Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves
Universidade Federal do Piau - UFPI
Centro de Cincias da Sade - CCS
Departamento de Bioqumica e Farmacologia
Fundamentos de Bioqumica







TESTES COM ENZIMAS, PROPRIEDADES DA UREASE


WANDERLEY MATOS GONALVES






Teresina-PI, Abril/2010
Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves
RESUMO

A partir de cinco testes mostrou e confirmaram-se as propriedades da Urase,
que hidrolisa a uria em CO
2
e 2NH
3
, sendo basicamente a atividade da enzima em
questo, urase, bem como toda enzima tem sua especificidade, logo testou a
urase com derivados de uria (tiouria).


















Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves
1. INTRODUO

As enzimas so um grupo de substncias orgnicas de natureza
normalmente protica (existem tambm enzimas constitudas de RNA, as ribozimas),
com atividade intra ou extracelular que tm funes catalisadoras, catalisando
reaes qumicas que, sem a sua presena, dificilmente aconteceriam. Isso
conseguido atravs do abaixamento da energia de ativao necessria para que se
d uma reao qumica, resultando no aumento da velocidade da reao e
possibilitando o metabolismo dos seres vivos. A capacidade cataltica das enzimas
torna-as adequadas para aplicaes industriais, como na indstria farmacutica ou
na alimentar. Praticamente todas as reaes no organismo so mediadas por
enzimas sem sofrerem alteraes no processo global. Dentre as muitas reaes
biolgicas energeticamente possveis, de forma seletiva, as enzimas canalizam
reagentes (os substratos) para rotas teis. Logo as enzimas comandam todos os
eventos metablicos (CHAMPE, 2006).
Em sistemas vivos, a maioria das reaes bioqumicas d-se em vias
metablicas, que so sequncias de reaes em que o produto de uma reao
utilizado como reagente na reao seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes
passos de vias metablicas, agindo de forma concertada de modo a no interromper
o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulao da sua atividade,
aumentando-a, diminuindo-a ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo
da via metablica em que se insere. O ramo da Bioqumica que trata do estudo das
reaes enzimticas a Enzimologia.
As enzimas convertem uma substncia, chamada de substrato, em outra
denominada produto, e so extremamente especficas para a reao que catalisam.
Isso significa que, em geral, uma enzima catalisa um e s um tipo de reao
qumica. Consequentemente, o tipo de enzimas encontradas numa clula determina
o tipo de metabolismo que a clula efetua. O aceleramento da reao pode ser da
ordem dos milhes de vezes: por exemplo, a enzima orotidina-5'-fosfato
descarboxilase diminui o tempo da reao por ela catalisada de 78 milhes de anos
para 25 milissegundos. Como so catalisadores, as enzimas no so consumidas na
Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves
reao e no alteram o equilbrio qumico dela. A atividade enzimtica pode
depender da presena de determinadas molculas, genericamente chamadas
cofatores. A natureza qumica dos cofatores muito varivel, podendo ser, por
exemplo, um ou mais ons metlicos (Fe), ou uma molcula orgnica (como a
vitamina B
12
). Estes cofatores podem participar ou no diretamente na reao
enzimtica (DIAS DE SOUZA, 2009).
Pelo fato de serem protenas com estrutura terciria ou quaternria, as
enzimas so dotadas de dobramentos tridimensionais em suas ceias polipeptdicas,
o que lhes confere uma forma caracterstica e exclusiva. Assim, diferentes enzimas
tm diferentes formas e, portanto, diferentes papis biolgicos. Para que uma
enzima atue, necessrio que os substratos "se encaixem" na enzima. Esse
"encaixe", porm, depende da forma, isto , do "contorno" da enzima. Por isso,
substratos que se "encaixam" em uma determinada enzima no se "encaixam" em
outras diferentes, e a reao no ocorre; da a especificidade das enzimas quanto
aos substratos em que atuam. Uma vez ocorrido o "encaixe", forma-se o complexo
enzima-substrato (ES). O local da enzima onde o substrato se "encaixa"
denominado stio ativo (ou centro ativo). No caso de substncias que reagem entre
si, sob a ao catalisadora das enzimas, a reao facilitada, tornando-se mais
rpida, pois a proximidade entre as molculas "encaixadas" acelera o processo
reativo; aps a reao, a enzima desliga-se do substrato e permanece intacta.
A urase uma enzima que catalisa a hidrlise da uria em dixido de
carbono e amnia. A reao a seguinte:
(NH
2
)
2
CO + H
2
O CO
2
+ 2NH
3

Em 1926 James Summer mostrou que a urase era uma protena. A urase
pode ser encontrada em bactrias, leveduras e vrias plantas superiores.



Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL
Reconhecer as propriedades da urase fazendo uso de testes de
identificao inibio por sais de metais pesados.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Confirmar atravs da experimentao direta, como a urase atua sobre a
uria, sua identificao com o biureto, desnaturao e especificidade.













Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves


3. MATERIAIS, REAGENTES E MTODOS

3.1. MATERIAIS, REAGENTES
Tubos de ensaio;
Pipetas graduadas;
Banho-maria;
gua destilada;
Soluo de Urase;
Soluo de Biureto;
Soluo de Uria 0.4 M pH 7.0;
Soluo de Tiouria 0.4 M pH 7.0;
Soluo de HgCl
2
5%.








Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves



3.2. MTODOS
1. Reao da urease com o Biureto:
Pipetou no 1 tubo 1 mL de Biureto seguido da adio de 3 gotas de
urease. J no 2 tubo apenas 1 mL de Biureto.
2. Teste de atividade:
Pipetou-se 1.5 mL de Uria em um tubo seguido da adio de 3 gotas de
Urease, misturou-se e depois de 3 s observou mudanas de colorao.
3. Especificidade:
Em um tubo adicionou-se 1.5 mL de tiouria e 3 gotas de urease, em
seguida comparou com o teste 2 (atividade).
4. Desnaturao pelo calor:
Adicionou-se em um tubo 1 mL de gua destilada seguido de 3 gotas de
urease levou para o banho-maria (100 C) por 5 minutos. Pipetou-se em
outro tubo 1.5 mL de uria e 0.5 mL da urease aquecida do tubo anterior
esperou-se por 5 minutos, comparou-se com o teste 2 (atividade).
5. Inibio por sais de Mercrio (HgCl
2
):
No 1 tubo adicionou-se 3 gotas de urease, 1 mL de gua destilada e 1.5
mL de uria. J no 2 tubo foi 1.5 mL de uria, 1 mL de gua, 3 gotas de
urease e 5 gotas de HgCl
2
.



Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves



4. RESULTADOS E DISCUSSES

No teste 1 (Biureto) verificou-se que no 1 tubo apresentou uma colorao
violeta, pois a urease notadamente composta de aminocidos, que formam
protenas. Logo formou complexos de Cu
2+
pois as mesmas reagiram com o sulfato
de cobre.

Figura 1: Complexo de cobre: cor violeta.
No teste 2 (atividade) notou-se uma colorao amarelada, devido a hidrolise
da uria catalisada pela urease em pH 7.0. Como mostra a equao abaixo:
C
O
NH
2
N H
2
+
O H
2
Urease
C
OH
O H
O
N
H
H
H
+
2
C
OH
O H
O
O H
2
CO
2 +

Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves
J no teste 3 (especificidade) verificou-se que o tubo contendo a tiouria ficou
rosa. Pois no houve reao j que a urease especifica para a uria, no
conseguindo quebrar as ligaes de enxofre.
C
NH
2
N H
2
S
+
O H
2
Urease
No ocorre

No teste 4 (Urease desnaturada) mostrou que a urase aps aquecida em
banho-maria teve sua cadeias de peptdeos desnaturadas notando assim a
diferena de colorao entre a reao 2 e esta.
A inibio da atividade de enzimas ocasionada por sais de mercrio ocorreu
na forma de complexo, o mercrio ligou-se aos grupos sulfidrilicos, que so como o
centro ativo da enzima urase vista no teste 5 (Inibio). Logo tornou-a inativa. O
tubo contendo gotas de HgCl
2
ficou turvo com suspenso possivelmente contendo
HgS
2
. Isto pode ser explicado pela equao simples abaixo:
SH
-
2
+
HgCl
2
HgS
2 +
HCl











Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves



5. CONCLUSO

Concluiu-se, ento que as enzimas possuem ao completa na presena do
substrato especifico neste caso a urease (Enzima) e a uria (substrato) e que so
notadamente constitudas de cadeias de peptdeos (protenas) e sofrem
desnaturao quando aquecidas, bem como tornou inativa na reao com HgCl
2
.















Fundamentos de Bioqumica

Wanderley M. Gonalves



6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS


CHAMPE, P. C., HARVEY, R. A. Bioqumica Ilustrada. 2. Ed. Porto Alegre: Artes

Mdicas, 2006.


DIAS DE SOUZA, Karina A. Freitas, NEVES, Valdir A. Experimentos de Bioqumica,
um guia eletrnico. Disponvel em:
<http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/enzimas/testes.htm>. So Paulo:
UNESP, 2009.


NELSON, D. L., COX, M. M. Lehninger. Principio de Bioqumica. 3. Ed. So Paulo:

Savier, 2006.


VOET, D., VOET, J. G. Fundamentos de Bioqumica. 3. Ed. Porto Alegre: Artmed,

2006.