23/09/2014

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FACULTADDE CIENCIASQUMICAS
UNIVERSIDAD AUTNOMADENUEVO LEN
ESPECTROSCOPIADEFLUORESCENCIA,
FOSFORESCENCIAY
Q O SC C O C QUIMIOLUMINISCENCIAMOLECULAR
ABSORCIN

MOLECULAR
FUNDAMENTOSDEABSORCINEMISIN
FacultaddeCienciasQumicas
2
EMISIN
ATMICA
ATMICA
MOLECULAR
UV-Vis
Fluorescencia
M*
Liberacin de calor
E i i d f t
MECANISMOSDEDESEXCITACIN
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3
Fosforescencia
Emisin de un fotn
Reaccin fotoqumica
Transferencia de energa
Fenmenosluminiscentes
Emisindeluz queesconsecuencia dela absorcinprevia de
una radiacin.La excitacintienelugarporabsorcinde
fotones.
Fotoluminiscencia
Tipodeluminiscencia entreestadoselectrnicosconla misma
multiplicidadS
1
S
0
.
Fluorescencia
Tipodeluminiscencia entreestadoselectrnicoscondiferente
multiplicidad T
1
S
0
Fosforescencia
FacultaddeCienciasQumicas
4
multiplicidadT
1
S
0
Laenergadeexcitacinprovienedeunareaccin
qumica.
Quimioluminiscencia
Cuandolaquimioluminiscenciatienelugarenunser
vivo.
Bioluminiscencia
(delGriego,tribo =frotar):seproducealliberarsela
energaalmacenadaenciertassustanciascristalinas,
ycomoconsecuenciadesurotura.
Triboluminiscencia
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Estado excitado singulete
ESTADOSELECTRNICOS
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Estado basal
singulete
Estado excitado triplete
DIAGRAMADENIVELESDEENERGAPARAMOLCULAS
FOTOLUMINISCENTES
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PROCESOSDEDESACTIVACINNORADIOACTIVOS
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Radiactivos
Fluorescencia
Fosforescencia
Conversin interna
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Procesosde
desactivacin Noradiactivos
(isoenergticos)
Conversininterna
Cruceentre
sistemas(cambio
despin)
Externos
(colisiones)
Conversin
externa(al
disolvente)
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La conversin interna:
Cuando dos niveles electrnicos estn lo suficientemente prximos
Procesos de desactivacin no radiactivos. Describe los procesos
intermoleculares por los cuales la molcula pasa a un estado electrnico
de ms baja energa sin emisin de radiacin.
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Cuando dos niveles electrnicos estn lo suficientemente prximos
para que se solapen los niveles de energa vibracional.
Esta conversin es normalmente ms probable que la prdida de
energa por fluorescencia (especialmente en compuestos alifticos).
Procesosdedesactivacinnoradioactivos
La conversin externa:
Es el proceso mediante el cual la desactivacin ocurre de un
estado electrnico excitado a travs de la transferencia de
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energa entre la molcula excitada y el disolvente u otros
solutos.
Entonces aquellas condiciones que reduzcan el nmero de
colisiones (baja T y elevada viscosidad) aumentan la
fluorescencia.
Procesosdedesactivacinnoradioactivos
El cruce entre sistemas:
Es un proceso en el cual se invierte el espn de un electrn excitado (cambia
la multiplicidad de la molcula).
Se favorece con la presencia de tomos pesados (I, Br) (efecto del tomo
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pesado) y especies paramagnticas (O
2
) en solucin.
Despus del cruce entre sistemas a un estado triplete excitado, la
desactivacin posterior puede tener lugar por conversin interna, externa o
por fosforescencia.
Las conversiones internas y externas compiten con tanto xito con la
fosforescencia que normalmente se observa a bajas T, en medios altamente
viscosos o por molculas adsorbidas en superficies.
DesplazamientodeStokes:
Laenergadelaemisinde
fluorescenciaesmenorque
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laenergadeabsorcin.
Elespectrodeemisines
independientedela
longituddeondade
excitacin.
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VARIABLESQUEAFECTANALAFLUORESCENCIA
YFOSFORESCENCIA
Longituddeondadeexcitacin.
Tiempodevidadelestadoexcitado.
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Entorno qumico:
- Influencia de disolvente.
- Influencia del pH.
- Influencia de oxgeno disuelto.
- Temperatura.
Estructura Molecular:
- Efecto de tomo pesado.
- Rigidez.
- Formacin de quelatos.
Factoresestructurales
Favorecenlaflourescencia
Sistemas aromticos policclicos
Los sustituyentes que ayudan a
deslocalizar e

s
(NH
2
, OH, F,
OCH
3
, NHCH
3
y N(CH
3
)
2
).
C d i d ill
Nofavorecenlafluorescencia
Gruposatrayentesdee

s
(Cl,Br,
I,NHCOCH
3
,NO
2
COOH)
Sustitucindehalgenosreduce
fluorescenciayaumenta
fosforescencia
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Condensacin de anillos
bencnicos y heterociclos
aumenta la eficacia.
Rigidez estructural.
fosforescencia.
Heterociclossimplesson
inactivos.
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VARIABLESQUEAFECTANALAFLUORESCENCIAY
FOSFORESCENCIA
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VARIABLESQUEAFECTANALAFLUORESCENCIAY
FOSFORESCENCIA
Rigidez:
Todo lo que contribuye a
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Todo lo que contribuye a
establecer estructuras
planas y rgidas favorece la
fluorescencia.
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Temperatura:
Una disminucin de T aumenta la eficacia cuntica de la
fluorescencia ya que reduce la frecuencia de colisiones y por lo tanto
la probabilidad por conversin externa.
Disolvente:
Un aumento de la viscosidad del disolvente reduce la probabilidad
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p
de conversin externa y conduce a un aumento del rendimiento
cuntico de fluorescencia.
Si contiene tomos pesados disminuye la fluorescencia (Ej. CCl
4
,
yoduro de etilo).
En general, disolventes que tienen Br, I, NO
2
N=N provocan
fosforescencia.
VARIABLESQUEAFECTANALAFLUORESCENCIAYFOSFORESCENCIA
Efecto del pH:
Afecta el estado de carga del fluorforo. Tanto la longitud de onda
como la intensidad de emisin son diferentes para la forma ionizada y
no ionizada del compuesto.
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Efecto del oxgeno disuelto:
La presencia de O
2
reduce la intensidad de fluorescencia debido a la
oxidacin de las especies fluorescentes. Favorecen el cruce de
sistemas y la conversin a estados tripletes.
VARIABLESQUEAFECTANALAFLUORESCENCIA
YFOSFORESCENCIA
Efecto Quelato:
El aumento de fluorescencia cuando ciertos
compuestos orgnicos formas quelatos con iones
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compuestos orgnicos formas quelatos con iones
metlicos, por incremento en la rigidez estructural.
RENDIMIENTOCUNTICO()
Nmero de molculas que emiten luminiscencia respecto al
nmero total de molculas excitadas.
productos M fotn M
*
formadas o consumidas molculas
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k: constantedevelocidad.
f: fluorescencia.
ces: cruceentresistemas.
ce: conversinexterna.
ci: conversininterna.
pd:predisociacin.
d: disociacin.
formadas o consumidas molculas
absorbidos fotones

: 0.0 a 1.0
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CARACTERSTICASDELAEMISIN
DEFLUORESCENCIA
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1. Representacin de la fluorescencia frente a la longitud de onda de excitacin.
2. Si una molcula posee un nico fluorforo el espectro de excitacin coincide con el de
absorcin, ya que el rendimiento cuntico no depende de la longitud de onda de la
radiacin absorbida.
3. Permite averiguar el fluorforo responsable de la emisin fluorescente a una determinada
en una molcula con varios cromforos cuyos espectros de absorcin se solapan.
ESPECTROSDEEMISIN
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ESPECTROSDEEXCITACINYDEEMISIN
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El espectro de excitacin se obtiene midiendo la intensidad luminiscente a una
longitud de onda fija variando la longitud de onda de excitacin y es
prcticamente igual a un espectro de absorcin.
Los espectros de fluorescencia y fosforescencia se obtienen con la excitacin a una
longitud de onda fija mientras se registra la emisin en funcin de la longitud de
onda.
ECUACINDEKAVANAGH
Concentracin:
F=K'(P
0
P)(EcuacindeKavanagh)
A b j t i d l lit P t F K" C
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Abajasconcentracionesdelanalito yaP
0
cte.: F=K"C
F=potenciadelaemisinflourescente
Aaltasconcentracionesocurrendesviacionespor:
Autoatenuacin: Mayornmerodecolisiones.Conversionesexternas.
Autoabsorcin: Radiacinemitidaqueesreabsorbidapormolculas
vecinas.
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ECUACINDEKAVANAGH
F = K" C, define la proporcionalidad lineal entre la seal y la
concentracin, que lo hace cuantitativamente til a la
espectrofluorimetra mientras se cumpla bc 0.05.
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EJERCICIOS
A cuatro alcuotas de 10 mL de una muestra de agua, se adicionaron 0.0, 1,
2 y 3 mL de una disolucin estndar de Aluminio III de concentracin 10
ppb. Se adicionaron a cada una 5 mL de una disolucin que contiene un
agente quelante para aluminio que es Rojo de Alizarina R (complejo
formado fuertemente fluorescente), las disoluciones se diluyeron a 50 mL.
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a) Calcule la concentracin para cada disolucin.
b) Representar la curva de calibracin por adicin de estndar, su ecuacin lineal y
coeficiente de correlacin.
c) Calcular la concentracin de Aluminio III en la muestra problema original por el
mtodo grfico y por su ecuacin lineal.
INSTRUMENTACINEN
ESPECTROSCOPADEFLUORESCENCIA
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YFOSFORESCENCIAMOLECULAR
FLUORESCENCIAYFOSFORESCENCIA
Qudiferencialafluorescenciadelafosforescencia?
Una sustancia fluorescente emite luz (azulada) cuando se le
estimula, inducindole una radiacin externa y deja de
emitirla cuando se le deja de aplicar esa radiacin
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emitirla cuando se le deja de aplicar esa radiacin.
Una sustancia fosforescente, siguen emitiendo luz (verdosa),
incluso cuando se las deja de iluminar o de aplicar una
radiacin.
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INSTRUMENTOS
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FUENTEDERADIACIN
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Lmpara de arco de Hg: emite lneas a 254, 302, 313, 546,
578, 691 y 773 nm que se pueden aislar con filtros
adecuados.
FUENTEDERADIACIN
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Lmpara de arco de Xe: fuente de radiacin continua desde
250 a 800 nm.
Lseres: ideales cuando las concentraciones son muy bajas y
cuando se requiere radiacin monocromtica para minimizar
los efectos de las interferencias fluorescentes.
Seleccin de longitud de onda: Se utilizan tanto los filtros
de interferencia como los de absorcin al igual que
monocromadores.
INSTRUMENTOS
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Detectores: se utilizan principalmente los tubos
fotomultiplicadores.
Celdas o Porta Muestra: Se utilizan cubetas tanto
cilndricas como rectangulares fabricadas con vidrio o con
slice.
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FLUOROMETROS
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Baratos y simples
ESPECTROFLUORMETRO
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FOSFORMETROS
1. Dispositivo que alterna excitar (irradiando la muestra) y
medir la intensidad de fosforescencia (despus de un retraso
de tiempo adecuado). Esto es necesario para separar la
emisin fosforescente de larga vida de la fluorescente.
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2. Normalmente las medidas de fosforescencia se realizan a T
de nitrgeno lquido (77 K) para prevenir la degradacin de
salida por desactivacin colisional. Por lo que se requiere un
recipiente Dewar con ventanas de cuarzo. El analito existe en
forma de un soluto en un disolvente slido.
FOSFORMETROS
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FLUORFOROS
Fluorforo, componente de una molcula que hace
que sta sea fluorescente.
A li i bi i di b
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Aplicaciones: bioqumica, estudios sobre protenas,
inmunofluorescencia e inmunohistoqumica; anlisis
de ADN, mediante la tcnica de PCR en tiempo real.
ESTRUCTURADEALGUNOSFLUORFOROS
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Fluorescena

ex
=494 nm y
em
=521 nm
Rodamina

ex
=540 nm y
em
=570 nm
ESTRUCTURADEALGUNOSFLUORFOROS
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MATERIALESFOSFORESCENTES
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APLICACIONES
Sensibilidad.
Los mtodos fluorimtricos son ms sensibles que los
mtodos de absorcin.
En general, los mtodos fluorimtricos suelen ser entre 10
y 100 veces ms sensibles que los espectrofotomtricos
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y 100 veces ms sensibles que los espectrofotomtricos.
Selectividad.
La selectividad de los mtodos luminiscentes suele ser
mayor que los de absorcin.
Muchas especies son capaces de absorber radiacin, pero
el nmero de ellas que pueden reemitir es mucho menor.
APLICACIONES
Selectividad.
Tanto la longitud de onda de excitacin, como la de
emisin, pueden seleccionarse para minimizar
interferencias, mientras que en espectrofotometra solo la
l d d d d b l bl
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longitud de onda de absorcin es seleccionable.
Por tanto, si dos materiales fluorescentes difieren en el
espectro de excitacin o de emisin, es factible analizar
uno selectivamente en presencia del otro.
APLICACIONES
Determinacin fluorimtrica de especies inorgnicas.
Quelatos Fluorescentes.
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Determinaciones Indirectas.
APLICACIONES
Determinacin fluorimtrica de especies orgnicas.
Determinacin fluorimtrica de vitaminas.
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APLICACIONES
Qumica Clnica.
Fenilalanina: Determina subnormalidad, ya que, la
incapacidad para metabolizar este aminocido.
Corticosteroides: Evaluar la funcin de las glndulas
suprarrenales.
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p
Catecolaminas: Influencia sobre el sistema vascular.
Estrgenos: en orina, (~0.05 g/mL).
Porfirinas: en orina, que pueden servir para indicar defectos
en la mdula sea, trastornos hepticos e incluso
envenenamiento por plomo, etc.
Determinacin de la secuencia de nucletidos en el ADN
con marcas fluorescentes.
APLICACIONES
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APLICACIONES
Anlisis Forense.
Detectar huellas digitales latentes por fluorescencia
producida por lser.
Q i A li t i
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Qumica Agroalimentaria.
Antioxidantes.
Contaminacin ambiental.
Hidrocarburos aromticos polinucleares.
COMPARACINENTRETCNICAS
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QUIMIOLUMINISCENCIA
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INTRODUCCIN
Las reacciones qumicas que producen
quimioluminiscencia son pocas, limitando el
procedimiento a un nmero pequeo de especies.
P t t i l ill lt
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Para estos casos se caracterizan por la sencillez, alta
selectividad y sensibilidad.
Bioluminiscencia. Cuando la emisin proviene de seres
vivos
Bioluminiscencia
lucirnaga
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ELFENMENODELAQUIMIOLUMINISCENCIA
En los sistemas biolgicos, tambin se
producen reacciones quimioluminiscentes,
en estos casos, el proceso se denomina
bioluminiscencia.
L i i l d
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Lucirnagas, ciertas algas y medusas,
bacterias, protozoos, crustceos.
La qumica de los procesos naturales
bioluminiscentes no se conoce totalmente.
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QUIMIOLUMINISCENCIA
Hace ms de un siglo que se descubri que ciertos
compuestos orgnicos sencillos eran capaces de
presentar quimioluminscencia.
La reaccin ms sencilla para formular
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La reaccin ms sencilla para formular
quimioluminiscencia es:
Donde C* representa a la especie en el estado excitado.
QUIMIOLUMINISCENCIA
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QUIMIOLUMINISCENCIA
Luminol +H
2
O
2

O
2
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3-aminoftalato +3 H
2
O +N
2
+ hv ( =450 nm)
QUIMIOLUMINISCENCIA
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EQUIPO LUMINMETRO
Compartimiento de muestra aislado de la luz.
Fotomultiplicador de alta sensibilidad.
Soluciones de concentracin conocida curva estndar de luz
emitida luz del problema concentracin.
Las medidas deben hacerse inmediatamente despus de la
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Las medidas deben hacerse inmediatamente despus de la
mezcla de los reactivos.
APLICACIONES
Determinacin quimioluminiscente de metales.
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