Afin de respecter la concentration de lADN requise, 1000ng/l, chaque concentration

dADN obtenue aprs le dosage, est dilue dans un volume de leau distill jusqu obtenir un
volume de 20l de lADN et leau distill.
Ensuite, on rajoute 85l du Bisulfite de Sodium dans chaque eppendorf suivie de 35l
de DNA Protect Buffer, qui empche la fragmentation de lADN puisquil est associ au
bisulfite qui permet de traiter lADN des tempratures leves et de faibles valeurs de pH.
Ce qui implique un changement de coloration qui passe du vert au bleu. Leppendorf est
centrifug brivement afin dliminer les bulles dair.
Le tube est dirig vers une amplification par lappareil de PCR over night suivant le
programme :
Programme PCR
Temprature Dure (min) Indication
95C 5 min Dnaturation de lADN
60C 25 min Hybridation
95C 5 min Dnaturation de lADN
60C 85 min Hybridation
95C 5 min Dnaturation de lADN
60C 175 min Hybridation
20C
Totale de 5h5min Amplification de la quantit
dADN

4-4-2. Purification
Une fois la conversion du bisulfite est termin, on centrifuge brivement les tubes
PCR contenant le ractif du Bisulfite puis on transfre tout le contenue dans un eppendorf de
1.5 ml.
Un volume de 560l du Buffer BL est ajout la solution, qui favorise la liaison de
lADN la membrane de la colonne, puis vortexer et centrifuger brivement.
On transfre le contenue de leppendorf dans une colonne Qlamp, qui permet la
filtration du mlange. Puis on centrifuge une vitesse maximale de 4800tr/min pendant 1min.
On jette la solution restante dans la colonne et on remet la colonne, sa place, dans le
tube collecteur.
On rajoute 500l du Buffer BW dans la colonne, qui lave lADN li la membrane ce
qui limine efficacement le bisulfite, et on centrifuge une vitesse maximale de 4800tr/min
pendant 1min. et on jette la solution restante dans la colonne une nouvelle fois et on remet la
colonne, sa place, dans le tube collecteur.
Apres, on incorpore 500l de Buffer BD, qui permet la dsulfonation de lADN, dans
la colonne, et on incube temprature ambiante pendant 15min, suivie dune centrifugation
une vitesse maximale de 4800tr/min pendant 1min. Puis, on jette la solution restante dans la
colonne une nouvelle fois et on remet la colonne, sa place, dans le tube collecteur.
Un volume de 500l du BW est rajout une nouvelle fois la solution suivie dune
centrifugation une vitesse maximale de 4800tr/min pendant 1min. Puis, on jette la solution
restante dans la colonne une nouvelle fois et on remet la colonne sa place, dans le tube
collecteur, suivie dune autre centrifugation sans ajout daucun tampon dans le but de filtrer la
colonne Qlamp.
Dans un bain-marie une temprature de 56 C, on incube la colonne pendant 5min.
Puis on rajoute 20l du Buffer EB dans le nouvel eppendorf. Puis centrifuger 1500 tr/min
pendant 1min, puis on jette la colonne et on garde le tube collecteur.
Et finalement, on dose la nouvelle quantit dADN pour chaque chantillon.

4-2-3- Mthyl PCR
Ractifs Volume Indications
Master Mix 25 l Le Kit
Primers MF&MR 2+2 l Permet la mthylation des
brins dADN
UF&UR 2+2 l
ADN Selon la concentration du
dosage

H
2
O distill Complter jusqu 50 l Permet la dilution et la
dminralisation de lADN

En se basant sur les rsultats du dosage obtenu aprs purification, on multiplie la
concentration de lADN dos par un facteur numrique pour avoir un volume denviron 200
l. ce facteur est utilis comme le volume pris du tube contenant lADN. Si ce facteur est
infrieur la valeur de 7, alors il faudra le complt avec leau distill jusqu obtenir cette
valeur. Ainsi, le volume de lADN complt par leau en plus de 10l de leau distill est de
17 l.
On prend un nouveau eppendorf o on met 10 l deau distill et 25 l du Master Mix,
puis 2 l de lMF&MR est rajout la solution deux fois de suite, et aussi lajout de deux
fois de 2l de lUF&UR.
La solution prpar est verse dans un nouveau eppendorf quon lui rajoute lADN
complt par leau, puis on centrifuge brivement afin dliminer les bulles dair.
Le tube est dirig vers une amplification travers lappareil de PCR suivant le
programme :
Temprature C Dure Indication
95C 10 min Dnaturation de lADN
94C 15 s Dnaturation de lADN
55C 30 s Hybridation
72C 30 s Extension
72C 10 min Extension
72C Extension
Totale de 1h30min Amplification de la quantit
dADN

4-2-4- Llectrophorse
Cette tape nous permet de visualiser les rsultats dfinitifs de la srie analyse, pour
pouvoir les interprter et rendre une rponse.
Pour cela, on prpare le gel dagarose (2/1). Sur une feuille de parafilm, on met une
goutte du bleu de dpt pour chaque patient suivie de 7l de leppendorf rsultant de la
mthyl PCR.
Aprs avoir mlang les deux solutions manuellement, on lintroduit, laide dune
pipette, dans le moule gel mis dans la cuve branch un gnrateur sous 90 V pendant une
dure de 5min, le temps de migration des ions port par le groupement phosphate de lacide
nuclique.
Aprs avoir mis le gel sur la plaque UV, on peut observer le rsultat en comparaison
avec le tmoin qui est constitu de la mme composition que lchantillon du patient, avec
absence dun acide nuclique.
5- Rsultat et Discussion
5-1- Rsultat