Prctica de laboratorio Genmica Humana Medicina Curso 2012-2013

Objetivo

Los minisatlites de DNA se definen usualmente como repeticiones en tndem de una secuencia
ms o menos corta de nucletidos (6-100 bp) que suelen extenderse desde 0.5 a varias kilobases.
Una de las caractersticas ms sobresalientes de estos es la variabilidad en cuanto al nmero de
repeticiones que presentan en los distintos individuos de una poblacin. Por ello, a estas regiones
tambin se las conoce como VNTR (variable number of tandem repeats - nmero variable de
repeticiones en tndem). Este polimorfismo en su longitud abri las puertas a su uso en la
identificacin de individuos mediante huellas genticas ("DNA fingerprinting").
En esta prctica vamos a analizar una de estas regiones del genoma humano, el locus D1S80,
situado en el cromosoma 1 (1p36-p35; coordenadas chr1:2390684-2391309 en el genoma de
referencia). Este locus est situado en una regin intergnica y no ha sido asociado con enfermedad
alguna. En este locus se localiza un VNTR hiperpolimrfico con una unidad de repeticin de 16 bp
repetida de 10 a 55 veces, aunque los alelos ms frecuentes en poblaciones europeas son los
correspondientes a 24 (aprox. 35-40%) y 18 repeticiones (aprox. 20%). Otros alelos en estas
poblaciones con frecuencias de alrededor de un 5% tienen 25, 28, 29 y 31 repeticiones. La
heterozigocidad ronda el 80%.
Para estimar el nmero de repeticiones de este VNTR en nuestro propio genoma, vamos a
amplificar fragmentos de DNA de los loci D1S80 mediante PCR para posteriormente separarlos de
acuerdo a su longitud. Para ello, llevaremos a cabo una electroforesis en gel de agarosa. Con los
oligonucletidos que usaremos como "primers" (cebadores) esperamos obtener bandas de tamao
variable de entre 386 a 802 bp. Las que aparecern ms frecuentemente tendrn un tamao de 546
bp (24 repeticiones) y 450 bp (18 repeticiones).
El genoma de referencia cuya secuencia se encuentra depositada en las bases de datos de
genomas (e.g. Ensembl) contiene 29 repeticiones. A continuacin se expone la secuencia (slo se
muestra la cadena reverse) que se obtendra si utilizramos los "primers" de nuestra prctica. La
secuencia de los "primers" est coloreada en azul, y las repeticiones se alternan en rojo y verde. La
secuencia de cada individuo puede variar, no solamente porque el nmero de repeticiones vara, sino
tambin porque a veces podran producirse mutaciones puntuales u otros cambios que alteren la
misma. Esto no obstante no podremos saberlo si no secuenciamos nuestros productos de PCR.
GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCGTCCACGGCCGGCCGGTCCTGCGTGTGAATTAC
TCAGGAGCGTATTCCCCACGCGCCAGCACTGCATTCAGATAAGCGCTGGCTCAGTGTCAG
CCCAAGGAAGACAGACCACAGGCAAGGAGGACCACCGGAAAGGAAGACCACCGGAAAGGA
AGACCACCGGAAAGGAAGACCACAGGCAAGGAGGACCACCGGAAAGGAAGACCACAGGCA
AGGAGGACCACAGGCAAGGAGGACCACCGGAAAGGAAGACCACCGGCAAGGAGGACCACC
GGCAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGGAC
CACCAGGAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGAACCACCAGGAAGGA
GGACCACCGGCAAGGAGGACCACCGGCAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGAACCACCAGGA
AGGAGGACCACCGGCAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGAACCACCAGGAAGGAGGACCACC
AGGAAGGAGGACCACCAGGAAGGAGGACCACTGGCAAGGAAGACCACCGGCAAGGCTGCA
AGGGGCACGTGCATCTCCAACAAGAC

Procedimiento

La prctica constar de tres partes:
1. Extraccin de DNA genmico de clulas de la boca.
2. Amplificacin del locus D1S80 mediante PCR.
3. Separacin y visualizacin del DNA amplificado en un gel de agarosa.

Extraccin de DNA genmico

Para conseguir el DNA genmico que se utilizar de molde en la reaccin de PCR, primero
obtendremos clulas de nuestra cavidad bucal y las expondremos a una solucin "mgica" de lisis
(QuickExtract DNA Extraction Solution) para extraer el DNA, el cual finalmente precipitaremos con
isopropanol y resuspenderemos en un tampn apropiado.

Protocolo de extraccin

1. Enjuagarse la boca con 10 ml de solucin salina (0.9% NaCl), recuperando esta en un tubo de
15 ml (tampn verde).
2. Pipetear 1 ml a un tubo de 1.5 ml.
3. Centrifugar el tubo de 1.5 ml a >10 Krpm durante 3 minutos.
(IMPORTANTE: BALANCEAD LOS TUBOS EN EL ROTOR DE LA CENTRFUGA)
4. Eliminar el sobrenadante y aadir 100 !l de solucin de lisis. Pipetear varias veces arriba y abajo
para resuspender la pella ("pellet") de clulas del fondo del tubo.
5. Incubar el tubo a 65 C durante 3 minutos.
6. Agitar el contenido del tubo golpendolo con un dedo durante unos segundos.
7. Incubar el tubo a 98 C durante 3 minutos.
8. Aadir 40 !l de una solucin de acetato potsico. Pipetear arriba y abajo varias veces.
9. Incubar el tubo en hielo 3 minutos.
10. Centrifugar el tubo a >10 Krpm durante 3 minutos.
11. Recuperar el sobrenadante con una pipeta y transferirlo a un tubo con 100 !l de isopropanol.
Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces.
12. Centrifugar el tubo a >10 Krpm durante 2 minutos.
13. En este punto una pella de DNA debera ser visible. Eliminar el sobrenadante inclinando el
tubo. Golpearlo ligeramente sobre papel absorbente.
14. Aadir 200 !l de 70% etanol. Lavar invirtiendo el tubo varias veces.
15. Centrifugar el tubo a >10 Krpm durante 2 minutos.
16. Eliminar el etanol como en el paso 13.
17. Eliminar las gotas de etanol retenidas en la pared del tubo con un bastoncito de algodn.
(OJO: NO ARRASTRAR LA PELLA DE DNA CON EL BASTONCITO)
18. Resuspender la pella en 30 !l de tampn TE (TrisHCl, EDTA pH 7.6).
Reaccin de PCR

La amplificacin del DNA se llevar a cabo in vitro mediante la tcnica denominada PCR
(polymerase chain reaction; reaccin en cadena de la polimerasa). En un tubito especial de PCR hay
que mezclar todos los componentes necesarios para que ocurra sntesis de DNA in vitro. Se
suministrar una mezcla con todos los componentes necesarios. Esta mezcla debe mantenerse en
fro, y se aadir 18 !l de dicha solucin a 2 !l del DNA genmico aislado previamente. Es muy
conveniente que durante la preparacin de la reaccin los tubos permanezcan el mayor tiempo
posible en hielo.

La reaccin final de PCR contendr los siguientes componentes:

Tampn de PCR (16 mM (NH
4
)
2
SO
4
, 67 mM Tri-Hcl (pH 8.8 a 25 C), 0.01% Tween-20).
MgCl
2
(1.5 mM).
dATP, dGTP, dCTP, dTTP (200 !M cada uno)
Cebadores o "primers" (125 nM cada uno)
Polimerasa (Taq) (1 !l)
DNA genmico (2 !l)
Agua hasta 20 !l

Los "primers" que utilizaremos tienen la siguiente secuencia:

Forward: GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG
Reverse: GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC

Estos "primers" han sido descritos en la siguiente publicacin: Kloosterman AD et al. (1993) PCR-
amplification and detection of the human D1S80 VNTR locus. Int J Leg Med 105:257-264.

Todos los tubos con las reacciones de PCR se introducirn en el aparato de PCR al mismo tiempo y
se sometern al siguiente programa:

95 C, 2'
5 ciclos a:
94 C, 30
72-68 C, 30 (-1 C/ciclo)
72 C, 45
40 ciclos a:
94 C, 30
67 C, 15
72 C, 45
72 C, 3'
10 C, for ever

Separacin y visualizacin de los fragmentos amplificados en un gel de agarosa

El DNA puede separarse de acuerdo a su tamao mediante electroforesis en gel. Los dos tipos de
soporte (geles) que suelen emplearse son de agarosa y poliacrilamida. Para separar fragmentos con
tamaos relativamente similares se emplean los segundos por su mayor poder resolutivo. Para poder
discriminar, por ejemplo, los alelos del locus D1S80 de 24 y 25 repeticiones (fragmentos de 546 y 562
bp, respectivamente) tendramos que utilizar este tipo de geles. No obstante, en esta prctica vamos
a emplear geles de agarosa por la menor complejidad tcnica que supone su manipulacin.

La preparacin del gel es muy simple. Pesaremos en un matraz la cantidad de agarosa de acuerdo
con la concentracin final deseada de esta. Por ejemplo, 1.5 g de agarosa en 100 ml de tampn para
un gel de un 1.5% de agarosa. El tampn que usaremos para preparar el gel ser el mismo de la
electroforesis. En nuestro caso, usaremos TAE (Tris-acetato-EDTA). La agarosa queda en
suspensin en el tampn pero no se disuelve. Para disolverla es necesario calentar la mezcla. Esto
se lleva a cabo normalmente en un horno microondas. Una vez la agarosa se ha disuelto
completamente dejamos enfriar la mezcla durante un rato y posteriormente la vertemos en una
bandeja sellada que servir de molde. Para poder cargar nuestro DNA en el gel una vez ste est
gelificado es preciso hacer unos huecos en el mismo. Estos "pocillos" se pueden formar insertando un
"peine" de metacrilato en el gel antes de que este gelifique.

La orientacin del gel en la cubeta de electroforesis, especficamente en relacin a los electrodos
de la misma, es importante ya que el DNA est cargado negativamente y correr hacia el polo
positivo. Por tanto, los pocillos deben colocarse cerca del polo negativo. Antes de cargar nuestra
muestra de DNA, es necesario aadir un tampn de carga. Este lleva a cabo dos funciones: por un
lado, aumentar la densidad de la muestra para que no flote sino que se hunda en el pocillo; y por otro
lado, proporcionar un colorante que servir para visualizar la muestra mientras se carga en el gel y
seguir el desarrollo de la electroforesis. El gel se someter a una corriente elctrica con un voltaje
constante. Tras la electroforesis, el gel se "tie" sumergindolo en una cubeta con bromuro de etidio.
Este se intercala entre las bases del DNA y fluoresce cuando es iluminado con luz ultravioleta. El
bromuro de etidio es un conocido mutgeno y potencial carcingeno. Es necesario manipularlo con
precaucin y siempre llevar guantes.