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EXTRACCIÓN Y ELECTROFORESIS DE ADN VEGETAL OBTENIDO DE ARVEJA

J. Carrillo-Moreno
a
, J.P. Jiménez-Moncada
a
, L. Arias-Lopera
a
, M.E. Higuita-Ramírez
a

a
Estudiantes Ingeniería Química, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia

Resumen

En el presente artículo se ilustra un proceso para la extracción de una muestra de ADN vegetal
obtenido de arveja por métodos físicos como maceración y congelación y métodos químicos
mediante el uso de compuestos orgánicos como Tris, EDTA, cloroformo, CTAB, mercaptoetanol y
alcoholes (isoamílico, etanol, isopropanol). Además se muestran y justifican los resultados obtenidos
a partir de datos experimentales como el peso y la absorbancia del ADN vegetal extraído del cual se
obtuvo un valor de 1.324 que indica que hay contaminación por proteínas y una cantidad de 81.65 μg
de ADN de doble cadena en la muestra. Se presenta un análisis cualitativo de la electroforesis de ADN
realizada al ADN vegetal extraído en un gel de agarosa para la separación de las macromoléculas en la
solución donde se ve que hubo migración de moléculas a través del montaje.

Palabras clave: extracción de ADN, arveja, absorbancia, pureza, contaminación, electroforesis de
ADN, gel de agarosa.

Abstract

This article illustrates a process for extracting a DNA plant sample obtained from pea by physical
methods such as macerating and freezing and chemical methods using organic compounds such as
Tris, EDTA, chloroform, CTAB, mercaptoethanol and alcohols (isoamyl , ethanol, isopropanol). Also
depicted and justify the results obtained from experimental data such as weight and the absorbance
of the extracted plant DNA which was obtained a value of 1.324 indicates that there is contamination
by proteins and an amount of 81.65 μg of double stranded DNA in the sample. It presents a
qualitative analysis of DNA electrophoresis on DNA extracted plant in an agarose gel for separation of
macromolecules in solution where is seen migration of molecules through the assembly.

Keywords: DNA extraction, pea, absorbance, purity, contamination, DNA electrophoresis, agarose gel.

1. INTRODUCCIÓN
El ADN es la abreviatura del ácido
desoxirribonucleico (en inglés, DNA). Es una
molécula presente en todas las células de los
seres vivos y es la encargada de codificar todo
lo que nosotros somos, desde el color del pelo
hasta las proteínas que tenemos en nuestra
sangre. El ADN es una molécula cargada que
está asociada a proteínas y en el caso de los
organismos eucariontes está encerrado dentro
de un núcleo [1]. Existen diferentes métodos
físicos y químicos de extracción de ADN,
algunos ejemplos son: salting-Out, chelex y el
método de fenol-cloroformo; esta última es
una técnica que usa solventes orgánicos y
permite obtener ADN de muy buena calidad y
cantidad [2]. La extracción de ADN requiere
una serie de etapas básicas: En primer lugar
tiene que romperse la pared celular y la
membrana plasmática para poder acceder al
núcleo de la célula. A continuación debe
romperse también la membrana nuclear para
dejar libre el ADN. Los jabones utilizados como
lavavajillas emulsionan los lípidos de las
membranas celulares y las rompen. Un
detergente es una solución capaz de disolver
las membranas y así permitir que éstas se
separen del resto de los componentes. Además
este detergente es capaz de unir las proteínas
que están junto al ADN. La sal de mesa tiene
un catión que se une a la molécula de ADN y
hace que cambie sus propiedades químicas, lo
que evita la unión de las proteínas al ADN. Para
aislar el ADN hay que hacer que precipite en
alcohol. El ADN es soluble en agua, pero
cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y
precipita en la interfase entre el alcohol y el
agua. Además de permitirnos ver el ADN, el
alcohol separa el ADN de otros componentes
celulares, los cuales son dejados en la solución
acuosa [3]. El alcohol además disuelve los
azúcares y proteínas [1]. La electroforesis en
gel es un grupo de técnicas empleadas por los
científicos para separar moléculas basándose
en propiedades como el tamaño, la forma o el
punto isoeléctrico. La electroforesis en gel se
utiliza generalmente con propósitos analíticos,
pero puede ser una técnica preparativa para
purificar moléculas parcialmente antes de
aplicar espectrometría de masas, PCR,
clonación o secuenciación de ADN. [4] La
electroforesis de ácidos nucleicos es el método
habitual para separar, identificar y purificar
moléculas o fragmentos de DNA y RNA. Es un
método de separación de mezclas de
moléculas biológicas. Cuando una mezcla de
moléculas ionizadas y con carga neta son
colocadas en un campo eléctrico, estas
experimentan una fuerza de atracción hacia el
polo que posee carga opuesta. En los
tampones habitualmente utilizados, los ácidos
nucleicos están cargados negativamente y
migran hacia el ánodo. Cada molécula aporta
una carga negativa (procedente del grupo
fosfato), por lo que la relación carga/tamaño es
prácticamente constante e idéntica para todas
las moléculas, independientemente de su
tamaño (un nucleótido tendrá la misma
movilidad que un fragmento de doble cadena
de 800pb o uno de 5kb). La electroforesis de
DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o
poliacrilamida. Ambos soportes son restrictivos
para los ácidos nucleicos, de modo que los
diferentes fragmentos (al tener la misma
relación carga/tamaño), migran en función de
su tamaño y/o conformación. Los geles de
poliacrilamida (en cubetas verticales) se
emplean para fragmentos pequeños de DNA
(5-500pb), así como para la mayoría de los
RNA. Los geles de agarosa (en cubetas
horizontales) se utilizan para fragmentos
grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando
agarosas de distintas concentraciones (distinto
grado de reticulación) pueden separarse
fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo
eléctrico constante; para separar fragmentos
de tamaño superiores a 50kb se utiliza la
electroforesis de campo pulsante en la que la
dirección del campo eléctrico cambia
periódicamente. Cuando se ha completado la
electroforesis, las moléculas más pequeñas han
llegado al ánodo. Entonces se pueden 'revelar'
mediante la adición de un colorante específico
para hacerlas visibles. Se emplean compuestos
como el bromuro de etidio, para los ácidos
nucleicos, o la plata, para las proteínas.
Asimismo se emplean otros métodos para
visualizar la separación de la mezcla en el gel.
Si el reactivo es fluorescente bajo la luz
ultravioleta (radiación UV), se puede
simplemente hacer una fotografía de la placa
bajo dicha luz. También, si las moléculas
contienen átomos radiactivos se puede
efectuar una autorradiografía. Si se han
inyectado varias mezclas una junto a otra en la
placa, se producirán separaciones paralelas.
Cada separación mostrará distintas bandas
correspondientes a cada componente de la
mezcla. Si las separaciones son incompletas, se
dará un solapamiento entre bandas haciendo
indistinguibles dos o más componentes. Las
bandas en diferentes separaciones paralelas
que están a la misma distancia del principio
significa que contienen moléculas que han
atravesado el gel a la misma velocidad. Existen
marcadores especiales que contienen una
mezcla de moléculas de tamaño conocido. Si se
hace una electroforesis de un marcador con
una mezcla desconocida, las bandas
observadas en el marcador pueden ser
comparadas con las obtenidas en la mezcla
desconocida para determinar su tamaño. La
distancia a la que se encuentra la banda del
principio es (aproximadamente) inversamente
proporcional al logaritmo del tamaño de la
molécula [5]. En la práctica de laboratorio y el
informe tenemos como objetivos utilizar una
técnica sencilla para poder extraer el ADN de
un producto natural comprendiendo las etapas
para el aislamiento de la molécula, determinar
su pureza y familiarizarse con métodos de
separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en un gel de agarosa e
interpretar los datos cualitativamente.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Extracción de ADN
Para la degradación de la pared celular se
usaron métodos físicos, primero se debió
congelar por 10 minutos, macerar el material
de trabajo y posteriormente se pesó una
cantidad de éste. En la inhibición de nucleasas
se utilizó 1 mL de solución buffer 1 que
contiene: 50 mM Tris-HCl de pH 8.0; 5 mM
EDTA; 350 mM Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol;
10% polyetilenglicol. Luego de una agitación
moderada se procedió a centrifugar a 5000
rpm por un tiempo aproximado de 10 minutos
y a una temperatura de 4°C; se descartó el
sobrenadante y para resuspender el sólido y
solubilizar la membrana celular se agregó 500
μL una solución buffer 2 que contiene: 50 mM
Tris HCl de pH 8.0; 5 mM EDTA; 350 mM
Sorbitol; 0.1% Mercaptoetanol; 1% Sodio
Sarkosyl; 710 mM NaCl; 0.1%
Centiltrimetilamonio (CTAB). En la
desnaturalización y separación de proteínas se
usó una solución de cloroformo-alcohol
isoamílico en una proporción 24:1. Se hizo uso
nuevamente de la centrifugación en el mismo
intervalo de tiempo y temperatura y la fase
acuosa fue transferida a otro tubo
conservando y utilizando sólo la solución
orgánica restante. En la etapa de precipitación
se utilizó 2 volúmenes de isopropanol a una
temperatura de -20°C; para eliminarlo también
se usó el equipo de centrífuga. Hecho esto se
lavó con etanol al 70% y nuevamente se
centrifugó la solución para eliminar el alcohol.
Finalmente, se resuspendió el precipitado en
300 μL de Tris-Edta y se leyó la absorbancia en
un espectrofotómetro a 260 nm. Para este
procedimiento fueron indispensables otros
materiales como bisturí, mortero con el cual se
maceró la arveja objeto de estudio de la cual
se extrajo el ADN, tubos de ensayo con tapa,
balanza analítica para pesar el tejido luego de
macerar la arveja, pipetas de 5ml y
micropipetas, equipos y sistemas de
refrigeración como una centrífuga refrigerada y
un baño de agua a 60°C para la incubación de
la muestra, puntas para micropipetas y tubos
eppendorf.

2.2. Electroforesis
Los reactivos utilizados fueron: solución buffer
de Tris-Borato (TBE) con pH 8.0 la cual se
preparó con 54 g de Tris base, 27.5 g de ácido
bórico y 20 mL de una solución de EDTA 0.5 M,
ajustando pH y volumen a 1L; gel de agarosa al
0.8% en buffer TBE, el cual se agrega para
cubrir el gel 1 mm por encima de su parte
superior. Lo anterior fue realizado en el
laboratorio por los monitores antes de
comenzar la práctica. Adicionalmente se utilizó
buffer de carga que está compuesto por una
solución de sacarosa al 40% con azul de
bromofenol al 0.25% preparado en agua en
una proporción 1:1, para mezclar con las
muestras de ADN y colocar la mezcla en los
pozuelos del gel de agarosa ayudados por
micropipetas. Posteriormente se aplicó una
corriente eléctrica con el fin de impulsar la
migración de la molécula aproximadamente
unos 10 cm en el gel; esto se observó por la
migración de color. En una solución con
bromuro de etidio de concentración 0.5 μg/mL
el gel fue sumergido. Se utilizó un
transiluminador UV para observar las bandas
de ADN. Los materiales utilizados fueron placa
de vidrio sobre la cual se preparó el gel
horizontal, cinta de enmascarar, micropipetas
con las cuales se midieron los volúmenes y se
adicionaron las muestras mezcladas dentro del
gel de agarosa y mechero utilizado en la
preparación del gel.

Todos los implementos (reactivos e
instrumentos) utilizados y anteriormente
mencionados fueron facilitados por los
laboratorios de la Universidad de Antioquia,
lugar en el cual se realizaron los
procedimientos.

3. RESULTADOS


1
La pureza de ADN obtenido se calcula por la
relación

2
La cantidad de ADN de doble cadena se
obtiene por la siguiente ecuación [6]:



; para nuestro caso el
factor de dilución fue de 1 mL de H
2
O.

De acuerdo a los resultados obtenidos
mediante la relación para determinar la pureza
del ADN obtenido podemos afirmar que hubo
una posible contaminación por proteínas ya
que el valor hallado se encuentra por debajo
del rango de 1.7 [7], aunque podemos decir
que el valor de pureza obtenido es aceptable
ya que el resultado no está por debajo de 1.0
valor en el cual se considera que se presenta
alta contaminación por proteínas. La cantidad
de ADN calculada es coherente según la
cantidad de muestra que se pesó en el
laboratorio, ya que el orden de unidades de la
cantidad de ADN calculada (μg) es menor que
el orden de la cantidad pesada de la muestra
(mg).



Gráfica 1. Imagen tomada en el laboratorio de
la electroforesis de ADN en gel de agarosa.

De la imagen puede verse que no es posible
hacer un análisis cuantitativo de los pares de
bases contenidos en el ADN vegetal, aunque el
número de pares de bases de la arveja es de
Tabla 1. Datos de laboratorio y resultados
Peso muestra (mg) 75.5
Absorbancia
λ = 260 nm
1.633
Absorbancia
λ = 280 nm
1.233
Pureza
1
1.324
Cantidad de ADN
2
(μg) 81.65
aproximadamente 3000. Sin embargo,
cualitativamente puede verse que hubo una
migración de moléculas en el carril donde se
ubicaba el patrón y en uno de los carriles
iniciales de izquierda a derecha. El factor luz
tampoco permite que la imagen sea
suficientemente nítida para hacer una
caracterización, además de otros eventos que
antecedieron a la práctica de lo cual se hablará
en la sección de causas de error.

4. CAUSAS DE ERROR.

Muchas son las razones para justificar el
resultado de pureza de ADN obtenido (1.324).
Empezamos por las condiciones del material de
inicio, suponiendo que los métodos físicos no
fueron suficientes o correctamente realizados
para romper las primeras barreras de
extracción y en esta etapa pudo haber
contaminación e interferencias por material
biológico humano [2]. En la etapa de
extracción mediante solventes orgánicos una
cantidad significativa de clorofila quedó
disuelta en la fase acuosa cuando lo debido fue
que hubiese quedado disuelta en la fase
orgánica, por lo tanto, existe un factor de
contaminación por clorofila; esto lo pudimos
deducir porque el pellet tenía un color
bastante verdoso, característica del
componente. Es posible también que la
cantidad de solución a la que leímos la
absorbancia no haya estado bastante
concentrada y se haya descartado una
cantidad significativa con el sobrenadante.
Aunque de la imagen es posible ver una
migración de moléculas no nos es posible
percibir un número de bandas. Un hecho que
antecedió a la práctica fue que la nevera donde
se almacenaba el patrón en el laboratorio no
estuvo en funcionamiento durante un tiempo
por causas propias del quehacer universitario
por lo que el patrón pudo haberse dañado o
deteriorado y esto no permitió ver bandas
definidas, además del factor luminosidad UV
mencionado en la sección anterior, ya que para
el uso de este tipo de luz se necesita un cuarto
totalmente oscuro y había gran filtración de luz
visible a la habitación; lo anterior no permite
que hagamos un análisis cuantitativo del ADN
vegetal extraído para hacerlo, sugeriríamos en
situaciones futuras usar métodos electrónicos
como el método PCR que permite hacer una
cuantificación bastante ajustada sobre las
bandas que se obtienen.

5. REFERENCIAS.
[1] http://www.chilecientifico.cl/ciencia-
divertida-informacion-general-103/187-
extraccion-de-adn.html
[2]
http://www.slideshare.net/marcia_karina/extr
accion-adn
[3]
http://www.educa.madrid.org/web/ies.antoni
ogala.mostoles/dep_bio_archivos/EXTRACCIO
N_DE_ADN.pdf
[4]
http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en
_gel
[5]
http://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/
timag/trabajos/2006/electroforesis/
[6]
http://sebbm.es/BioROM/contenido/av_biom
o/Guiones_Biomol.pdf
[7]
http://www.bancoadn.org/documentacion/ext
raccionADN.pdf