Transgnesis Vegetal

Septiembre 2014
Manipulacin gentica de organismos
Esquema de Produccin de una planta
transgnica
Sistemas de transferencia gentica en plantas
Basados en vectores biolgicos
Biologa de Agrobacterium tumefaciens
Vectores basados en el plsmido Ti
Genes reporteros
Basados en la transferencia directa de ADN
Transformacin por biobalstica
Transformacin con whiskers de carburo de silicio
Referencias bibliogrficas
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Resumen
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Presentacin
La chapa no importa,
importa lo que hagan
Presentacin
Juan Pablo Allocati
jallocati@gmail.com
allocati.juan@inta.gob.ar
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Manipulacin
gentica de
organismos
El hombre a manipulado los organismos vivos desde hace
mucho tiempo
Mejoramiento gentico de plantas desde hace 10,000 aos
Mejoramiento gentico de animales hace 5,000 aos.
Mejoramiento de caninos hace 4,000 aos
La produccin de organismos transgnicos para uso mdico
es aceptada
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Manipulacin
gentica de
organismos
Qu son los organismos Transgnicos o
genticamente manipulados?
Los organismos transgnicos son aquellos a los que se les ha
introducido material gentico propio o extrao por mtodos de
laboratorio que involucran el uso de tcnicas de DNA
recombinante
Muchos genes son compartidos entre bacterias, plantas y animales
incluyendo el ser humano.
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Esquema de
produccin de
una planta
transgnica
La informacin hereditaria (genes)de todos los seres vivos
es qumicamente idntica (DNA) y funcionalmente muy
parecida.
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Esquema de
produccin de
una planta
transgnica
Plantas
Maduras
Plantas
transgnicas
frtiles
Polinizacin
Semillas
Embriones
inmaduros
Proliferacin
de clulas
Callos
Callos
seleccionados
Seleccin
I ntroduccin
de ADN
Regeneracin
Brotes
regenerados
Enraizamiento
Maduracin
Rustificacin
Plntulas
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Esquema de
produccin de
una planta
transgnica
(A. tumefaciens)
Las semillas de una planta modificada
heredan de manera estable la nueva
caracterstica de sus padres
Los genes introducidos se transmiten a travs de las semillas
de generacin en generacin como cualquier otra
caracterstica (gen) de la plantas
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Sistemas de
transformacin
basados en
A. tumefaciens
De dnde surge la tecnologa para producir plantas
transgnicas?
Surge del estudio de una bacteria del suelo, llamada Agrobacterium
tumefaciens, que de manera natural y hace muchos millones de aos
modifica genticamente las clulas de las plantas.
Esta bacteria existe en los suelos de todo el mundo y ha sido estudiada
desde finales del siglo XIX
El ADN bacteriano se integra al genoma
de la planta y se expresa
La bacteria se pone
en contactocon la
planta a travs de
heridas y transfiere
ADN
Agalla de la corona
Clula vegetal infectada
Proliferacin celular
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Agrobacterium: Uno de los primeros ingenieros
genticos de la naturaleza
Sistemas de
transformacin
basados en
A. tumefaciens
Sistemas de
transformacin
basados en
A. tumefaciens
Agrobacterium: Uno de los primeros ingenieros
genticos de la naturaleza
Esta bacteria modifica el
genoma de las clulas
vegetales
transfirindoles genes
que las obliga a
reproducirse y proveerla
de alimento
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Transformacin
de cotiledones
de soja mediante
co-cultivo con
A. tumefaciens
Tomado de: Olhoft et al., Planta, 2003.
Genes reporteros
seleccionables
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Transformacin
de Arabidopsis
thaliana por
infiltracin floral
con
Agrobacterium
tumefaciens
Genes reporteros
seleccionables
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Zhang et al. Nature Protocols 1(2) (2006).
Las plantas florecidas se sumergen en un cultivo
de Agrobacterium tumefaciens. Luego se recogen las semillas
y se germinan en un medio con agente selectivo.
Tratar con anti bi ti co para el imi nar al
Agrobacteri um y seleccionar las cl ul as
vegetales transformadas

2-4 semanas

Transpasar los discos de hojas sobrevi vientes
a medi o fresco de sel ecci n / regeneraci n

6-10 semanas

Enrai zar l as plnt ul as en seleccin

4-6 semanas

Rusticar las pl antas transgnicas

Ti empo total en cul ti vo: 12-20 semanas
Co-cul tivar discos de hojas con Agrobacteri um

1-2 das

Lavar l os di scos de hoj as
Tiempos
estimados para
un protocolo de
transformacin
estndar
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Transformacin
con A.
tumefaciens por
infiltracin al
vaco
Genes reporteros
visualizables
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
La tcnica es:
Rpida: la protena recombinante puede obtenerse en aproximadamente una semana.
Eficiente: alta eficiencia de transformacin; acumulacin de protenas comparable con la de plantas
transgnicas. (hasta 40 mg/kg de hoja)
Simple: slo se requiere equipamiento bsico.
Flexible: puede utilizarse para producir protenas de membrana, enzimas o virus quimricos o para
ensayar promotores.
Transformacin
con A. rhizogenes
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Causes hairy root disease races en cabellera instead of crown gall.
DNA transfer occurs without virE1 and virE2 proteins.
Another part of Root- Inducing (Ri) plasmid encodes a protein that substitutes for virE2;
GALLS proteins
Galls gene is essential for transfer of DNA into plant cells from Agrobacterium rhizogenes,
and is inducible with acetosyringone
Uninfected control virE2-mutant pTi virE2-mutant pTi + GALLS
The egfp marker has the advantage that it does not require an exogenous
substrate or cofactor except for oxygento be visualized. (Van de Velde et al
2003)
Agrobacterium rhizogenes transformation
of Sesbania rostrata roots and nodulation
of cotransformed hairy roots. (A)
Seedling infection protocol in which
seedlings were inoculated with a needle
at the height of the hypocotyl. Transgenic
root growth was preceded by calli
formation (arrowhead). After 34 weeks
transgenic roots grew vigorously from the
wound site. (BE) Embryonic axis
infection protocol. (B) Two to three weeks
after inoculation, transgenic roots grew
from the needle-wounded hypocotyl site.
(C) Vigorous growth of a transgenic root
from the infection site 45 weeks after
inoculation. (D) Tube system for
nodulation experiments. (E) egfp-
cotransformed transgenic roots emerging
from the infection site, next to a non-
cotransformed transgenic root .
Transformacin y
regeneracin con
A. rhizogenes
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
El cultivo de races trasformadas por A. rhizogenes presenta muchas ventajas en comparacin con
el cultivo de clulas y de races sin transformar.
1. Un crecimiento ms acelerado y una mayor productividad de metabolitos secundarios.
2. Los cultivos de races transformadas son una fuente potencial de compuestos farmacuticos.
3. A. rhizogenes tambin se ha utilizado para la introduccin de genes en races de resistencia a
nemtodos en caa de azcar.
4. De igual forma puede tener aplicacin para procesos de fitoremediacin con la produccin de
races capaces de remover uranio de soluciones acuosas.
Control sin
transformar, c/Bi
transformados en
medio selectivo
Seguimiento de la transformacin de embriones de maz
y regeneracin de una planta transgnica mediante
la reaccin histoqumica de la enzima -glucuronidasa.
Expresin del
gen uidA en
plantas de maz
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Sistemas de
transferencia
directa de ADN
Ventaj as

- Son considerados sistemas universales porque, al no
depender de organismos vectores, pueden aplicarse
a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las clulas del organismo vector
de los tejidos o plantas transgnicas

- Requieren construcciones ms simples y pequeas

- Son apropiados para estudios de expresin transitoria
Desventaj as

- Pueden resultar en un alto nmero de copias y/o copias
truncas del transgn y del vector en varios sitios del
genoma de las clulas transformadas

- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparicin de
re-arreglos en los transgenes
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Las tcnicas de
biobalistica
fueron
desarrolladas en
los aos 80.
Bombardeo de micropartculas

1984. Sandford et al., describen la tcnica de
bombardeo de micropartculas para la transferencia
directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU).
Mecanismo de disparo de un can impulsado
por He a alta presin (PDS 1000/He)
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Las tcnicas de
biobalistica
fueron
desarrolladas en
los aos 80.
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
La
transformacin
por biobalstica
depende de
diversos
parmetros.
Parmetros fsicos y qumicos que influyen
en la transferencia del ADN

- Mtodo de aceleracin de las micropartculas

- Naturaleza qumica y fsica, densidad y volumen
de las micropartculas

- Naturaleza, preparacin, adherencia y concentracin
del ADN

- Vaco y distancias de bombardeo

- Dimetro de apertura de la placa de retencin

- Nmero de bombardeos
Parmetros relacionados con la construccin
gentica utilizada

- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y
genes marcadores de seleccin
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
La
transformacin
por biobalstica
depende de
diversos
parmetros.
Parmetros relacionados con el tejido o clulas
blanco

- Genotipo de la planta a utilizar

- Tipo y capacidad de regeneracin in vitro de los explantos

- Preparacin y condiciones de cultivo de los explantos
pre- y post-bombardeo

- Requerimientos de temperatura, fotoperodo y humedad
de la planta donante de explantos y del tejido bombardeado
Respuestadelosgenotiposalatransformacin
0
50
100
150
200
250
300
350
400
puntos azules
por disparo
BLS14 HL22
genotipos
Respuesta de los genotipos a la transformacin
pAct1D+pAcH1 pDMC208+pAcH1
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Transformacin
con Whiskers de
carburo de
silicio.
Nanobiotecnologa
A B C
D E F
Adaptado de: Frame et al. The Plant Journal, 1994 y de Petolino et al. Plant Cell
Reports, 2000.
A: suspensiones celulares de maz penetradas por fibras de carburo de silicio (0,3-0,6 m por 10-
100 m) recubiertas de ADN (transformacin)
B: expresin transitoria del gen uidA luego de la transformacin
C: callos resistentes a fosfinotricina
D y E: inflorescencia y fruto de una planta transgnica R0
F: ensayos de resistencia a fosfinotricina con plantas R1 dos semanas despus del tratamiento
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Transferencia
directa de ADN
versus
Agrobacterium
tumefaciens?
Vs.
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
Investigaciones
Aumento del valor nutritivo
Maduracin controlada de frutos y flores (leafy, apetala1,e etc) y
manipulacin de la senescencia.
Resistencia a condiciones ambientales extremas (sequa, salinidad,
fro)
Mejora del rendimiento. Cultivos resistentes a plagas, enfermedades
y herbicidas.
Las plantas como biofactoras y como vacunas orales para
veterinaria (enzimas, anticuerpos, antgenos).
Fitorremediacin
Digestibilidad de materia seca, control del empaste.
Todo lo que pueda hacerse no transgnico, se har de esa forma.
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal
1. Allocati, JP. Estudio del comportamiento en cultivo in vitro de lneas de maz flint:
competencia para la transformacin gentica. Tesis Licenciatura. Instituto de Investigaciones
Biotecnolgicas Universidad Nacional de General San Martn. Link
2. Baroja-Fernandez, Edurne , Muoz, Francisco Jose , Moran-Zorzano, Maria Teresa, Allocati,
Juan Pablo, Etxeberria, Ed , Alonso-Casajus, Nora, Pozueta-Romero, Javier . Enhancing
cytosolic ADP-glucose synthesizing sucrose synthase activity in transgenic potato tubers
results in increased starch content. Botany and Plant Biology 2007. July 7-11, 2007 * Hilton
Chicago * Chicago, Illinois. Link
3. Bent, A.F. Arabidopsis in planta transformation. Uses, mechanisms, and prospects for
transformation of other species. Plant Physiology, 124:1540-1547, 2000. Link
4. Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd. (Haifa, IL) .Pollen-mediated method for
transformation of maize, tomato or melon. United States Patent 6806399. Carmel-Haifa
University Economic Corporation Ltd. (Haifa, IL) . Link
5. Gelvin, S.B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "Gene-
Jockeying" tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67:16-37, 2003. Link
6. Gelvin, S.B. Improving plant genetic engineering by manipulating the host. Trends in
Biotechnology, 21:95-98, 2003. Link
7. Jim M. Dunwell. Transformation of Maize Using Silicon Carbide Whiskers.. Feb-15-1999;
DOI:10.1385/1-59259-583-9:375. Springer Protocols. Link
8. Rajesh Luthra , Varsha, Rajesh K. Dubey, Ashok K. Srivastava and Sushil Kumar.
Microprojectile mediated plant transformation: A bibliographic search. Central Institute of
Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), P.O. CIMAP, Lucknow, 226 015, India. Link
9. Tepfer D. 1983. The biology of genetic transformation of higher plants by Agrobacterium
rhizogenes. In: Molecular genetics of the bacteria plant interaction. A. Phuler (ed.). Springer.
Berlin, p. 248-258. Link
10. Tzfira, T. and Citovsky, V. Agrobacterium-mediated transformation of plants: biology and
biotechnology. Current Opinion in Biotechnology, 17:147-154, 2006. Link
11. Van de Velde W, Mergeay J, Holsters M, Goormachtig S (2003) Agrobacterium rhizogenes-
mediated transformation of Sesbania rostrata. Plant Science 165: 1281-1288. Link
Bibliografa
Agrobiotecnologa
Plantas transgnicas
Transformacin Vegetal