Enzimas Redox 02

ENZIMAS REDOX
Prof. A. R. Alcntara, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM

APLICACIONES INDUSTRIALES
EJEMPLOS INDUSTRIALES
OXIDACIONES
EJEMPLOS INDUSTRIALES
1) Reduccin de C=O ) Reducc n de O
2) Hidroxilacin de anillos )
aromticos
3) Oxidacin de alcoholes
4) Oxidacin de alcanos
5) Epoxidacin de alquenos
1.1.-REDUCCIN DE ENLACES C=O
O
E
OH
(S)
S
E
(S)
(S)
S
S
O O
( )
S
S
O O
6 M th l 7 7 di 6 M th l 7 7 di 6-Methyl-7,7-dioxo-
6,7-dihydro-5H-7
6
-
6-Methyl-7,7-dioxo-
4,5,6,7-tetrahydro-7
6
-
thieno[2,3-
b]thiopyran 4 one
thieno[2,3-b]thiopyran-4-
ol b]thiopyran-4-one ol
CATALIZADOR: ALCOHOL DESHIDROGENASA
(S)
S
S
O
E
(S)
S
(S)
S
OH
S
S
O O
S
S
O O
6-Methyl-7,7-dioxo-
6,7-dihydro-5H-7
6
-
thieno[2 3
6-Methyl-7,7-dioxo-
4,5,6,7-tetrahydro-7
6
-
thieno[2 3 b]thiopyran 4 thieno[2,3-
b]thiopyran-4-one
thieno[2,3-b]thiopyran-4-
ol
Enzima: alcohol deshidrogenasa (NADH/NAD
+
) g ( )
Microorganismo: Neurospora crasa
Condiciones de reaccin:
T = 33 C T = 33 C
Medio: acuoso, pH = 3.8-4.3
Estado del biocatalizador: clulas enteras suspendidas
Rendimiento > 85%
ee > 98%
Pureza qumica > 99% Pureza qumica > 99%
Reactor tipo fed-batch
Puesto en funcionamiento en 1994
C Z Lif S i M l l
Compaa: Zeneca Life Science Molecules
Utilidad
OH HN
S
O
NH
2
Inhibidor anhidrasa carbnica
Uso tpico contra el glaucoma
S
S
O O
S
S
O O
S
O
NH
2
Trusopt
Uso tpico contra el glaucoma
(incremento presin intraocular)
Sntesis qumica: problema
OH
OM
O
ClTs, Py
OTs
OM
O
S
LiS MeO
O
HCl Conc
HO
O
Sntesis qumica: problema
OMe OMe
HCONH
2 S
S
S
S
TFAA
tolueno
OH
OH
OH HN
O
S
S
O
S
S
OH
LiAlH
4
H
2
SO
4
, 0C
S
S
OH
H
2
O
2
NaWO
4 S
S
H
OH
O O
S
S
HN
O O
MeCN
H
2
SO
4
HSO
3
Cl
SOCl
2
O
O
HN
S
S
HN
O O
S
Cl
O
O
NH
3
THF
S
S
HN
O O
S
NH
2
O
O
BH
3
DMS
THF
S
S
HN
O O
S
NH
2
O
O
T t
Proceso no
cuantitativo
Trusopt
Sntesis quimioenzimtica
Despolimerizacin de
plsticos naturales obtenidos
a partir de microorganismos
O
O
H
+
, MeOH OH O
1) ClTs, Py
MeO
O
p g
O
n
(R)
OMe
2)
S
LiS
S
S
1) 6 M HCl
2) TFAA 2) TFAA
3) H
2
O
2
, NaWO
4
O
N sp ss
OH
HN
O
O
S
S
O
O
Neurospora crassa
pH = 4
S
S
O
O
S
S
O O
S
NH
2
O
Trusopt Trusopt
O
O
si pH > 5
Control de pH es vital
HO
2
S
S
S
S
O
O
O
E
(S)
O
O
O
OH
O
O
E
(S)
O
O
O
O
OH
O
Enzima: alcohol deshidrogenasa (NADH/NAD
+
)
Microorganismo: Zygosaccaromyces rouxii
C di i s d i : Condiciones de reaccin:
T = 33-35 C
Medio: acuoso, pH = 7.0
Conc. Sustrato: 2g L
-1 ( <
11 mM)
Rendimiento > 85% Rendimiento > 85%
ee > 99.9%
Pureza qumica 95%
Reactor tipo batch de 300 L
Rendimiento espacio-temporal 75 g L
-1
d
-1
Compaa: Eli Lilly and co, USA
p y ,
El lmite de toxicidad para el sustrato es de 6 g L
-1
. Para evitar
alteracin del biocatalizador, es el SUSTRATO EL QUE SE
INMOVILIZA sobre una resina XAD 7 a una conc de 80 g L
-1
INMOVILIZA sobre una resina XAD-7, a una conc. de 80 g L
1
,
de manera que la conc. efectiva de sustrato se mantenga siempre
a 4 g L
-1
. g
Esta resina no es txica, y comparada con un disolvente
orgnico de semejante polaridad (log P < 2) no produce
d s t li i desnaturalizacin.
La resina puede reutilizarse 3 veces sin prdidas de actividad.
Reactor: un tipo especial de batch Reactor: un tipo especial de batch
Desorcin del educto limitada por la conc. en equilibrio de
aprox. 2 g L-1. p g
Para separar las clulas del producto adsorbido en la resina se
emplea un filtro de 150 m. As, la resina (aprox. 500 m) es
id l l l ( 5 ) l fil d retenida y las clulas (aprox. 5 m) permanenecen en el filtrado.
Posteriormente, el producto se libera de la resina lavando con
acetona
acetona.
Esquema
Utilid d i t i d Utilidad: sintesis de una
Benzo[d]-1,2-diazepina til
en el tratamiento de la
esclerosis amilotrpica
lateral
Cl
O O
E
Cl
O
O OH
Cl
O
(S)
O
Cl
O
O O
E
Cl
O
O OH
Cl
O (S)
O
Enzima: alcohol deshidrogenasa (NADPH/NADP
+
)
Microorganismo: Geotrichum candidum SC 5469
C di i s d i : Condiciones de reaccin:
T = 28 C
Conc. Sustrato: 10 g L
-1 (
66 mM)
Rendimiento 95% Rendimiento 95%
ee > 99%
Reactor tipo batch de 750 L
Compaa: Bristol-Myers Squibb, USA
Inhibidor de la hidroximetil glutaril
CoA reductasa (HMG CoA reductasa)
antagonista del colesterol
EJEMPLOS INDUSTRIALES EJEMPLOS INDUSTRIALES
aromticos
2.1.-HIDROXILACIN DE ANILLOS AROMTICOS
R
R
R
+ O
2
E
R
OH
+ O
2
OH
(R S)
2 NADH 2 NAD
+
(R,S)
R=H, F, Me, CF
3
CATALIZADOR: BENZOATO DIOXIGENASA
R
R
+ O
2
E OH
OH
(R S)
2 NADH 2 NAD
+
(R,S)
R=H, F, Me, CF
3
Enzima: benzoato dioxigenasa
Microorganismo: Pseudomonas putida
Condiciones de reaccin: Condiciones de reaccin:
Compaa: ICI
Proceso habitual en clulas
+ O
E OH Deshidrogenasa OH
+ O
2
2 NADH 2 NAD
+
OH
(R,S)
OH
1,2-cisdihidroxicatecol
pirocatecol
En 1968 se describe un mutante de Pseudomonas putida
,
que carece de actividad deshidrogenasa, lo que permite
acumular el producto deseado
+ O
2
E OH Deshidrogenasa OH
mutante
2 NADH 2 NAD
+
OH
(R,S)
OH
1,2-cisdihidroxicatecol
pirocatecol
El microorganismo Pseudomonas putida presenta una gran
tolerancia a sustratos aromticos que, en la mayora de los
casos son txicos para la mayora de los microorganismos.
No obstante, el cisdihidroxcatecol presenta un alto
f i hibi i b l i i l l efecto inhibitorio sobre el microorganismo, por lo que la
fermentacin y la biotransformacin deben estar
separadas separadas.
La regeneracin del cofactor se produce en el interior de
las clulas con el aporte de una fuente de carbono las clulas, con el aporte de una fuente de carbono.
Selectividad del proceso > 99.5%.
Utilidad: sintn para la obtencin de -lactamas Utilidad: sintn para la obtencin de lactamas
antivirales.
2.2.-HIDROXILACIN DE ANILLOS AROMTICOS
E
OH
N
H
H
2
O
N
H
OH
H
1/2 O
2
H
i d l
d h d d l d l
indol
2,3-dihidro-1H-indol-2,3-diol
CATALIZADOR: NAFTALENO DIOXIGENASA
OH
E
N
H
H
2
O
N
H
OH
1/2 O
2
indol 2,3-dihidro-1H-indol-2,3-diol
Enzima: naftaleno dioxigenasa
Microorganismo: Pseudomonas putida
Estado del biocatalizador: clulas enteras suspendidas Estado del biocatalizador: clulas enteras suspendidas
Medio acuoso
Compaa: Genencor
Utilidad
Deshidratacin
OH
OH
OH
aire
O
H
N
espontnea
N
H
OH
N
H
N
H
O
ndigo
colorante azul para
2,3-dihidro-1H-indol-2,3-diol
indol-3-ol
colorante azul para
industria textil
, h ro H n o , o
Este proceso es realmente complejo:
La actividad naftaleno-dioxigenasa es muy baja tanto en
la P putida nativa como en los primeros mutantes la P. putida nativa como en los primeros mutantes
expresados en E. coli.
La vida media del las clulas capaces de oxidar el indol es La vida media del las clulas capaces de oxidar el indol es
muy baja (entre 1 y 2 h.)
Concentraciones de indol mayores de 400 mg L-1 son y g
txicas para las clulas (se inactiva la ferredoxina)
El indol es un producto de partida muy caro para un
proceso industrial. El triptfano es ms barato, pero se
necesita un paso previo que implica la accin de una
triptofanasa triptofanasa.
NH
2
N OH
H
N
O
OH
2 N NH
ONa
aire
2
+
Cl
O
OH
NaOH
N
OH
2 NaNH
2
KOH.NaOH
N
H
RUTA QUMICA CLSICA
N
O
H
N
RUTA QUMICA CLSICA
N
H
O
indigo
2 ROOH
Mo(CO)
6
NH
2
+
HO
OH
catalizador de Ag
fase gaseosa
N
2ROH
H
2
O
fase gaseosa
N
H
H
2
O
RUTA QUMICA MS NOVEDOSA
Mitsui Toatsu Chemicals
En la ruta biocatalizada con mutantes expresados en E.
coli se parte de glucosa!!:
coli se parte de.glucosa!!:
Ruta biocatalizada con mutantes expresados en E. coli.
Mejora en el sistema de triptofanasa:
Mediante mutagnesis dirigida
COOH
Glucosa
N
COOH
NH
2 Triptofanasa
E
Naftaleno
dioxigenasa
E
OH
OH
N
H
E
1 N
H
E
2
N
H
Mejora en el sistema de dioxigenasa:
Mejores plsmidos
P t i t t Promotores ms resistentes
Se alcanza la productividad de P. putida
wild-type
aromticos
3.1.-OXIDACIN DE ALCOHOLES
E
O O
O O O O
+
OH
(R)
OH
(R)
OH
O
(R) isopropilidenglicerol
O
(R,S)-isopropilidenglicerol cido (R)-isopropilidenglicrico
(R)-isopropilidenglicerol
CATALIZADOR OXIDASA CATALIZADOR: OXIDASA
E
O O
O O O O
+
OH
(R)
OH
(R)
OH
O
(R)-isopropilidenglicerol
(R,S)-isopropilidenglicerol cido (R)-isopropilidenglicrico
(R) isopropilidenglicerol
Enzima: oxidasa
Microorganismo: Rodococcus erythropolis
T = 30 C
M di H 6 8 7 2 Medio: acuoso, pH = 6.8-7.2
Concentracin de sustrato 10 g L
-1
(76 mM) Concentracin de sustrato 10 g L (76 mM)
Conversin 50%
ee > 98 % para el R-alcohol, > 90 % para el R-cido
Compaa: International BioSynthetics
Sntesis qumicas alternativas (costosas)
CH
2
OH
OH
OH
2 acetona
CH
2
OH
O
O
Pb(OAc)
2
O O
2
NaBH
4 O O 2
OH
HO
HO
CH
2
OH
ZnCl
2
O
O
CH
2
OH
2
(S)
H
O
(R)
OH
CH
2
OH
(L)-manitol
no natural
1) NaBH
4
2) NaOH
3) H
+
OH
OH
OH
O
HO
acetona
OH
O
HO
O
O
3) H
4) Pb(OAC)
2
OH O
O
cido ascrbico
O
O
O
Utilid d l (R) i ilid li l i t i l Utilidad: el (R)-isopropilidenglicerol es un sintn quiral
de gran utilidad.
3.2.-OXIDACIN DE ALCOHOLES
HN
R
HN
R
HO
OH
OH
E
HO
OH
OH
OH
OH
CH
2
OH
OH
O
CH
2
OH
CH
2
OH
CH
2
OH
1-amino-
D-sorbitol
6-amino-
L-sorbosa
D sorbitol
(N-protegido)
(N-protegida)
CATALIZADOR: D-SORBITOL DESHIDROGENASA
HN
HO
R
E
HN
HO
R
HO
OH
OH
OH
H H
E
HO
OH
OH
O
CH
2
OH CH
2
OH
1-amino-
D-sorbitol
(N-protegido)
6-amino-
L-sorbosa
(N-protegida)
( p g )
p g
Enzima: D-sorbitol deshidrogenasa
Mi i Gl b t d Microorganismo: Gluconobacter oxydans
T = 32 C T 32 C
Concentracin de sustrato 1M (peso molecular depende del grupo
protector).
Compaa: Bayer AG
Compaa: Bayer AG
intermedio en la sntesis de
inhibidores orales de a-
glucosidasas
UTILIDAD
O H
NH
2 HN
R
HN
R
HO
OH
OH
OH
CH OH
aminacin
reductiva
HO
OH
OH
OH
CH OH
PROTECCIN
HO
OH
OH
OH
E
HO
OH
OH
O
CH OH CH
2
OH
D-glucosa
CH
2
OH
1-amino-
D-sorbitol
CH
2
OH
CH
2
OH
1-amino-
D-sorbitol
(N-protegido)
6-amino-
L-sorbosa
(N-protegida)
tiles en el tratamiento de
1) DESPROTECCIN
2) NaBH
4
tiles en el tratamiento de
enfermedades relacionadas
con carbohidratos
(DIABETES MELITUS)
NH
HO
HO
OH
N
HO
HO
OH
OH
OH
HO
1-desoxinojirimicina
OH
HO
miglitol
Las sntesis puramente qumicas de 1-desoxinojirimicina Las sntesis puramente qumicas de 1-desoxinojirimicina
requieren muchos pasos, y una ardua tarea de prteoccin-
desproteccin.
El grupo amino debe estar protegido (tipo Cbz, pH=8-10) para
it bl l di evitar problemas en el medio acuoso.
Las clulas se producen mediante una fermentacin usando Las clulas se producen mediante una fermentacin usando
sorbitol como inductor, y subsiguientemente empleadas para la
biotransformacin en agua sin adicionar ningn otro nutriente. g g
Las clulas no estn inmovilizadas, pues la alta tasa de
d b l d l conversin de sustrato que se obtiene se vera limitada por los
problemas difusionales en un sistema inmovilizado.
ESQUEMA DEL PROCESO
aromticos
4.1.-OXIDACIN DE ALCANOS
O
O HO
O
O HO
O
O
E
O
O
H
+ O
2
H
OH
Simvastatina 6--hidroximetilsimvastatina
(producto mayoritario)
CATALIZADOR: MONOXIGENASAS
Enzima: monooxigenasa (dependiente de flavina)
Microorganismo: Nocardia autotropica
T = 27 C
Concentracin de sustrato < 0.02 g L
-1
(< 0.05 mM)
Concentracin de producto: 0.8 g L
-1
( 1.85 mM)
Compaa: Merck Sharp & Dohme
Debido a una gran inhibicin por sustrato, la concentracin de
simvastatina tiene que mantenerse por debajo de 0.05 mM, por
lo que tiene que ser aadida en contnuo a partir de una lo que tiene que ser aadida en contnuo, a partir de una
disolucin madre de 20 g L
-1
, que se tiene que mantener a 45C
para evitar la precipitacin. p p p
Se obtiene una conc. final de producto de 0.8 g L
-1
, por lo que
empleando un reactor de 19.000 L de capacidad, se obtienen
h st 15 2 k d d t si l b l d l 24 % hasta 15.2 kg de producto, con una conversin global del 24 % y
una selectividad del 70%
4.2.-OXIDACIN DE ALCANOS
O
N
E
N
O
OH
N
+ O
2
N
OH
2,5-dimetilpirazina cido 5-metilpirazina
2 b li -2-carboxlico
CATALIZADOR: MONOXIGENASAS
Enzima: xilenooxigenasa (monooxigenasa)
Microorganismo: Pseudomonas putida ATCC 33015 Microorganismo: Pseudomonas putida ATCC 33015
T = 30 C T = 30 C
Estado del biocatalizador: clulas enteras en crecimiento Estado del biocatalizador: clulas enteras en crecimiento,
suspendidas.
Concentracin de producto: 24 g L
-1
( 174 mM) Concentracin de producto: 24 g L ( 174 mM)
Compaa: Lonza AG Compaa: Lonza AG
Si se emplean clulas en reposo, se produce una acumulacin
del intermedio 2-hidroximetil-5-metilpirazina, el cual
i dif il d id h l id posteriormente es difcil de oxidar hasta el cido.
El sustrato que se emplea para la fermentacin es una
m zcl d p xil n (75%) 2 5 dim tilpi zin unqu n s mezcla de p-xileno (75%) y 2,5-dimetilpirazina, aunque no se
detectan metabolitos de oxidacin del primero.
La biotransformacin se detiene cuando el crecimiento La biotransformacin se detiene cuando el crecimiento
bacteriano entra en la fase estacionaria.
La mxima concentracin de producto (24 g L
-1
) viene La mxima concentracin de producto (24 g L ) viene
limitada por esta inhibicin.
Otros productos que se obtiene con la misma metodologa:
N
O
UTILIDAD:
N
O
N
O
O O
N
N
OH
O
N
N
OH
N
N
NH
S
NH
N
H
O
O
H
Acipimox
(antilipoltico)
Glipicide, antiglucmico
(diabetes)
( p )
(diabetes)
aromticos
5 1 EPOXIDACIN DE ALQUENOS 5.1.-EPOXIDACIN DE ALQUENOS
R
R
O
E
CATALIZADOR: MONOOXIGENASAS
O
E
R
R
O
E
Enzima: monooxigenasa (dependiente de flavina)
Microorganismo: Nocardia corallina B 276
T = 30C
Medio: bifsico orgnico/acuoso
Compaa: Nippon Mining
CONSIDERACIONES:
Se usa un sistema bifsico para 1-alquenos de longitud de
cadena comprendida entre C6 y C12 cadena comprendida entre C6 y C12.
El disolvente orgnico no debe ser txico (ej. hexadecano u
otros alcanos) otros alcanos).
Esta segunda fase orgnica disminuye la concentracin del
epxido (causa inhibicin) y permite la extraccin en contnuo epxido (causa inhibicin) y permite la extraccin en contnuo
del mismo
Para estos 1-alquenos entre C6 y C12 se emplean clulas en q y p
reposo, pues los productos son ms txicos para el
microorganismo. Para alquenos superiores, se pueden utilizar
l l i i t clulas en crecimiento.
En el caso de alquenos ms pequeos (C3-C5), al ser gases a
temp. ambiente su toxicidad celular es muy alta, y la
recuperacin de los productos de reaccin se complica recuperacin de los productos de reaccin se complica.
Las clulas tienen que hacerse crecer en glucosa u otras Las clulas tienen que hacerse crecer en glucosa u otras
fuentes similares de carbono para garantizar de forma
efectiva la regeneracin del cofactor. efectiva la regeneracin del cofactor.
La velocidad de aireacin durante la fermentacin tiene que La velocidad de aireacin durante la fermentacin tiene que
incrementarse para extraer el epxido formado (muy txico).
Las pequeas cantidades de epxido en la fase gaseosa puede
recuperarse con un sistema especial de extraccin.
ALQUENOS
COMERCIALIZADOS
Pueden ser terminales o
subterminales
ALQUENOS
EPOXIDABLES
subterminales.
Cuando se pueda
formar un estereo-
EPOXIDABLES
formar un estereo
centro, predomina la
config. R
ESQUEMA
UTILIDAD SINTTICA DE LOS EPXIDOS
5 2 EPOXIDACIN DE ALQUENOS 5.2.-EPOXIDACIN DE ALQUENOS
E
O
(S)
O
O
R
+O
2
R
R
CATALIZADOR: OXIDASA
E
O
(S)
O
O
+O
2
R
R
O
2
Enzima: oxidasa.
Microorganismo: Pseudomonas oleovarans
T = 37C
Medio: acuoso
Concentracin de producto > 7 g L
-1
(>0.26 M)
ee > 99.9%
Compaa: Shell Brocades (USA)
UTILIDAD
(S)
O
O
NH
2
(S)
O
OH
H
N
(S)
R
(S)
R
Bloqueantes de receptores -adrenrgicos
(cardiotnicos) (cardiotnicos)
O
OH
H
N
O
OH
H
N O
OH
H
N
(S)
O N
(S)
O N
O
(S)
O N
H
2
N
O
propranolol metoprolol
atenolol
p p m p
atenolol

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