Universitas Gadjah Mada

XI. ENUMERASI

Penghitungan jumlah mikrobia dapat berdasarkan Total Cell Count (TCC) dan
Viable Cell Count.
Perbedaan : ENUMERASI
ISOLASI
PURIFIKASI
IDENTIFIKASI

Enumerasi yaitu penghitungan jumlah mikrobia per satuan berat atau volume.

Metode enumerasi
1. TPC: Total Plate Count
- Pour plate
- Spread plate
- Drop plate
2. MPN : Most Probable Number
3. Membrane Filter

Persyaratan jumlah koloni dalam TPC
Bakteri dan Yeast 30 < n < 300 atau 25 < n < 250
Jamur 15<ns 150
Di bawah 30 koloni kurang memenuhi persyaratan perhitungan statistik.
Lebih dari 300 koloni terlalu padat
- Menyebabkan supress sehingga mengganggu pertumbuhan
mikrobia menghambat pembentukan koloni
- memungkinkan terbentuknya 1 koloni oleh lebih dari 1 sel
Keuntungan perhitungan dengan TPC
1. sangat peka, dapat menghitung sampai dengan 20 sel/ml
2. murah
3. beban pekerjaan tidak terlalu besar
4. reproducibility tinggi
5. dapat menunjukkan perbedaan jenis-jenis mikrobia
6. dapat diteruskan dengan isolasi
Universitas Gadjah Mada
Membrane Filtration
Sampel disaring secara aseptis melewati membran penyaring steril
berpori-pori 0.45.
Membran dengan sel-sel mikrobia yang tertahan padanya ditumbuhkan
pada media agar yang sesuai dan diinkubasikan pada kondisi yang juga
cocok.
Kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh dan dikembalikan
perhitungannya atas dasar volume sampel dan pengencerannya.

Keuntungan :
- sangat sensitif, dapat untuk menghitung sampai 10~
3
sel/ml.
- dapat dikerjakan dengan media selektif terhadap mikrobia tertentu.

Kelemahan : tidak efisien
Alat: Polyethylene Membrane Filter (Sartorius) atau Seitz Filter

MPN : Most Probable Number

Penghitungan jumlah mikrobia dengan pendekatan statistik didasarkan atas
perbandingan tabung yang menunjukkan pertumbuhan, dari 3 seri pengenceran
atau lebih.

Suspensi sampel A = 1000 sel/ml
B = 100 sel/ml
C = 10 sel/ml
D = 1 sel/ml
E = 0.1 sel/ml

1 ml suspensi A, B, C, atau D bila diinokulasikan dalam 1 tabung media cair yang
cocok akan mengakibatkan adanya pertumbuhan pada tabung.

1 ml suspensi E bila ditumbuhkan dalam media yang sama memiliki
kemungkinan (probability) 1 : 10.

Universitas Gadjah Mada
Atas dasar perhitungan kemungkinan adanya pertumbuhan pada tabung tersebut
secara statistis disusun tabel hubungan antara jumlah tabung yang ada
pertumbuhan dari berbagai pengenceran, dengan jumlah mikrobia. Tabel
tersebut dikenal sebagai Tabel McCrady. Tabel untuk 3 tabung maupun Tabel
untuk 5 tabung.
Contoh :
- sampel dengan pengenceran 10
-1
, 10
-2
, 10
-3

- dari masing-masing pengenceran diinokulasikan 5 x 1 ml dalam 5 tabung
media yang sesuai
- setelah diinkubasikan diperoleh sbb :
pengenceran 10
-1
= 5 tabung +
pengenceran 10
-2
= 3 tabung +
pengenceran 10
-3
= 0 tabung +
Maka dinyatakan dalam hasil pengamatan berupa seri angka 530. Kemudian
seri ini dicocokkan dengan Tabel McCrady untuk 5 tabung, diperoleh
perkiraan populasi mikrobia dalam sampel adalah 109 sel/gram.

MPN dihitung dengan asumsi:
1. sel terdistribusi rata dalam sampel
2. tidak ada sel yang saling terkait
3. tiap 1 sel atau lebih dalam media mampu menunjukkan pertumbuhan
dalam tabung
4. tidak ada kontaminasi

Keuntungan :
1. dapat dipersiapkan sebelumnya, untuk pekerjaan di lapangan
2. dapat dikerjakan dengan media selektif untuk memperkirakan populasi
mikrobia khusus, misalnya coliform dengan lactose broth

Kelemahan :
1. perlu banyak tabung
2. pekerjaan banyak


Universitas Gadjah Mada
PREPARASI SAMPEL
Perencanaan sampling
Untuk menentukan jumlah dan ukuran sampel dipengaruhi oleh faktor-faktor:
1. jumlah mkrobia
2. keseragaman/penyebaran mikrobia

POPULASI MIKROBIA SAMPEL YANG DIAMBIL
-----------------------------------------------------------------------------------------------
makin besar makin kecil ukuran
makin homogen makin sedikit jumlah
makin sedikit makin besar ukuran
makin tidak homogeny makin banyak jumlah
-----------------------------------------------------------------------------------------------

Biasanya diatur dalam standar mutu
Umumnya diambil 10 g atau 10 cc sampel untuk disuspensikan
Sekurang-kurangnya 1 g bila sampel sedikit

Cara sampling
- Aseptik - dengan peralatan steril yang sesuai
pipet untuk sampel cair
pisau, pinset, spatula, cangkul, bar untuk sampel padat
wadah untuk penimbangan
- Waktu - memungkinkan secepatnya dianalisis
2-3 jam sampel sudah dianalisis
10-12 jam dalam suhu 4 C
tidak menyebabkan perubahan jumlah mikrobia dalam sampel berbiak
dan mati.

SUSPENSI SAMPEL
merupakan cara melepas/mengambil populasi mikrobia dari sampel

Sampel cair homogenisasi dalam larutan pengencer
Sampel padat blending : penghancuran sampel
Universitas Gadjah Mada
- blender
- stomacher
rinsing : bilasan
swabbing : usapan
Larutan pensuspensi/pengencer :
mampu mensuspensikan mikrobia, mempertahankan mikrobia tetap
hidup, tetapi tidak berbiak
contoh : air pepton (Peptone water)
larutan pepton 0.1%
bufer phosphate
bufer trypton
larutan Ringer = NaCI 0.9% dalam H 2O
Penggunaan air steril menyebabkan kematian sel mikrobia 40-60% dalam 20
menit dan 90% dalam 1 jam.
Jika digunakan, pengerjaannya harus cepat.
Dalam Total Plate Count biasanya disiapkan suatu seri pengenceran sesuai
dengan perkiraan kandungan mikrobia dalam sampel.

RAPID MICROBIOLOGICAL METHODS
Metode penghitungan yang dkehendaki mempunyai kelebihan
Murah
Cepat
valid

1. mempercepat teknik kultivasi
2. pengujian biokimiawi secara cepat
misal: dengan APP system dan ATM system
coagulase test untuk S. aureus
urease test untuk Salmonella
3. Pengukuran metabolisme total kontaminan
misal: - Methylene Blue Test untuk milk warna
Reazurin Test untuk daging giling warna
Glucose broth untuk ikan penurunan pH

Universitas Gadjah Mada
Kelemahan :
kecepatan metabolisme mikrobia tidak sama
bahan yang sudah mendapat perlakuan akan memberi hasil yang tidak
korelatif populasi sudah dipengaruhi perlakuan (misalnya pendinginan)

MENERA KERUSAKAN BAHAN
- ammonia, asam amino bebas, basa volatil --> pada ikan
- Extract Release Volume (ERV) --> pada telur, daging unggas
perubahan kemampuan menahan air oleh jaringan akibat
kerusakan mikrobiologis
homogenat sampel disaring dengan kertas Whatman No. 1
selama 15 menit
daging baik - ERV tinggi
daging rusak - ERV rendah
- Tri-Metil Amin (TMA) --> pada ikan

METODA NON-TRADISIONAL
- menggunakan isotop
sampel disaring dengan membran filtrasi lalu dibiakkan pada
medium selektif dengan label radioaktif (misal Lactose-C untuk
coliform); C*O2 radioaktif ditera.
Pada penggunaan untuk daging beku, dalam 6 jam inkubasi
sudah dapat ditentukan apakah populasi mikrobianya tinggi (>10 5
/g) untuk ditolak atau masih dapat diterima (< 10 5 /g)
alat dan bahan mahal
kurang aman --> bahaya radiasi, perlu tenaga trampil
- mengukur ATP
luciferase
Luciferin + ATP --------------> senyawa yang bercahaya dapat
O2 diukur intensitasnya

Kelemahan : - bahan pangan punya ATP
- sel mati masih punya ATP
Universitas Gadjah Mada
- ATP yeast + mold > ATP bakteri

- mengukur impedance
Pertumbuhan mikrobia menyebabkan kerusakan/pemecahan
senyawa pada jaringan bahan. Hal tersebut dapat mengakibatkan
perubahan kemampuannya menahan/meneruskan aliran listrik,
yang dapat diukur dan dikorelasikan dengan populasi mikrobia.

- Enzyme Immuno-Assay
misal: ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

Prinsip kerja :
- Antibodi akan terbentuk bila ada antigen (benda asing yang dianggap
mengganggu), dan berusaha menghancurkannya (immune system)
- Reaksi immunitas antigen - antibody (=immunoglobulin) ini spesifik dan
akurat
- Dengan menempelkan enzim pada antibody tertentu yang khusus
diproduksi untuk bereaksi dengan mikrobia tertentu dapat dideteksi
mikrobia ybs melalui reaksi oleh enzim yang ditempelkan.

IMMUNO ASSAY
Dasar:
- Antibodi akan terbentuk bila ada benda asing yang dianggap
mengganggu (antigen) dan berusaha mengeliminasinya (immune system)
- Reaksi imunitas antigen-antibodi-(immunoglobulin) ini spesifik dan akurat
- Antibodi dapat dimanfaatkan sebagai pemburu antigen (racun, mikrobia)
yang dicari.
Terbentuknya kompleks antigen-antibodi dapat menimbulkan endapan/clump
atau aglutinasi tetapi tidak jelas dan sukar diamati.
Solusi: pemberian label/tag pada protein antibodinya dengan molekul pelacak
yang terikat secara kimiawi.
Syarat:
- Ikatan yang terbentuk tidak menyebabkan gangguan (merusak/
melemahkan) immunoactivity Antigen-Antibody
Universitas Gadjah Mada
- Terbentuk/terjadi immobilisasi antara antigen atau antibodi dengan suatu
solid-support, tanpa mengganggu immunoactivity dan/atau spesifitasnya
Label yang sudah digunakan :
- molekul radioaktif
- chemiluminescent molecules
- Enzyme (stabil, mudah operasinya, substratnya mudah disiapkan, mudah
ditera secara colorimetric atau spectrophotometric)
Horseradish peroxydase
Alkaline phosphatase
B-galactosidase
Asetyl-cholinesterasi
Solid support yang sudah digunakan:
polystyrene, polyvinil, polyacrylamide, glass, silica, nylon, titanous
ydroxide, nitrocellulose, agarose

Aplikasi : Immunocapture, misal ELISA
Agglutinous Assay adanya lebih dari satu binding site --> cross
linked terjadi molekul besar atau clumping cells --> visible
- Elisa tersedia berupa kits yang makin ringkas, dapat diautomisasi dengan
komputer.
- Sensitif 1 jig atau ng toksin; 10
4
-10
5
sel/ml
- Cepat1-2jam

Teknologi Immuno-Assay

- Produksi antibody (Immunoglobulin)
o menyuntikkan antigen (Ag) tertentu (misalnya Salmonella, racun,
protein tertentu) pada hewan (kelinci, kambing, domba, dsb)
o mengambil darah hewan yang telah disuntik dan
dipisahkan serum yang mengandung antibody tertentu
- Produksi Antibody yang ditempeli enzim
- Pengujian sampel terhadap mikrobia atau racun (antigen) tertentu
o Menempelkan antigen (sampel) atau antibody pada suatu bahan
(fase padatan tertentu)
Universitas Gadjah Mada
o Mereaksikan antigen dengan antibody atau antibody dengan
antigen
o Mereaksikan enzim yang menempel pada antibody dengan
substrat yang sesuai
o Mendeteksi atau menera reaksi enzim terhadap substrat
o Mengevaluasi hasil reaksi

Ada 3 cara mereaksikan antigen-antibody dan peneraan reaksi enzimnya
1. Enzyme Immuno-Assay Langsung
a. Menempelkan Ag (sampel) pada padatan penyangga. Bahan-
bahan yang tidak menempel dicuci.


b. Mereaksikan antibody yang ditempeli enzim (E-Ab) dengan
Antigen (Ag). Bahan-bahan yang tidak menempel dicuci.


c. Mereaksikan substrat yang sesuai dengan enzim yang menempel
pada antibody

Universitas Gadjah Mada
d. Menera reasksi E + S P + E
Misalnya dengan spektrofotometer dapat ditera pengurangan
substrat atau terbentuknya produk.

2. Enzyme Immuno-Assay Sandwich




3. Enzyme Immuno-Assay Tidak Lansung




Universitas Gadjah Mada
Enzim yang telah digunakan a.l:
Peroksidase, alkaline phosphatase, glikosidase Penyangga fase padat
yang telah digunakan untuk menempel (immobilized) a.l.:
- tabung polistiren
- tabung polivinil
Keduanya berisi suspensi Titanous hidroksida

DNA PROBE
Prinsip kerja :
- DNA memiliki benang double helix yang komplementer secara spesifik
satu sama lain, dengan urutan basa nukleotida sebagai cirinya.
- Benang double helix dapat terurai secara reversibel dengan perlakuan
panas atau perlakuan kimia.
- Benang tunggal DNA dapat dipecah dengan enzim nuclease menjadi
segmen-segmen kecil yang masih membawa ciri genetik.
- Segmen DNA tunggal ini dapat bergabung dengan benang tunggal
komplementernya yang utuh.

Urutan kerja dalam penentuan dengan DNA probe :
a. sampel ditampung dalam bahan penyangga, misal membran filter
b. diperlakukan dengan detergen untuk membuka double heliks c
c. perlakukan dengan enzim untuk melepas double heliks
Bahan-bahan non DNA didigesti, benang DNA dilekatkan pada
penyangga (filter)
d. DNA-probe (segmen DNA yang diberi label isotop) direaksikan pada
bahan, segmen-segmen DNA akan mencari pasangannya dan
menempel.
e. Sisa DNA-probe yang tidak terikat dicuci, DNA probe yang menempel
(terikat) dihitung.
DNA probe dapat ditempeli muatan radioaktif, enzim, senyawa fluorescent atau
antibodi.



Universitas Gadjah Mada
Biosensor
Mengubah proses reaksi dari suatu metoda penentuan, misalnya
enzimatis menjadi sinyal fisis, kemudian sinyal tersebut diperkuat dan
selanjutnya dibaca dengan komputer print out hasil.