi-2-butenico producido por una bactria del gnero Nocardia (ANDERSON &
DAWES, 1990). En 1972, a partir de estudios en aguas residuales, se confirm la presencia
de otras sustancias como los cidos 3hidroxivalrico (3HV), 3-hidroxihexanico (3HHx) y 3-
hidroxiheptanico (3HHep) mediante la extraccin con cloroformo (WALLEN y
ROHDWEDDER, 1974). En 1976, la empresa inglesa Imperial Chemical industries (ICI)
empez estudios para producir polihidroxibutirato (P3HB) a partir de Ralstonia eutropha,
depositando en 1981, una patente para la produccin del copolmero P (3HB-co-3HV). Este
copolmero es conocido como BIOPOL y es obtenido a partir de glucosa y cido
propinico (BYROM, 1990). Cargill Dow Polymers comercializa sus resinas EcoPla in Japn.
Algunas de las marcas que estn en el mercado actualmente son NODAXTM (Copolmero
de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y BIOCYCLETM (homopolmero de hidroxibutirato,
copolmero de hidroxibutirato e hidroxivalerato) producido por la empresa brasilera PHB
Industrial S.A. desde el ao 2000, con una capacidad inicial de produccin de 50 toneladas
por ao, la cual se encuentra en fase de ampliacin (NONATO et. al., 2001) (LEMOS et. al.,
2006).
La empresa estadounidense Procter & Gamble desarroll y comercializ en 2004, un
copolmero de P3HB y 3HA con radicales laterales con ms de 3 carbonos utilizando
microorganismos genticamente modificados (NODA et al. 2004).
Debido a su crecimiento econmico y demogrfico en la segunda mitad del siglo XX, China
se ha convertido en una de los pases que ms produce y a su vez, consume plsticos en el
mundo (Tabla 1). En este pas asitico se estn desarrollando varias investigaciones para la
obtencin de PHA, contando con el 50% de las empresas a nivel mundial que producen este
biopolmero (CHEN, 2008).
CARACTERSTICAS QUMICAS Y FSICAS DE LOS PHA
Como se mencion anteriormente, los PHA son polisteres compuestos por monmeros de
(R)-3-hidroxicidos, generalmente lineales, en los cuales, el grupo carboxilo forma un enlace
ster con el grupo hidroxilo con del monmero siguiente. (MADISON & HUISMAN, 1999)
(Fig. 2).
Hasta el momento se han identificado ms de 150 cidos hidroxialcanoicos, saturados,
insaturados, halgenos, aromticos, etc. (STEINBUCHEL & VALENTIN, 1995) los cuales son
incorporados a la cadena lateral del PHA y a su vez cambian sus propiedades fsicas,
llevndolas a ser usadas en nuevas aplicaciones tecnolgicas. Esta variabilidad depende del
tipo de sustrato que se suministra, especificidad en la polimerizacin y las diferentes rutas
metablicas que conllevan la formacin de los monmeros (MADISON & HUISMAN, 1999)
(SILVA-QUEIROZ, 2007).

Estructura General de los Polihidroxialcanoatos (LEE, 1996)
La masa molecular de los PHA es del orden de 50kDa hasta 100kDa, esto depende de la
naturaleza del polmero (MADISON & HUISMAN, 1999). Intracelularmente, el P3HB, existe
en unos estados lquidos y amorfos, mientras que, despus de su extraccin mediante el
uso de solventes orgnicos, ste pasa a un estado cristalino, confirindole caractersticas
rgidas, pero a su vez quebradizo. Su punto de fusin es relativamente alto (180 C), pero
cerca del punto de degradacin trmica (200 C) (KIM & LENZ, 2001).
Debido a su conformacin estructural, los PHASCL y PHAMCL, difieren en sus caractersticas
termoplsticas y elastiomricas. Los PHASCL son catalogados como termoplsticos,
mientras que los PHAMCL, por tener menor cristalinidad y puntos de fusin menores son
reconocidos como elastmeros (POIRIER et al., 2001). Los 23PHAMCL tienen un
alongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los PHASCL poseen un
alongamiento para ruptura menor que 5%; la incorporacin de unidades de 3HV al P3HB
permite aumentar la maleabilidad y resistencia, alcanzndose valores de alongamiento para
ruptura cerca de 50% (SUDESH et al., 2000).
Propiedades fsicas de PHA y PP. Modificado de REHM, 2007. Tg(Temperatura de transicin
vtrea) Tm( Temperatura de cristalizacin)
Propiedades PHAMCL PHASCL PP
Tm (C) 177 61 176
Tg (C) 2 -36 -10
Cristalinidad (%) 70 30 60
Elongacin (%) 5 300 400

Las caractersticas del medio ambiente tambin repercuten en la produccin de los
biopolmeros. Varios estudios han demostrado la influencia que tienen los campos
magnticos en el rendimiento productivo de los microorganismos (ZHI-YONG et al., 2007;
TAKEHIRO et al., 2003). CHEN & LI (2008) determinaron que definitivamente existe una
influencia de los campos magnticos estticos en la produccin de PHB.
APLICACIONES
El mercado de los PHA se puede clasificar en dos grandes grupos: (i) Envases desechables
biodegradables, con un mayor volumen de demanda, debido a que son producidos bajo
formas predeterminadas, pero en donde los productos petroqumicos tienen ventaja
debido a su excelente procesabilidad y bajo costo de produccin. En este grupo, el objetivo
fundamental es crear un mercado ecolgico donde su biodegradabilidad le confiera un
valor agregado al producto terminado, ya que segn Nonato y colaboradores (2001), el PHB
puede ser vendido a US$5.83 por Kilo, siendo mucho ms barato que el polmero producido
por Biomol cuyos precios oscilan entre US$10-20 por kilo, dependiendo de la naturaleza
de este. Algunos productos comerciales fabricados a partir de PHA son botellas, recipientes
para cosmticos, bolgrafos, palos de golf, entre otros. (ii) rea farmacutica, ya que desde
1990, los PHA estn siendo estudiados como posibles microencapsulados para liberacin
controlada de medicamentos. Algunas sustancias de origen natural como el colgeno ya
fueron utilizadas para tratamiento de tejidos cardiacos afectados, pero se observ una baja
eficiencia en la reparacin debido a que durante el procedimiento quirrgico, las partculas
pueden migrar de lugar del implante antes del crecimiento del nuevo tejido (GALEGO et al.,
2000). En el campo de la oncologa, los PHA tambin estn siendo evaluados en diferentes
tratamientos, como por ejemplo, el P3HB y el PHPE son utilizados como microesferas
portadores de NzPC, un colorante fotosensibilizador el cual es usado en terapia
fotodinmica. (R et al., 2005). Diversas pruebas han sido realizadas y han mostrado que el
P3HB es biocompatible, debido a que R-3-Hidroxibutirato es un constituyente normal de la
sangre en concentraciones entre 0.3 y 1.3 mM, as mismo, estudios demuestran que no
existe alteracin en los parmetros funcionales, bioqumicos y fisiolgicos en los pacientes,
adems de presentar propiedades mecnicas iguales o mejores que los termoplsticos
convencionales. Los PHAMCL, gracias a sus caractersticas elastiomricas, poseen
aplicaciones potenciales como precursores de molculas con propiedades anti-reumticas,
analgsicas, radiopotenciadores, anti-tumorales, adems en biopelculas mdicas y
dispositivos especiales como soporte de frmacos, nuevos tipos de suturas, soporte
regenerativo de tejidos vasculares, etc. (POUTON & AKHTAR. 1996; ZINN et al. 2001;
SANCHEZ et al. 2003; SHISHATSKAYA et al. 2001; LUENGO et al. 2003).
SNTESIS DE PHA
En diversos grupos de bacterias ha sido estudiada profundamente la biosntesis de PHA.
Algunas rutas metablicas han sido descritas especialmente para 4 microorganismos:
Cupriavidus necator, Rhodospirillum rubrum, Pseudomonas oleovorans y Pseudomonas
aeruginosa. (STEINBCHEL, 1996; STEINBCHEL & LTKE-EVERSLOH, 2003).
SNTESIS DE PHASCL
En Cupriavidus necator la formacin de PHASCL, polmero con cadenas de hasta 5 carbonos,
ocurre por la accin de 3 diferentes enzimas producidas a partir de genes organizados en
un opern conocido como phaCBA. Dos molculas de Acetil-CoA producidas a partir de la
degradacin de la fuente de carbono suministrada son condensadas a acetoacil-CoA por la
accin de la -tiolasa (phaA). La molcula de acetoacil-CoA es reducida en la posicin 3 por
la acetoacil-CoA reductasa NADH dependiente (phaB), produciendo (R)-3-hidroxibutiril
CoA. La reaccin final involucra la polimerizacin de dos molculas de (R)-3- hidroxibutiril
CoA mediante la formacin de un enlace ster gracias a la enzima PHB polimerasa (phaC)
(Figura 3). Esta enzima es muy activa en monmeros que contienen menos de 5 tomos de
carbono. (STEINBCHEL, 1991; ZINN et al., 2001; SUDESH et al., 2000).

Sntesis de PHB. (1) -Cetotiolasa (2) acetoacil CoA reductasa (3) PHB polimerasa
SNTESIS DE PHAMCL
Uno de los factores clave en la sntesis de PHAMCL es la enzima pha sintasa del grupo II,
producida por Pseudomonas, la cual es diferente a la pha sintasa producida por C. necator
en cuanto a la afinidad que tiene por sustratos que poseen de 6 a 16 tomos de carbono
(AMARA & REHM, 2003).
Distintas vas metablicas han sido propuestas para la biosntesis de PHAMCL a partir de
diferentes tipos de sustrato (Figura 4).
A partir del metabolismo de carbohidratos, son producidas molculas de acetil-CoA, las
cuales, va malonil-CoA, son incorporadas a la biosntesis de novo de cidos grasos, donde
es generado el 3-hidroxiacil, el cual es transportado de la ACP (Acyl carrier Protein) para la
coenzima A (CoA) y ah, es polimerizado por la accin de la pha sintasa (REHM et al. 1999).

Vas metablicas propuestas a partir de diferentes sustratos
(http://mbel.kaist.ac.kr/lab/index_en.html)
El metabolismo de los cidos grasos (-oxidacin) es una de las vas ms comunes para
producir PHA de cadena media. La composicin de estos polmeros est directamente
relacionada con la estructura de la fuente de carbono. Cuando el sustrato posee de 6 a 12
tomos de carbono, los monmeros de PHA poseen la misma longitud, o tienen 2, 4 o 6
carbonos menos. Cuando se suministran cidos grasos de 13 a 18 carbonos, la composicin
del PHA no es relacionada con la longitud del sustrato, debido a que el monmero ms
largo que es incorporado posee 12 o 14 carbonos, aunque en su estructura puede presentar
insaturaciones (VILA-LEN, 2007). Aun no est claro si una epimerasa, 3-cetoacil
reductasa o enoil-CoA hidratasa (Figura 5) es la encargada de realizar el transporte de
intermediarios de la -oxidacin para la sntesis de PHAMCL (GOMEZ, 2000).

Ruta metablica de Biosintesis de PHA a partir de cidos Grasos
(http://mbel.kaist.ac.kr/lab/index_en.html)
DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE PHA
Diferentes tcnicas han sido empleadas para la deteccin de grnulos de polmero
intracelular. Los colorantes lipoflicos negro de Sudn (SCHLEGEL et al. 1970) azul de Nilo
A, y rojo de Nilo (KRANZ et al. 1997) son utilizados ampliamente. Este ltimo produce una
fuerte fluorescencia naranja a una longitud de onda de 543nm han sido utilizados para
distinguir colonias acumuladores de PHA de las colonias que no acumulan el polmero.
(SPIEKERMAN et al. 1999).
El mtodo cuantitativo para deteccin de polihidroxialcanoatos es mediante cromatografa
de gases, utilizando como patrn interno cido benzico, el cual establece tiempos de
retencin determinados para cada uno de los tipos de estructuras y cantidad de carbonos
presentes en ellas. Para realizar esta cuantificacin es necesario extraer los PHA de las
clulas previamente y despolimerizarlos mediante mtodos como metnolisis para formar
metil-steres (BRAUNEGG et al., 1978) o propanlisis para formar propil-steres (RIIS &
MAI, 1988)
La cuantificacin de los Polihidroxialcanoatos tambin se realiza mediante el anlisis
espectroscpico de Resonancia Magntica Nuclear con C13 (C13-NMR). Esta tcnica es muy
til para PHASCL, pero presenta complicaciones con PHAMCL saturados e insaturados
debido a la equivalencia de los cambios qumicos en los tomos de carbono y los patrones
protnicos del espectro de NMR.
METABOLISMO DE CIDOS GRASOS
Los triglicridos son lpidos formados por la unin de tres molculas de cidos grasos con
una molcula de glicerol mediante un enlace ster. Los cidos grasos constituyentes de la
estructura del glicerol difieren generalmente en su estructura. Los aceites estn
compuestos de triglicridos, los cuales por accin de lipasas, son hidrolizados a cidos
grasos. (Figura 6) El glicerol es fosforilado y oxidado a dihidroxiacetona fosfato, el cual es
un intermediario de la gliclisis, para convertirse finalmente en acetil-CoA, molcula
precursora de diferentes vas metablicas, entre ellas, ciclo de Krebs y Biosntesis de novo
de cidos grasos. (ROMERO, 2006).

Hidrolisis de Triglicridos (http://www2.ufp.pt/~pedros/bq/fatty.htm)
-OXIDACIN DE CIDOS GRASOS
Un amplio grupo de bacterias pueden crecer y dividirse en cidos grasos de cadena larga
que son oxidados a Acetil-CoA por una va metablica denominada oxidacin (WHITE,
2OOO). Esta ruta consiste en una serie de 4 reacciones, al final de las cuales, el acil-CoA
ser reducido a dos carbonos, liberados en forma de Acetil-CoA. (Figura 7).
En el modelo propuesto para E. coli por DiRUSSO y colaboradores (1999) los cidos grasos
entran a la clula mediante un mecanismo de translocacin que involucra a dos enzimas:
FadL, que sirve como receptor de los cidos grasos y ayuda a su paso a travs de la
membrana externa; y fadD (Acil-CoA Sintetasa), protena encargada de la activacin del
cido graso internalizado. La oxidacin de esta molcula activada se da mediante la accin
de las protenas fadF y fadG (Acil-CoA deshidrogenasa), las cuales tienen afinidad por
sustratos de cadena media-larga y cadena corta respectivamente. El producto generado es
un enoil-CoA (Acil-CoA con insaturacin en la posicin 2). El producto del gen fadE es una
flavoprotena encargada del transporte de electrones necesarios en la accin de las Acil-
CoA deshidrogenasas.

Modelo de -Oxidacin de cidos Grasos Modificado de DiRusso, 1999
Las enzimas que continan con el proceso oxidativo de los cidos grasos estn agrupados
en un complejo multienzimtico conocido como el opern fadBA, en el cual son producidas
las siguientes enzimas: 2-enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacilCoA deshidrogenasa, 3-oxoacil-
CoA tiolasa, 3-hidroxiacil-CoA epimerasa y -cis 2-trans-enoil-CoA isomerasa. Este
complejo est compuesto por una subunidad alfa de 78 kDa y una subunidad beta de 42
kDa. (PRAMANIK et al., 1979; KUNAU et al. 1995).
2.5.2. cidos grasos insaturados Los principales cidos grasos presentes en los aceites
vegetales son el cido oleico el cual presenta una instauracin en el carbono 9 (C18:19) y
el cido linolico, el cual posee dos insaturaciones (C18:29,12). Estos dos cidos grasos
representan ms del 70% de la composicin general de estas sustancias de origen natural.
(VANZIN, 2008). La oxidacin de estos cidos grasos requiere de dos enzimas ms, enoil-
CoA isomerasa y 2,4 dienoil-CoA reductasa para que el proceso de degradacin contine.
La enzima enoil-CoA isomerasa es la responsable por la conversin de compuestos cis-3-
enoil-CoA para trans-2-enoil-CoA, debido a que la acil-CoA deshidrogenasa no reconoce
molculas con conformacin cis. Esta enzima acta en las insaturaciones que se extienden
de un carbono impar hacia un carbono par. Despus de esta isomerizacin el ciclo de
oxidacin contina normalmente. (KUNAU, 1987).
La enzima 2,4 dienoil-CoA reductasa dependiente de NADH es especifica cuando el doble
enlace se extiende de un carbono par hacia uno impar. Partiendo de esta premisa, el cido
linoleico, que posee dos insaturaciones (C18:29,12) es oxidado hasta 3-cis-dodecenoil-
CoA. Luego una enoil-CoA isomerasa acta, generando 2trans-6-cis-dodecadienoil-CoA, el
cual entra de nuevo al ciclo de -oxidacin y se produce 2-trans-4-cis-decadienoil-CoA. Es
aqu cuando es necesaria la reduccin de este compuesto mediante la 2,4 dienoil-CoA
producida a partir del gen fadH, para generar 3-trans-decenoil-CoA, molcula la cual es
intermediaria del ciclo de oxidacin. Es as como las insaturaciones (dobles enlaces) son
manipulados por isomerasas cuando se extienden de carbonos impares a pares, por
isomerasas y reductasas cuando las insaturaciones se extienden de carbonos pares a
impares (STRYER, 1998; SCHULZ & KUNAU, 1987), de 78 kDa y una subunidad beta de 42
kDa. (PRAMANIK et al., 1979; KUNAU et al. 1995).
CIDOS GRASOS INSATURADOS
Los principales cidos grasos presentes en los aceites vegetales son el cido oleico el cual
presenta una instauracin en el carbono 9 (C18:19) y el cido linolico, el cual posee dos
insaturaciones (C18:29,12). Estos dos cidos grasos representan ms del 70% de la
composicin general de estas sustancias de origen natural. (VANZIN, 2008). La oxidacin
de estos cidos grasos requiere de dos enzimas ms, enoil-CoA isomerasa y 2,4 dienoil-CoA
reductasa para que el proceso de degradacin contine.
La enzima enoil-CoA isomerasa es la responsable por la conversin de compuestos cis-3-
enoil-CoA para trans-2-enoil-CoA, debido a que la acil-CoA deshidrogenasa no reconoce
molculas con conformacin cis. Esta enzima acta en las insaturaciones que se extienden
de un carbono impar hacia un carbono par. Despus de esta isomerizacin el ciclo de
oxidacin contina normalmente. (KUNAU, 1987).
La enzima 2,4 dienoil-CoA reductasa dependiente de NADH es especifica cuando el doble
enlace se extiende de un carbono par hacia uno impar. Partiendo de esta premisa, el cido
linoleico, que posee dos insaturaciones (C18:29,12) es oxidado hasta 3-cis-dodecenoil-
CoA. Luego una enoil-CoA isomerasa acta, generando 2trans-6-cis-dodecadienoil-CoA, el
cual entra de nuevo al ciclo de -oxidacin y se produce 2-trans-4-cis-decadienoil-CoA. Es
aqu cuando es necesaria la reduccin de este compuesto mediante la 2,4 dienoil-CoA
producida a partir del gen fadH, para generar 3-trans-decenoil-CoA, molcula la cual es
intermediaria del ciclo de oxidacin. Es as como las insaturaciones (dobles enlaces) son
manipulados por isomerasas cuando se extienden de carbonos impares a pares, por
isomerasas y reductasas cuando las insaturaciones se extienden de carbonos pares a
impares (STRYER, 1998; SCHULZ & KUNAU, 1987), 2.6.
PSEUDOMONAS SPP.
Pseudomonas spp., es un gnero de bacterias aerbicas, Gram-negativas,
quimiohetertrofas, mviles y de forma bacilar (MERCADO-BLANCO, 2007) adaptadas a un
gran variedad de ambientes debido a sus simples requerimientos nutricionales y por la
misma razn ampliamente distribuido en el suelo formando asociaciones con plantas.
Crecen a pH casi neutro y en temperaturas mesoflicas, hasta 43 C. Se ha reportado que
muchas especies de Pseudomonas crecen eficientemente en medios qumicamente
definidos conteniendo diferentes compuestos alifticos (carbohidratos, cidos grasos,
cidos dicarboxlicos y tricarboxlicos, alcoholes) y aromticos como fuente de carbono
(MARTNEZBLANCO et al., 1990; MIAMBRES et al., 1996).
Metablicamente, las especies pertenecientes a este gnero bacteriano presentan
caractersticas muy similares entre s, las principales pruebas bioqumicas se encuentran
resumidas en la Tabla
Muchas especies de Pseudomonas pertenecientes al grupo I de homologa rRNA producen
PHA con diversos grupos funcionales tales como halgenos, alquilos ramificados, fenilos,
fenoxilos, olefinas y steres, cuando son cultivados con las correspondientes sustancias
qumicas (KIM et al. 2000).
Principales Caracteristicas metablicas de Pseudomonas (BERGEY, 2005)
Prueba Bioquimica Resultado
Oxidasa +
Indol -
Rojo de Metilo -
Voges Proskauer -
Citrato +
Catalasa +

CLASIFICACIN CIENTFICA DE PSEUDOMONAS SP
Dominio: Eubacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gamma Proteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Gnero: Pseudomonas
Las Pseudomonas poseen una amplia variedad de enzimas lipolticas, las cuales son de vital
importancia para su metabolismo. P. fluorescens y P. aeruginosa presentan enzimas
hidrolticas de tipo ster enantioselectivas, las cuales las hacen participes de los procesos
de biotransformacin y esterificacin.
Los primeros reportes de la produccin de PHAMCL por Pseudomonas fueron en la especie
P. oleovorans, describiendo la produccin de polmero conteniendo 3hidroxioctanoato por
la metabolizacin de cidos grasos de cadena media, larga y tambin en alcanos (KESSLER
Y PALLERONI, 2000). Hoy en dia se tiene conocimiento de la capacidad productora de todas
las Pseudomonas fluorescentes (BALLISTRERI et al. 2001).
El efecto de la temperatura en el crecimiento y en la posterior produccin de PHA tambin
ha sido estudiado en Pseudomonas (HABA et al. 2006) mostrando que a diferentes
temperaturas la composicin monomrica del polmero puede ser modificada.
CARACTERSTICAS GENERALES DE Pseudomona putida
PSEUDOMONA PUTIDA
Clasificacin de la Pseudomona Putida
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Pseudomonadales
Familia: Pseudomonadaceae
Gnero: Pseudomonas
Especie: Pseudomona Putida
Crecimiento:
Crecen ptimamente entre 25-30C y un pH 6-8 en hbitats oxigenados, por lo que pueden
ser fcilmene aisladas en suelo y agua.
Tiene lpidos importantes que se desarrollan como un mecanismo de adaptacin para
responder a las tensiones fsicas y qumicas. La bacteria es capaz de cambiar su grado de
saturacin de cido graso, la formacin de ciclopropano cidos grasos, y la isomerizacin
cis-trans. En las diferentes fases, la clula cambia sus caractersticas de responder mejor
para el medio ambiente. Durante la transicin del crecimiento a la fase estacionaria, hay un
mayor grado de saturacin de cido graso y una fluidez de la membrana superior que
mejora la captacin de sustrato.
LAS PRUEBAS BIOQUMICAS
A continuacin se mencionan las pruebas bioqumicas que se utilizaran para identificar la
Pseudomona putida, para esto debemos de recordar cuales son las especificaciones de la
bacteria tal como que es aerobia estricta, mesofilo, con cierta movilidad y que pertenece al
grupo de las pseudomonas fluorescentes... por lo tanto las pruebas bioqumicas que te
ayudaran a identificar a la bacteria son las siguientes:
Prueba oxidasa (positiva)
Fundamento: Los discos contienen oxalato de dimetil-para-fenilendiamina, el cual es el
sustrato de la enzima oxidasa. Los microorganismos que producen la enzima oxidasa se
evidencian porque en presencia de oxgeno atmosfrico y citocromo c, se oxida el sustrato
presente en los discos a un compuesto de color rojo fucsia.
Siembra:
En tubo: a partir de un cultivo puro, hacer una suspensin densa en 0.2 mL de agua
de destilada estril, y agregar un disco de OX.
En portaobjetos: humedeces el disco OX con una fota de agua y luego colocar sobre
el la colonia en estudio (esta metodologia se utiliza cuando se tiene escaso nmero
disponible de colonias en estudio).
Incubacin: Generalmente dentro del minuto, y a temperatura ambiente se detectan los
resultados positivos, una reaccin lenta pasados los 2 minutos debe considerarse negativa.

Resultados: Se debe tomar como positivo el cambio de color a fucsia y como negativo el
que no cambie de color.
Algunas de las limitaciones son que la prueba debe usarse con cultivos frescos (18-24 hrs) y
que no provengan de medios con azucares.
Prueba catalasa (positiva)
Fundamento: La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias.
Descompone el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas
procedentes del oxgeno indica que la prueba es positiva.
Mtodo: En un portaobjetos se coloca una gota de perxido de hidrgeno al 30% con ayuda
de una pipeta pasteur despus se suspende la bacteria. Reacciona casi al instante y se
considera negativa aquella reaccin lenta sin formacin de burbujas.
Fermentacin de glucosa (medio o/f) (negativa)
Fundamento: Se basa en la determinacin del metabolismo oxidativo o fermentativo de un
hidrato de carbono. Las bacterias oxidativas producen cido solo en el tubo
abierto expuesto al oxigeno atmosfrico; los microorganismos fermentadores producen
cidos en ambos tubos; las bacterias no sacaroliticas son inertes en este medio
y permanecen con un pH alcalino.
Procedimiento: Se debe preparar el medio bsico de Hugh Leifson, cuyo indicador es el azul
de bromotimol, que vira de color dependiendo del pH del medio.
Son necesarios dos tubos del medio para la prueba. El medio de un tubo se expone al aire y
el otro se cubre con aceite mineral o parafina lquido.
Resultados:
O / F
Amarillo/amarillo: Fermentativo facultativo
Amarillo/verde: oxidativo
Verde/amarillo: Fermentador estricto
Azul/azul: no fermentador (usa peptonas)
Y una de las representativas es la prueba king b (positiva)
Fundamento: en el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de
pigmentos, la concentracin de fosfatos estimula la produccin de fluorescena e inhibe la
produccin de piocianina y piorrubina.
Siembra: a partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de
Pseudomonas spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio.
Incubacin: Durante 18-24 horas a 35-37 C, en condiciones aerobias. Si no se observa
crecimiento, re-incubar a 25-30C, o dejar a 22C y observar diariamente hasta 7 das.
Nota: algunas cepas de P. putida solo producen fluorescena a temperatura ambiente, y se
pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 30-35C, por eso, ante
la ausencia de crecimiento luego de incubacin a 35-37C,se recomienda dejar los tubos
dejar los tubos conteniendo el medio a temperatura ambiente.
Resultados: Examinar las colonias bajo luz ultravioleta a 260nm. Se considera un resultado
positivo la observacin de fluorescena, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-
verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por el medio de cultivo debido
a fenmenos de difusin.

DISEO DEL BIOREACTOR
Para la preparacin de los preinculos y para la realizacin de ensayos de biodesulfuracin,
(BDS) se han empleado incubadoras orbitales, mientras que la produccin del biocatalizador
se ha realizado en un fermentador comercial.
TANQUE AGITADO
-
Biotech, diseado de manera que todas las aplicaciones necesarias para la operacin del
fermentador, bombas de dosificacin, componentes de aporte de energa y mdulos de
medida y control estn combinados formando una unidad bsica. Consta de dos agitadores
tipo turbinas de 6 palas rectas cada uno. El control automtico de la temperatura, a 30C,
se mantiene gracias a la recirculacin de agua por una doble camisa. En la siguiente figura
se representa un esquema del equipo.


Unidad de Control Fermentador BIOSTATB
La unidad de control utilizada con los dos tipos de reactores incluye sistemas de medida y
control de temperatura, agitacin, pH y oxgeno disuelto.
Sistema de Medida y Control de la Temperatura: La unidad cuenta con un controlador digital
PID. La medida se realiza con un sensor de Pt-100 y el control se lleva a cabo mediante una
vlvula de refrigeracin y una resistencia de 600 W. La temperatura de operacin se
selecciona y ajusta mediante un indicador digital, con una sensibilidad de 0,1C. El intervalo
de medida es de 0 a 100C.
Sistema de Medida y Control de la Agitacin: La unidad cuenta con un controlador digital
PID, ajustndose la velocidad a travs de un motor de 180W de potencia mxima, que ejerce
su accin sobre una varilla de acero inoxidable, sobre la que se encuentran dos agitadores
de turbina de seis palas planas. La velocidad de agitacin se mide con un tacmetro
ajustable entre 0 y 1200 rpm, con una resolucin de 10 rpm.
La aireacin del caldo se consigue suministrando aire por burbujeo, mediante un
compresor, filtrndose a travs de un filtro que posee una membrana de 0.2m, para que
el aire se introduzca en el reactor estril. El aire se distribuye en el interior mediante un
difusor toroidal. El caudal de aire se ajusta con una vlvula y un rotmetro, y se puede
regular automticamente.
Sistema de Medida y Control de pH: En este caso tambin cuenta la unidad con un
controlador digital PID que acta sobre las bombas de alimentacin de cido y de base en
funcin de la seal de medida, previamente amplificada. Se utiliza un electrodo INGOLD,
cuyo rango de medida vara entre 2 a 12 unidades de pH. La calibracin es realizada
mediante un sensor digital.
Sistema de Medida y Control de Oxgeno Disuelto: La unidad cuenta con un controlador
digital PID del oxgeno disuelto en cascada, actuando directamente sobre la velocidad de
agitacin, es decir, sobre la velocidad de giro del agitador. La medida de la concentracin
de oxgeno disuelto se realiza con un electrodo esterilizable INGOLD, cuyo rango de medida
vara entre 0 y 100%. La calibracin se realiza con un sensor digital.
Electrodo de Oxgeno disuelto
Para la medida del oxgeno disuelto se utiliza un electrodo de O2 disuelto polarogrfico
esterilizable (Ingold Mod. 82). Consiste en un ctodo de platino y un nodo de Ag/AgCl
conectados conductimtricamente por un electrolito, separados de la solucin mediante
una membrana permeable al gas.
Compresor de aire
El aire comprimido se consigue mediante un compresor Atlas Copco GA5, con una presin
mxima de descarga de 10 bar y es almacenado en un pulmn pasando por una serie de
accesorios cuya funcin es la de secar y eliminar tanto el aceite como el polvo de la corriente
gaseosa que llega al fermentador.
Medidor de flujo msico
El caudal de aire introducido en el reactor a travs del difusor de gas se ha determinado
utilizando para ello un medidor de flujo msico, GFM37 AALBORG, con un intervalo de
operacin de 0 a 20 L/min en condiciones estndar, y un tiempo de respuesta de 2s, con
una variacin del 2%.
Electrodo de pH
Se utiliza un electrodo combinado de pH METTLER TOLEDO de Ag/AgCl, cuyo rango de
medida vara entre 0 y 12 unidades de pH y permite una temperatura mxima de 130C. El
calibrado del electrodo se realiza con un sensor digital. El control de pH en el interior del
fermentador se consigue mediante un controlador digital PID que acta sobre las bombas
de alimentacin de cido y de base.

MATERIALES Y MTODOS
Microorganismos y Plsmidos Las cepas utilizadas y plsmidos que fueron utilizados estn
descritos en las tablas.
Microorganismos utilizados

Medios de cultivo Los medios de cultivo fueron esterilizados en autoclave durante 20
minutos a 121 C, 1 atm. En la preparacin de los medios minerales, la fuente de carbono
y el agar-agar fueron esterilizados y adicionados despus de la esterilizacin de la solucin
de sales.
Medio LB (Luria-Bertani)

Medio Mineral

Cada litro de solucin de elementos traza contiene:

Condiciones de cultivo Las bacterias del gnero Pseudomonas fueron reactivadas en
medio LB durante 24 horas, 30C 150rpm. Luego fueron sembradas en agar LB durante 24
horas a 30C. Posteriormente fueron sembradas en agar MMGGm, MM4P, MM4PGm,
MMV durante 72 horas a 30 C. Tambin se cultiv P. putida IPT 046 en MML y MMLGm.
Escherichia coli fue cultivada en medio LB suplementado con antibitico, durante 24 horas
a 37 C, 150 rpm.
Los antibiticos fueron preparados de acuerdo a SAMBROOK et al. (1989), esterilizados
mediante filtracin por membrana de 0.22m (Millipore) y posteriormente adicionados a
los medios de cultivo en las concentraciones indicadas en la tabla.
Antibiticos y concentraciones utilizadas

Balanza de precisin
Para la cuantificacin del peso de los diferentes compuestos se ha empleado una balanza
analtica digital METLER-TOLEDO, modelo AB104. Esta balanza tiene una precisin de
0,1mg.
Autoclave
La esterilizacin de todos los medios y materiales se ha realizado en un autoclave RAYPA,
modelo AE110, con capacidad de 110L.
Incubadoras orbitales
Para la preparacin de preinculos y para la realizacin de ensayos a escala erlenmeyer se
han utilizado dos incubadoras orbitales, modelos CERTOMAT H y R de B. Braun-Biotech,
S.A.
Las caractersticas en ambas incubadoras son: - control de temperatura entre 5C y 70C,
con fluctuacin 0,1- 0,5C. - control de velocidad de agitacin entre 0 y 400rpm. -
capacidad de 25 erlenmeyer de 250mL.
Campana de flujo laminar
Se ha empleado una cmara de flujo vertical marca TELSTAR, modelo AV-30/70, para las
operaciones de manipulacin que requeran condiciones de esterilidad.
Centrfugas
La centrifugacin de los caldos de cultivo se ha llevado a cabo en una centrfuga refrigerada
marca HERAEUS # 3334. El intervalo de temperaturas ha sido de -9C a + 40C. Esta
centrfuga dispone de un rotor con capacidad mxima de carga de 6 x 140g. La velocidad
mxima de agitacin es de 19000rpm.
La centrifugacin de las muestras se ha llevado a cabo en una centrfuga de tubos
eppendorf no refrigerada marca EPPENDORF, modelo 5415 D. Esta centrfuga dispone de
un rotor para 14 x 1,5mL. La velocidad mxima de agitacin es de 16100rpm.
Ultrasonidos
Para realizar operaciones de limpieza se ha utilizado una unidad de ultrasonidos J. P.
SELECTA, modelo 3000514, con capacidad de 9L, sin calefaccin y con una potencia
equivalente a 200W.
Ensayos de acumulacin de polmero a partir de cido linolico
Clulas de Pseudomonas putida IPT 046 y de los mutantes fueron sembradas en placas con
agar LB. Colonias aisladas de estas placas fueron inoculadas en 25mL de medio LB en
agitacin continua 30 C, 24h, 150rpm. Una alcuota de este cultivo (6%) fue transferida
para 50mL de MM con glucosa (5g/L), en agitacin 30 C, 24h, 150rpm. Despus de este
tiempo, las clulas fueron lavadas y resuspendidas en solucin salina. Esta suspensin fue
utilizada para inocular 50mL de MM sin fuente de nitrgeno y con cido linoleico (2.5 g/L)
como fuente de carbono. Despus de 48 horas de cultivo fueron analizados: masa seca
celular, pH y composicin de PHA.
Determinacin de Masa seca celular (MSC)
10 mL de suspensin celular fueron centrifugados (10000rpm, 10 min, 4 C). El pellet
obtenido fue resuspendido en solucin tween 80 a 0,1% (v/v) y nuevamente centrifugado.
Fue resuspendido en SS y filtrado a travs de membranas de poro 0.45m (Millipore). La
membrana con las clulas fue secada en un horno durante 4 horas a 100 C. Luego de este
tiempo, las membranas fueron colocadas en un desecador durante 20 minutos a
temperatura ambiente. Pasado este periodo, fue determinada la masa celular con la
siguiente ecuacin:
MS= [(MMC MM + HM)/VOL] X 1000
Donde:
MMC= masa de la membrana y clulas despus del secado
MM= masa de la membrana
HM= humedad relativa media del lote de membranas
VOL= volumen de suspensin centrifugado
pH
El pH fue determinado a partir del sobrenadante obtenido de la centrifugacin, en un
potencimetro (Mettler modelo Delta 350) utlizando patrones de pH de 4,0; 7,0 y 9,0
(Ingold Mettler Toledo Int. Inc.).
Cantidad y composicin de PHA
Para determinar la cantidad y la composicin de PHA, fue el mtodo de propanlisis descrito
por Riis y Mai (1988), en donde se tomaron 20mg de clulas liofilizadas, se adicionaron 2mL
de solucin de cido clorhdrico (HCl) 0,1N en propanol (1:4) v/v, 2mL de 1,2-dicloroetano
y 200L de solucin de 40g/L de cido benzoico en propanol, como patrn interno. Los
tubos fueron cerrados, agitados y sometidos por 3 horas a 100C en bao de Mara,
agitndolos despus de los primeros 30 minutos.
Se enfriaron a temperatura ambiente y se les adicion 4mL de agua Milli-Q, agitando
vigorosamente por 30seg. La fase acuosa (superior) se descart y la fase orgnica (inferior)
que contiene los propil-steres fue analizada en cromatgrafo de gases HP6890 Series GC
System equipado con una columna HP-5 (5% fenil- metilsiloxano, 30m de alto; 0,25 mm de
dimetro; 0,25 m de espesor del filme). El anlisis fue llevado a cabo bajo las siguientes
condiciones: Gas de arrastre: Helio (0,8 ml/min), temperatura del inyector: 250 C,
temperatura del detector: 300 C, sistema de deteccin: Ionizacin de llama (FID),
programa de temperatura: 100C por 1 minuto, aumento de la temperatura hasta 185C a
8 C por min y 185 C por 15 minutos. Fue usado cido benzico como patrn interno y
polmeros producidos por P. oleovorans fueron utilizados como patrones externos. Para el
anlisis de monmeros conteniendo insaturaciones, especialmente en la regin de 12
carbonos, se us el mismo factor de respuesta del componente saturado con 12 carbonos,
es decir, el 3HDd.
CARACTERIZACIN DEL POLMERO OBTENIDO
Con el fin de establecer la temperatura de fusin y de transicin vtrea se realizan ensayos de
Calorimetra diferencial de barrido DSC, estos anlisis se realizaron en el calormetro diferencial de
barrido DSC TA Instruments, ubicado en los laboratorios de Ingeniera Qumica. El rango de
temperatura de exploracin es de 10 a 200 C con velocidad de calentamiento de 10 C / min
(Bhatt et al., 2008 ).
La caracterizacin del tipo de polmero obtenido se realiza mediante cromatografa de gases,
previa metanlisis cida siguiendo el mtodo de Braunegg et al., 1978 (Braunegg, et al 1978;
Malagn & Acosta, 2008). La inyeccin de las muestras se realiz en las condiciones descritas en la
tabla.






RECUPERACIN DEL POLMERO
Al final de la fermentacin se recupera el polmero siguiendo la tcnica reportada por Hahn, et al.,
1995, en esta tcnica se recupera la biomasa mediante centrifugacin a 5000 rpm y 4C durante 30
minutos, posteriormente la extraccin del polmero se realiza a 50C con una dispersin de
hipoclorito- cloruro de metileno al 50% v/v adicionando 100 mL por cada gramo de biomasa
recuperada, posteriormente se agita por una hora y se deja decantar por 12 horas. Se recupera la
fase orgnica y se precipita el polmero usando metanol, se filtra y se deja secando a temperatura
ambiente hasta alcanzar peso constante.
RESULTADOS
Evaluacin en la produccin de PHA por mutantes deficientes en la utilizacin de cidos
grasos insaturados
Este ensayo se realiz seleccionando 5 mutantes que presentaron, en una evaluacin
pasada (SILVA-QUEIROZ, 2007) mayor incorporacin de monmeros insaturados (3HDd6)
en comparacin con Pseudomonas putida IPT046 y usando como fuente de carbono cido
linolico (Tabla 6). Todos los mutantes evaluados mostraban un crecimiento mnimo en
cido 4-pentenico.
Composicin monomrica de PHA acumulados por P. putida IPT 046, AG46, BJ5, CF12, CN25
Y DU54, cultivadas en cido linolico*

La cepa salvaj e (IPT 046) acumul cerca de un 26% de biomasa en forma de PHA. 3HD y
3HO fueron, respectivamente, los monmeros producidos en mayor porcentaje. Si bien se
conoce que a partir de la -oxidacin del cido linolico no se produce 3HDd, este
monmero fue detectado en proporciones mnimas en todos los microorganismos
evaluados. La produccin de este compuesto probablemente se da debido a la biosntesis
de cidos grasos, en donde, molculas de Acetil-CoA producidas a partir del metabolismo
del cido linolico son condensadas hasta formar compuestos de mayor peso molecular. La
fraccin molar de 3HDd6 producida por IPT046 fue de 20,49mol %.
Los mutantes AG46 y CN25 mostraron una gran similitud en cuanto a la produccin de
3HDd6, presentando valores de 21,86 mol% y 21, 75 mol% respectivamente. Estos valores
no difieren mucho de los mostrados por la cepa salvaje IPT 046.
Los mutantes CF12 y DU54 presentaron una fraccin molar de 3HDd6 correspondiente a
23,42% y 24,95% respectivamente, mostrando valores mayores a los producidos por la cepa
salvaje. Por otro lado, el mutante DU54 acumul cerca del 42% de masa seca en forma de
PHA, adems de producir 34,5 mol % de 3HD.
El mutante BJ5 mostr la mayor incorporacin de 3HDd6 con respecto a la cepa salvaje,
con un valor de 27,6 mol %, sugiriendo algn cambio en el metabolismo de cidos grasos,
en relacin a las enzimas involucradas en reducir los dobles enlaces de las insaturaciones
que se extienden de un carbono par hacia un impar, presentada en el cido linolico.