INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingenieras

Campus Guanajuato



Ingeniera Farmacutica

Laboratorio de Biotecnologa Farmacutica

Reporte de la prctica #3: Bioinformtica

Integrantes:

Yvan Arroyo Gnem
Omar Enrique Murillo Ayala
Jana Arriaga Moreno
Maritza Fernanda Reyes Ziga
Deyandira Barroso Salas






Fecha de entrega: 25 de Septiembre del 2014



Grupo: 6FV1






Objetivos
Objetivo general: Conocer, aprender e interactuar con las bases de datos actualmente
utilizadas para realizar anlisis de datos biolgicos y utilizarlas para analizar una secuencia
elegida.

Objetivo especfico: Seleccionar una secuencia nucleotdica de la base de datos de NCBI y
analizarla mediante el uso de BLAST y ExPASy terminando con el diseo de un juego de
Primers con ayuda de DNASTAR.

Introduccio n
En la actualidad la Bioinformtica es, en un contexto general, la disciplina que resulta de la
aplicacin en la computadora, as como las teoras, mtodos y procedimientos que le son
propios, al mbito de las Ciencias de la Vida. No obstante, actualmente no parece haber un
acuerdo general sobre cules son los objetivos y el mbito de aplicacin de esta disciplina.
(Lahoz, 2010). Al contrario, varias son las escuelas o tendencias en las que se rigen los
investigadores. Tal es la escuela formal, que define a la Bioinformtica como la aplicacin
de los sistemas computacionales en la investigacin, almacenamiento y anlisis de la
informacin biolgica (Sobral, 1997). El trmino informacin biolgica hace referencia a
las secuencias de protenas y cidos nucleicos (ADN y ARN). La bioinformtica es por sus
caractersticas una disciplina integradora que surge del encuentro o reunin de aquellos
proyectos en los que un sistema biolgico es analizado, modelado o simulado aplicando
teoras, mtodos y procedimientos informticos. (Lahoz, 2010). Por este motivo, la
Bioinformtica es la disciplina que rene o da cabida a los experimentos clsicos de
simulacin en Biologa, el estudio de las secuencias de protenas y cidos nucleicos y que
han conducido al desarrollo actual de la Genmica y Protemica, los modelos y las tcnicas
de Vida Artificial e Inteligencia Artificial, el diseo y mantenimiento de bases de datos,
bibliotecas on line etc... (Lahoz, 2010)
Segn la definicin del National Center for Biotechnology Information (NCBI) la
Bioinformtica es la disciplina cientfica que combina ciencias como la biologa,
computacin y las tecnologas de la informacin.
El objetivo de esta disciplina es investigar y desarrollar herramientas tiles para llegar a
entender el flujo de informacin. Inicialmente, la Bioinformtica se ocupaba sobre todo de la
creacin de bases de datos de informacin biolgica, especialmente secuencias, y del
desarrollo de herramientas para la utilizacin y anlisis de los datos contenidos en esas bases
de datos. La Bioinformtica ha ido evolucionando para ocuparse cada vez con mayor
profundidad del anlisis e interpretacin de los distintos tipos de datos (secuencias de
genomas, proteomas, dominios y estructuras de protenas, etc).
(Consultado en: http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf.
Recuperado el 24/09/14)
Las bases de datos que se utilizan en la biologa molecular son archivos de datos de
diferentes reas que son almacenados eficaz y uniformemente y son de uso pblico para la
comunidad cientfica). (Lourdes, 2009).
Hay que tener en cuenta los siguientes aspectos:
- Los proveedores de recursos: centros u organizaciones especializadas en tener y
mantener las bases de datos.
- Las bases de datos: hay mucha variedad.
- Las herramientas para estudiar y analizar toda la informacin contenida en las bases
de datos y as poder extraer conocimiento en sentido biolgico a partir de ellas.

Existen bases de datos primarias que contienen secuencias de DNA y de protenas,
estructuras de protenas y perfiles de expresin de genes y protenas. Cada registro de estas
bases de datos contiene una secuencia y su correspondiente "anotacin" (comentarios que
incluyen informacin acerca de esa secuencia, habitualmente hechos de modo manual por
algn anotador). (Lourdes, 2009).
Las bases de datos secundarias archivan los datos que son fruto del anlisis de las bases de
datos primarias, tales como familias de protenas, motivos o dominios proteicos, familias de
genes, mutaciones, polimorfismos, implicacin en enfermedades, etc. (Lourdes, 2009).
Existen cientos de bases de datos, por el tipo de informacin se pueden distinguir:
bibliogrficas, taxonmicas, de nucletidos, genmicas, de protenas, de microarrays y otras.
Cabe mencionar que existe un catlogo completo de todas las Bases de Datos disponibles y
aparece todos los aos en la revista Nucleic Acids Research. (Lourdes, 2009).
Las bases de datos de secuencias de nucletidos son muy importantes para la biologa.
Existe una colaboracin internacional entre las 3 principales bases de datos de nucletidos:
EMBL-Bank, DDBJ (DNA Data Bank of Japan) y GenBank en el NCBI. Estas bases de
datos intentan alojar todas las secuencias de nucletidos que son de dominio pblico. Estn
divididas en varias secciones que reflejan grupos taxonmicos, adems de otros grupos tales
como secuencias EST (expressed sequence tag), patentes, secuencias HTGs (high-through-
put genomic sequences), etc. (Lourdes, 2009).

ExPASy es el acrnimo del ingls Expert Protein Analysis System, Sistema Experto de
Anlisis de Protenas, un servidor de protemica del Instituto Suizo de Bioinformtica
(Swiss Institute of Bioinformatics, SIB) que analiza secuencias y estructuras de protenas y
2D-PAGE. El servidor funciona en colaboracin con el Instituto Europeo de Bioinformtica
(European Bioinformatics Institute, EBI) desde el 1 de agosto de 1993. El ExPASy tambin
gestiona las bases de conocimiento de secuencias de protenas
UniProtKnowledgebase/Swiss-Prot y UniProtKnowledgebase/Trembl. (ExPASy, 2014).

DNASTAR es un software de Bioinformtica para el ADN, el ARN y el anlisis de
secuencias de protenas, incluyendo Sanger y la secuencia de montaje de ltima generacin.
El uso de esta herramienta permite el diseo de primers para llevar a cabo la duplicacin de
fragmentos de ADN de inters (PCR), el primer reacciona con la hebra sencilla de ADN
obtenida tras una desnaturalizacin aparendose en lugares especficos por
complementariedad de bases. Se asegura una tcnica de PCR adecuada y por ende la
obtencin del gen de inters. (DNASTAR, 2014)

La tcnica de PCR brinda mejores resultados con el uso de la bioinformtica pues se disean
Primers ms especficos con el fin de asegurarse de obtener el gen de inters.
La tcnica de PCR comprende tres etapas; la desnaturalizacin; donde se rompe la doble
hebra de ADN usando temperaturas de 94C-96C. El apareamiento es otra etapa donde los
primers se aparean en lugares especficos por complementariedad de bases a 50C-60C. La
ltima etapa comprende la extensin o polimerizacin donde se sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de ADN con ayuda de DNA polimerasa a temperaturas de
70-72. Una vez obtenidas las copias de los fragmentos de DNA de inters, se requiere la
separacin de los fragmentos y la identificacin de los mismos con ayuda de una
electroforesis. Los mapas de restriccin permiten identificar los sitios especficos donde las
endonucleasas llevaran a cabo los cortes en ADN, antes de realizar la electroforesis. La
electroforesis es una tcnica que permite realizar cortes de fragmentos de ADN as como
determinar el tamao de los mismos. Recuperado de: http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf. 24/09/14


Diagrama de flujo

Elegir una
secuencia
de un gen
Contar las
bases que
componen la
secuencia
Ingresar a
NCBI
Obtener
el BLAST
Dejar
solamente la
secuencia de
aminocidos
traducidos que
correspondan
a la protena
analizada
Contar
aminocidos
Calcular
PI y PM
con
ExPASy
Disear
Primers con
DNASTAR
Resultados

Gen elegido:









Justificacin de eleccin del gen:

Elegimos trabajar con Bacillus weihenstephanensis para disear los Primers y llevar a cabo
todo el proceso bioinformtico correspondiente a la prctica ya que es un microorganismo
de inters cientfico reciente. Algunos de los antecedentes que se encontraron en la literatura
donde se aplica la tcnica de PCR para el gen de este microorganismo se describen a
continuacin.

Cepas bacterianas pertenecientes al grupo Bacillus cereus pueden ser aislados de varios
tipos de alimentos, ya que son habitantes del suelo en diferentes zonas climticas (Stenfors
et al., 2002) y pueden contaminar fcilmente los alimentos crudos, as como los equipos de
procesamiento de alimentos. La leche y los productos lcteos pasteurizados son una fuente
comn de aislamiento de cepas psicrotolerantes de especies de Bacillus (Christiansson et al.,
1989). B. cereus puede producir mal sabor en la leche as como causar el defecto llamado
crema Bitty. (Meer et al., 1991)

En 1998, Bacillus weihenstephanensis se sugiri como una nueva especie del gnero B.
cereus con base en las diferencias de secuencia en los genes de ARN ribosomal y protenas.
Aunque las cepas psicrotolerantes constituyen claramente un grupo separado en el estudio de
1998, tambin estaba claro el alto grado de similitud en las secuencias de ADN, en la que las
especies del grupo B. cereus estaban estrechamente relacionadas. Dado que las cepas de B.
weihenstephanensis difieren en una caracterstica fisiolgica y la temperatura ptima de
crecimiento, existe una necesidad de establecer otras propiedades que son diferentes de las
de B. cereus. La patogenicidad de B. cereus est bien establecida, ya que segn la literatura
puede causar infecciones sistmicas, adems de ser un importante contribuyente a las
estadsticas de intoxicacin alimentaria de algunos pases (Noruega, Japn, los Pases
Bajos), B. cereus produce una toxina emtica y al menos tres enterotoxinas asociadas al tipo
diarreica de intoxicacin alimentaria (Vaisanen et al., 1991). La enterotoxina hemoltica Hbl
ha sido bien caracterizada y tiene varios efectos biolgicos, como causar gastroenteritis de
origen alimentario (Van et al., 1990). Hbl consiste en tres protenas, B, L1 y L2, que es
similar a la composicin de la enterotoxina no hemoltica Nhe (Lechner et al., 1998) . Un
tercio de la enterotoxina que causa la gastroenteritis por B. cereus fue descrita recientemente
despus de un brote en Francia, en el que tres personas murieron. Esta toxina fue nombrado
CYTK, y se compone de una sola protena necrtica y hemoltica de 34 kDa (Lund et al.,
2000).
Es por eso que Lotte et al., 2002 trabajaron con veintitrs cepas de B. weihenstephanensis
las cuales fueron sometidas a PCR para probar la presencia de componentes de genes que
codifican las enterotoxinas Hbl, Nhe y CYTK. (Ver Tabla 1)



Tabla 1. Secuencias y genes amplificados de B. weihenstephanensis.


La secuencia con la que se trabaj en la presente prctica es la siguiente:

aatcaacccaattgatgctattttatcccaacattccattatgcttcttgacggagcattagctacagaattgg
aggcgcatggatgtaatttggacgatcccctttggtcggcacgtgtgttactagaaaatccggaactaatttat
caggttcattcggactattttcgtgctggagcggactgtgccataacagcaagctatcaagctactattagtgg
tttttccgcgcgtggaatacaagaacaggaagctttggaattaattaagaaaacggtgttacttgcaagaaggg
caagagatgatttttggaaggaaaatacgcaaacgaataggcctaaaccattggttgttgcatcagttgggccg
tacggggcttaccttgcagatggttcagagtatgtaggcaactatggtgtgacagataaaacattagcagactt
tcaccgttcgagaatgtcagcgttaatcgaagcaggtgcagatctattggcatttgaaacgatcccttccctgc
aagaagcaagagtattagatacattattgcgtgagtttccagaaacatatgcttggctttccttttcgctaaaa
aatgagaaagagattagtgaaggtatgaaactcgtggagtgtgcacgagcttttgagaaaagtgaacaaattgt
agcgataggcatcaattgtgcgccagtaaccgttgtgactggtgcaatccaagagttgagggcaaacaccaaaa
aaccgattattgtttatccaaactcgggtgaaacttataatccagaatcaaaaacatggcatggtcatgaacaa
tgtaacgcgttggatattcaatctgaagaatggtaccaagcaggtgcacgtttaataggtggatgctgcagaac
gacaccttatcacattgaggagatatcgaacaagtggcgttcttccgagtttttctattcgaacgaagcaaaac
agtaatgtaatggatgataatctatctttgtgtgtattttcatgattttgcttgttcaggaatctacagttacg
tctattggcacaaaatgtcttttcagagacacaaatgtggatggtagcttcgggaatccagtggacttttgggt
accttaggtatggaaaggaatcagggaaaataaaaaccgctagtttaatagatatggtagacaacatgctgaat
cttttaatgaagatgtagttgatccaattgaaggtgaaggggaccatttattcgtaattgaagttaacgaagag
gttaatttagttattcaaaaaatagttcaataactatatgaaaatttgttgtggtaaaaatccttgttgtagta
gtaaatgtggtcatattgttgtaaaaaaggatagatgtaaacaggtatactctcctgttcatctatcctttcct
ttttaccttataaaatgtgtgacattatattcaatcgcataaatataggatttcattactatttccttgacttt
tattgaactacccccactttcacttcgtttaaaaga

Pasos para analizar la secuencia:

- Contar cuantas bases componen la secuencia a analizar, en la misma pgina de Word. La
secuencia tiene 1516 Bases.
- Buscar en Google: ncbi (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
- Presionar: BLAST
- Presionar: nucleotide BLAST
- Copiar la secuencia y pegarla en el recuadro




- Cambiar el parmetro: Choose Search Set, en lugar de Human genomic, poner others.
- Presionar: Blast (botn azul, hasta debajo de la pantalla)
- Enseguida aparecen todas las comparaciones de tu secuencia con los genomas de los
dems organismos:

- Copiar toda la informacin relacionada con la primera comparacin que hizo el blast,
como evidencia de la similitud DNA-DNA.
- > gb|CP000904.1| Bacillus weihenstephanensis KBAB4 plasmid pBWB401,
complete genome
- Length=417054
-
- Features in this part of subject sequence:
- amino acid permease-associated region
- homocysteine S-methyltransferase
-
- Score = 2532 bits (1371), Expect = 0.0 Identities = 1446/1479 (98%), Gaps
= 18/1479 (1%) Strand=Plus/Plus
-
- Query 4 CAACCCAATTGATGCTATTTTATCCCAACATTCCATTATGCTTCTTGACGGAGCATTAGC
63
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 54721 CAACCCAATTGATGCTATTTTATCCCAACATTCCATTATGCTTCTTGACGGAGCATTAGC
54780
-
- Query 64 TACAGAATTGGAGGCGCATGGATGTAATTTGGACGATCCCCTTTGGTCGGCACGTGTGTT
123
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 54781 TACAGAATTGGAGGCGCATGGATGTAATTTGGACGATCCCCTTTGGTCGGCACGTGTGTT
54840
-
- Query 124 ACTAGAAAATCCGGAACTAATTTATCAGGTTCATTCGGACTATTTTCGTGCTGGAGCGGA
183
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 54841 ACTAGAAAATCCGGAACTAATTTATCAGGTTCATTCGGACTATTTTCGTGCTGGAGCGGA
54900
-
- Query 184 CTGTGCCATAACAGCAAGCTATCAAGCTACTATTAGTGGTTTTTCCGCGCGTGGAATACA
243
- ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||
- Sbjct 54901 CTGTGCCATGACAGCAAGCTATCAAGCTACTATTAGTGGTTTTTCCGCACGTGGAATACA
54960
-
- Query 244 AGAACAGGAAGCTTTGGAATTAATTAAGAAAACGGTGTTACTTGCAAGAAGGGCAAGAGA
303
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 54961 AGAACAGGAAGCTTTGGAATTAATTAAGAAAACGGTGTTACTTGCAAGAAGGGCAAGAGA
55020
-
- Query 304 TGATTTTTGGAAGGAAAATACGCAAACGAATAGGCCTAAACCATTGGTTGTTGCATCAGT
363
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55021 TGATTTTTGGAAGGAAAATACGCAAACGAATAGGCCTAAACCATTGGTTGTTGCATCAGT
55080
-
- Query 364 TGGGCCGTACGGGGCTTACCTTGCAGATGGTTCAGAGTATGTAGGCAACTATGGTGTGAC
423
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55081 TGGGCCGTACGGGGCTTACCTTGCAGATGGTTCAGAGTATGTAGGCAACTATGGTGTGAC
55140
-
- Query 424 AGATAAAACATTAGCAGACTTTCACCGTTCGAGAATGTCAGCGTTAATCGAAGCAGGTGC
483
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||
- Sbjct 55141 AGATAAAACATTAGCAGACTTTCACCGTTCGAGAATGTCTGCGTTAATCGAAGCAGGTGC
55200
-
- Query 484 AGATCTATTGGCATTTGAAACGATCCCTTCCCTGCAAGAAGCAAGAGTATTAGATACATT
543
- |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||
- Sbjct 55201 AGATCTATTGGCATTTGAAACGATCCCTTCCCTGCAAGAAGCAAGAGTATTAGAAACATT
55260
-
- Query 544 ATTGCGTGAGTTTCCAGAAACATATGCTTGGCTTTCCTTTTCGCTAAAAAATGAGAAAGA
603
- ||||||||| ||||||| ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55261 ATTGCGTGAATTTCCAGCAACATATGCGTGGCTTTCCTTTTCGCTAAAAAATGAGAAAGA
55320
-
- Query 604 GATTAGTGAAGGTATGAAACTCGTGGAGTGTGCACGAGCTTTTGAGAAAAGTGAACAAAT
663
- |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||
- Sbjct 55321 GATTAGTGAAGGTATGAAACTCGTGGAGTGTGCACGAGTTTTTGAGAAAAGTGAACAAAT
55380
-
- Query 664 TGTAGCGATAGGCATCAATTGTGCGCCAGTAACCGTTGTGACTGGTGCAATCCAAGAGTT
723
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55381 TGTAGCGATAGGCATCAATTGTGCGCCAGTAACCGTTGTGACTGGTGCAATCCAAGAGTT
55440
-
- Query 724 GAGGGCAAACACCAAAAAACCGATTATTGTTTATCCAAACTCGGGTGAAACTTATAATCC
783
- |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||
- Sbjct 55441 GAGGGCAAACACCAAAAAACCGATTATTGTTTATCCAAACTCTGGTGAAACTTATAATCC
55500
-
- Query 784 AGAATCAAAAACATGGCATGGTCATGAACAATGTAACGCGTTGGATATTCAATCTGAAGA
843
- |||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55501 AGAAACAAAAACATGGCATGGTCATGAACAATGTAACGCGTTGGATATTCAATCTGAAGA
55560
-
- Query 844 ATGGTACCAAGCAGGTGCACGTTTAATAGGTGGATGCTGCAGAACGACACCTTATCACAT
903
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55561 ATGGTACCAAGCAGGTGCACGTTTAATAGGTGGATGCTGCAGAACGACACCTTATCACAT
55620
-
- Query 904 TGAGGAGATATCGAACAAGTGGCGTTCTTCCGAGTTTTTCTATTCGAACGAAGCAAAACA
963
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55621 TGAGGAGATATCGAACAAGTGGCGTTCTTCCGAGTTTTTCTATTCGAACGAAGCAAAACA
55680
-
- Query 964 GTAATGTAATGGATGATAATCTATCTTTGTGTGTATTTTCATGATTTTGCTTGTTCAGGA
1023
- ||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55681 GTAATGTAATGGATGATAATCTAACTTTGTGTGTATTTTCATGATTTTGCTTGTTCAGGA
55740
-
- Query 1024 ATCTACAGTTACGTCTATTGGCACAAAATGTCTTTTCAGAGACACAAATGTGGATGGTAG
1083
- ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55741 ATCTACAGTTACGTCTAGTGGCACAAAATGTCTTTTCAGAGACACAAATGTGGATGGTAG
55800
-
- Query 1084 CTTCGGGAATCCAGTGGACTTTTGGGTACCTTAGGTATGGAAAGGAATCAGGGAAAATAA
1143
- | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55801 CCTCGGGAATCCAGTGGACTTTTGGGTACCTTAGGTATGGAAAGGAATCAGGGAAAATAA
55860
-
- Query 1144 AAACCGCTAGTTTAATAGATATGGTAGACAACATGCTGAATCTTTTAATGAAGATGTAGT
1203
- ||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 55861 AAACCGCTAGTTTAATAGATATGGTAGACAACACGCTGAATCTTTTAATGAAGATGTAGT
55920
-
- Query 1204 TGATCCAATTGAAGGTGAAGGGGACCATTTATTCGTAATTGAAGTTAACGAAGAGGTTAA
1263
- |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
- Sbjct 55921 TGATCCAATTGAAGGTGAAGGGGACCATTTATTCGTAATTAAAGTTAACGAAGAGGTTAA
55980
-
- Query 1264 TTTAGTTATTCAAAAAATAGTTCAATAACTATATGAAAATTTGTTGTGGTAAAAATCCTT
1323
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
- Sbjct 55981 TTTAGTTATTCAAAAAATAGTTCAATAACTATATGAAAATTTGTTGT---A---------
56028
-
- Query 1324 GTTGTAGTAGTAAATGTGGTCATATTGTTGTAAAAAAGGATAGATGTAAACAGGTATACT
1383
- || ||| | || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 56029 GT---AGT-G-AA-TGTGGTCATATTGTTGTAAAAAAGGATAGATGTAAACAGGTATACT
56082
-
- Query 1384 CTCCTGTTCATCTATCCTTTCCTTTTTACCTTATAAAATGTGTGACATTATATTCAATCG
1443
- ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 56083 CTCCTGTTCATCTATCCTTTCCTTTTTACCTTATAAAATGTGTGACATTATATTCAATCG
56142
-
- Query 1444 CATAAATATAGGATTTCATTACTATTTCCTTGACTTTTA 1482
- |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
- Sbjct 56143 CATAAATATAGGATTTCATTACTATTTCCTTGACTTTTA 56181

Identificacin del gen que codifica para esta secuencia:

ref|YP_001642432.1| homocysteinemethyltransferase [Bacillus
weihenstephanensis KBAB4]
gb|ABY46457.1| homocysteine S-methyltransferase [Bacillus
weihenstephanensis
KBAB4]
Length=325

GENE ID: 5839777 mmuM | homocysteinemethyltransferase
[Bacillus weihenstephanensis KBAB4]

Score = 640 bits (1651), Expect = 0.0
Identities = 315/320 (98%), Positives = 318/320 (99%), Gaps = 0/320 (0%)
Frame = +2
Query 5 NPIDAILSQHSIMLLDGALATELEAHGCNLDDPLWSARVLLENPELIYQVHSDYFRAGAD
184
NPIDAILSQHSIMLLDGALATELEAHGCNLDDPLWSARVLLENPELIYQVHSDYFRAGAD
Sbjct 6 NPIDAILSQHSIMLLDGALATELEAHGCNLDDPLWSARVLLENPELIYQVHSDYFRAGAD
65

Query 185 CAITASYQATISGFSARGIQEQEALELIKKTVLLARRARDDFWKENTQTNRPKPLVVASV
364
CA+TASYQATISGFSARGIQEQEALELIKKTVLLARRARDDFWKENTQTNRPKPLVVASV
Sbjct 66 CAMTASYQATISGFSARGIQEQEALELIKKTVLLARRARDDFWKENTQTNRPKPLVVASV
125

Query 365 GPYGAYLADGSEYVGNYGVTDKTLADFHRSRMSALIEAGADLLAFETIPSLQEARVLDTL
544
GPYGAYLADGSEYVGNYGVTDKTLADFHRSRMSALIEAGADLLAFETIPSLQEARVL+TL
Sbjct 126 GPYGAYLADGSEYVGNYGVTDKTLADFHRSRMSALIEAGADLLAFETIPSLQEARVLETL
185

Query 545 LREFPETYAWLSFSLKNEKEISEGMKLVECARAFEKSEQIVAIGINCAPVTVVTGAIQEL
724
LREFP TYAWLSFSLKNEKEISEGMKLVECAR FEKSEQIVAIGINCAPVTVVTGAIQEL
Sbjct 186 LREFPATYAWLSFSLKNEKEISEGMKLVECARVFEKSEQIVAIGINCAPVTVVTGAIQEL
245

Query 725 RANTKKPIIVYPNSGETYNPESKTWHGHEQCNALDIQSEEWYQAGARLIGGCCRTTPYHI
904
RANTKKPIIVYPNSGETYNPE+KTWHGHEQCNALDIQSEEWYQAGARLIGGCCRTTPYHI
Sbjct 246 RANTKKPIIVYPNSGETYNPETKTWHGHEQCNALDIQSEEWYQAGARLIGGCCRTTPYHI
305

Query 905 EEISNKWRSSEFFYSNEAKQ 964
EEISNKWRSSEFFYSNEAKQ
Sbjct 306 EEISNKWRSSEFFYSNEAKQ 325


La secuencia que se copi, pertenece a un fragmento de un gen, ya que, como indica la
informacin adquirida anteriormente, se trata de una secuencia parecida a
Homocysteinemethyl Transferase (Bacillus weihenstephanensis KBAB4), de longitud de
325 aminocidos, de tal manera que en nuestra secuencia, del nucletido 5 al 964, tenemos
un fragmento del gen, que va del aminocido 1 al 325.


Ubica la secuencia aminoacdica de la protena que identificaste dentro de la secuencia
nucleotdica que analizaste.
- Busca en Google : Expasy, presiona translate (http://expasy.org/tools/dna.html)
- Copiar la secuencia y pegarla en el recuadro
- Cambia el parmetro: Output format, por: includes nucleotide sequence

- Presionar: Translate sequence
- Buscar, dentro de los 6 marcos que predice el expasy, la secuencia que corresponda con
la protena que predijo el Blast.
Ubicacin de la secuencia aminoacdica de la protena identificada dentro de la
secuencia nucleotdica tambin analizada anteriormente:

- 5'3' Frame 2
- aatcaacccaattgatgctattttatcccaacattccattatgcttcttgacggagcatta
- I N P I D A I L S Q H S I M L L D G A L
- gctacagaattggaggcgcatggatgtaatttggacgatcccctttggtcggcacgtgtg
- A T E L E A H G C N L D D P L W S A R V
- ttactagaaaatccggaactaatttatcaggttcattcggactattttcgtgctggagcg
- L L E N P E L I Y Q V H S D Y F R A G A
- gactgtgccataacagcaagctatcaagctactattagtggtttttccgcgcgtggaata
- D C A I T A S Y Q A T I S G F S A R G I
- caagaacaggaagctttggaattaattaagaaaacggtgttacttgcaagaagggcaaga
- Q E Q E A L E L I K K T V L L A R R A R
- gatgatttttggaaggaaaatacgcaaacgaataggcctaaaccattggttgttgcatca
- D D F W K E N T Q T N R P K P L V V A S
- gttgggccgtacggggcttaccttgcagatggttcagagtatgtaggcaactatggtgtg
- V G P Y G A Y L A D G S E Y V G N Y G V
- acagataaaacattagcagactttcaccgttcgagaatgtcagcgttaatcgaagcaggt
- T D K T L A D F H R S R M S A L I E A G
- gcagatctattggcatttgaaacgatcccttccctgcaagaagcaagagtattagataca
- A D L L A F E T I P S L Q E A R V L D T
- ttattgcgtgagtttccagaaacatatgcttggctttccttttcgctaaaaaatgagaaa
- L L R E F P E T Y A W L S F S L K N E K
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- T S F K R

- Eliminar de esta secuencia los aminocidos que el Blast no haya reconocido como parte
de esta protena, sombrear los nucletidos de un color y los aminocidos de otro.
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- acttcgtttaaaaga

Copiar la traduccin virtual, eliminar la secuencia de nucletidos y dejar
solamente la secuencia de aminocidos traducidos que correspondan a la
protena analizada:

I N P I D A I L S Q H S I M L L D G A L
A T E L E A H G C N L D D P L W S A R V
L L E N P E L I Y Q V H S D Y F R A G A
D C A I T A S Y Q A T I S G F S A R G I
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L R A N T K K P I I V Y P N S G E T Y N
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E W Y Q A G A R L I G G C C R T T P Y H
I E E I S N K W R S S E F F Y S N E A K
Q



- Contar palabras (320 aminocidos, en este caso)
- En la pgina del expasy correspondiente a la traduccin a protena, presionar en el cono
5'3' Frame 3 (o en el marco y en la direccin donde se lea correctamente el gen que ests
analizando, en este caso, corresponde este cono)

- Presionar en la primera letra que corresponde al fragmento que se desee analizar (en este
caso presionar I, que corresponde al inicio del fragmento INPI )En un recuadro
aparecer la secuencia de aminocidos que se analizar (checar que corresponda con el
fragmento que se desea comparar o analizar, y si hay letras de mas, eliminarlas, o
agregar las que falten).
- Presionar el cono Compute pI/Mw (Punto isoelctrico y peso molecular)
- Copiar con Control-Imprimir, pegar en la pgina de Word y ajustar el tamao o las
partes que se peguen:

Diseo de oligonucletidos:

- Instalar el programa DNASTAR en una computadora
- Abrir el programa Editseq
- Copiar la secuencia nucleotdica y pegarla en el recuadro
- Presionar file y Save as
- Guardar el archivo con un nombre identificable y en un lugar identificable (disco
extrable)
- Cerrar el programa Editseq
- Abrir el programa PrimerSelect
- Presionar file y Enter sequence
- Abrir el archivo
- Presionar done
- Presionar Conditions y Primer characteristics. Aparecern las caractersticas de
los primers que se disearn (longitud, Tm) Por lo regular son condiciones estndar,
con las cuales quedan bien diseados los primers.
- Presionar Locate y PCR primer pairs. Aparecern todas las opciones de primers
que se pueden disear dentro del fragmento que se abri.
- Seleccionar el par de primers que se ajusten a la posicin donde est el fragmento
que se ha estado delimitando con los programas Blast y Expasy.
- Presionar un juego de primers.
- Presionar dos veces el mismo juego de primers.
- Presionar Edit y Work on Upper primer
- Redirigir el Primer Directo, para que el diseo de este primer comience donde inicia
el fragmento desead. Ajustar el tamao del primer entre 17 y 25 bases. Entre las
indicaciones de este primer, es que tenga una Tm entre 55 y 60C. Al mover el
cursor sobre las flechas negras, se ajusta el tamao del fragmento como uno lo desee.
- Presionar el botn OK
- Presionar Edit y Work on Lower primer
- Redirigir el Primer Reverso. Ajustar el tamao del primer entre 20 y 25 bases. Entre
las indicaciones de este primer, es que tenga una Tm entre 55 y 60C, similar a la del
Primer directo. Al mover el cursor sobre las flechas negras, se ajusta el tamao del
fragmento como uno lo desee.
- Presionar el botn OK o cancel, si el diseo no fue el adecuado.
- Presionar report y amplification summary para ver el reporte del resultado.
- Presionar edit y copy
- Pegar en el archivo de Word.

Upper Primer (Primer directo):













Lower Primer (Primer reverso)








Analizar la informacin contenida en este recuadro:
Fragmento amplificado: productlength= 1068pb
Primer directo: 5 AGGTTCATTCGGACTATTTTCGTG 3 (24 nt, Tm 55.4 C)
Primer reverso: 5 CTTCAATTGGATCAACTACATCT 3 (23 nt, Tm 47.3 C)


Sacar la secuencia complementaria del primer reverso, para ubicarlo dentro del DNA
analizado:
Secuencia complementaria del primer reverso: AGATGTAGTTGATCCAATTGAAG
(esta es la secuencia que se ubica dentro del DNA analizado)


Ubicar:

AGGTTCATTCGGACTATTTTCGTG
AGATGTAGTTGATCCAAGAAG

5'3' Frame 2
aatcaacccaattgatgctattttatcccaacattccattatgcttcttgacggagcatta
I N P I D A I L S Q H S I M L L D G A L
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D C A I T A S Y Q A T I S G F S A R G I
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D D F W K E N T Q T N R P K P L V V A S
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cgcataaatataggatttcattactatttccttgacttttattgaactacccccactttc
acttcgtttaaaaga


Seleccionar nuevamente la secuencia, y traducir a protena en el Expasy, para conocer
realmente la protena que se obtendr a partir del juego de Primers diseado:
aggttcattcggactattttcgtgctggagcg
gactgtgccataacagcaagctatcaagctactattagtggtttttccgcgcgtggaata
caagaacaggaagctttggaattaattaagaaaacggtgttacttgcaagaagggcaaga
gatgatttttggaaggaaaatacgcaaacgaataggcctaaaccattggttgttgcatca
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gttgatccaattgaag

Restringida por Hind III (AAGCTT) y PstI (CTGCAG).

DISCUSIO N
Se analiz los resultados obtenidos y se compar con la informacin que se proporciona en
la literatura acerca de las caractersticas que debe cumplir un buen par de Primers para que
se pueda amplificar la regin seleccionada del gen de inters. Para elegir los primers ms
adecuados, se debe de considerar diferentes factores que son importantes para tener el
resultado esperado, por ejemplo la temperatura entre los primers directo y reverso no debe
de tener una diferencia de ms de 3C entre ellos (Voet, 2006), adems se debe tomar en
cuenta el porcentaje de G y C el cual se recomienda que este entre 50-60% (Voet, 2006)
pero el Primer diseado tiene 40.7 % por lo que sera un Primer de mala eleccin.
La longitud del par de primers es de 1068 pb por lo que no se pueden considerar como
primers ptimos. Con el par de oligonucletidos diseados, se amplifica un fragmento del
gen, trunco en la regin 5, en donde al traducirse a protenas, le faltan los nucletidos
correspondientes a los primeros 34 aminocidos cercanos al extremo amino. Tambin se
amplificara un fragmento de ADN ubicado en el extremo 3, el cual no codificara para la
protena. Si se deseara amplificar un fragmento de ADN que codificara slo a la regin
estructural de la protena, el oligonucletido reverso tendra que redisearse y ser compatible
con el oligonucletido directo para que slo se amplifique dicha regin.

Conclusio n

Se utiliz la base de datos del NCBI para realizar un anlisis bioinformtico de la secuencia
del gen de Bacillus weihenstephanensis en la cual se hizo uso de la herramienta BLAST. Se
identific la regin del gen a replicar con ExPASy adems de obtener el punto isoelctrico y
el peso molecular con esta herramienta y se desarrollaron juegos de Primers en DNASTAR
para poder amplificar la secuencia de inters lo cual es de gran importancia para la tcnica
de PCR ya que se clona el fragmento seleccionado para introducir el vector propuesto por el
programa y de esa manera realizar los mapas de restriccin.

Cuestionario

1.- Cules son las ramas de la Ciencia en las que participa la Bioinformtica?

- Biomedicina
- Biologa molecular
- Gentica
- Biotecnologa
- Gentica molecular
(Attwood, 2002)

2.- Para qu sirve el anlisis Bioinformtico de una secuencia de ADN?

Sirve para observar similitudes estructurales y la diferencia entre diversas secuencias
biolgicas. Con esto se determina si existen secuencias similares entre diferentes organismos
para que se pueda concluir que son secuencias homlogas. (Attwood, 2002).

3.- Menciona metodologas de Biologa Molecular que complementaran los resultados
obtenidos en un anlisis Bioinformtico en el estudio de un ADN, ARN o protena.

Pueden utilizarse marcadores de ADN los cuales nos ayudan a detectar polimorfismo en el
ADN nuclear, al igual que marcadores usados para calcular el tamao efectivo de una
poblacin lo cuales pueden basarse en genotipos para los marcadores ligados, pero tambin
pueden usarse herramientas moleculares para el estudio de la variacin funcional con
enfoques basados en la posicin. (Lahoz, 2010).




Referencias

Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de
Alimentos. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Recuperado de:
http://gmo-
crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf.
24/09/14

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