TAREA 1: FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGIA

TAREA 2. CURVA DE CLIBRACIN Y LEY DE LAMBERT Y BEER

Dnae Jurez Lpez


5 DE SEPTIEMBRE DE 2014
PROCESOS BIOTECOLOGICOS
Instituto Tecnolgico de Celaya
Dnae Jurez Lpez
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I. FUNDAMENTOS DE LA TINCIN DE GRAM
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en
Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe
su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884.
Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color
morado, y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o
grosella.
METODOLOGA
Recoger muestras.
Hacer el extendido con un palillo de madera.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces
aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto.
Todas las clulas gram positivas se tien de color azul-prpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos o 5 segn la concentracin del
reactivo (parte crtica de la coloracin).
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1 minuto.
Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de
inmersin.
EXPLICACIN
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram
positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto
formado por I
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(yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales
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estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal
violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I
2
entra en las
clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que
en la misma es soluble el complejo I
2
/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que
las Gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una
tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del
protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern
rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884.
En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los
colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se
escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que
se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con
alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin
de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta
inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un
decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer
tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que
pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues,
en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos.
Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram.
Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de
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genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-
rosanilina.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia
viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las
clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos
se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante.
La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y
el pH del medio, y quiz por otras causas.
TEORAS
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo.
Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una
posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble
en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los
microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca
no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los lpidos de la pared (ms
abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que
permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta
teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn
(1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las
bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad
de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en
soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las
bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece
en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen como
cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los
bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce
en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una protena, ese
punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o
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escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los
microorganismos grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los
microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las
siguientes conclusiones:
Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la
acidez.
Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la
alcalinidad.
Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse
gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden
hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia
a retener cualquier colorante.
Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples,
sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas
o grasas.
La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la
obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una
proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por
los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la
coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la
sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un
microorganismo por los colorantes bsicos.
El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre
todo, de los microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios
que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida
en el curso del desarrollo.
Gianni (1952) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B.
anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres
horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para
invertir la reaccin. Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible
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existencia de una capa exterior alrededor de un ncleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy,
han comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se forme una
combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las protenas de
la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos
retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter qumico de los
materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes grampositivos desintegrados
pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram.
La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al
violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante
formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos con una
difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta
cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin grampositiva
consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de una cantidad apreciable
de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de
los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sera
prcticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecern teidos
despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie
externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el complejo formado
despus del tratamiento con yodo.
Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el
mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la
permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de
yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo
constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa
coloracin.

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FUNDAMENTOS DE DIFERENCIACIN DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y
ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano
(tambin conocido como murena)
Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a
la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a
una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena,
fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere
su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la
membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del
solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide
que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-
violeta
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II. ACTIVIDAD DEL AGUA
Definicin: Los microorganismos necesitan la presencia de agua, en una forma disponible,
para crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas. La mejor forma de medir la
disponibilidad de agua es mediante la actividad de agua (a
w
). La a
w
de un alimento se
puede reducir aumentando la concentracin de solutos en la fase acuosa de los alimentos
mediante la extraccin del agua o mediante la adicin de solutos. Algunas molculas del
agua se orientan en torno a las molculas del soluto y otras quedan absorbidas por los
componentes insolubles de los alimentos. En ambos casos, el agua queda en una forma
menos reactiva.
Varios mtodos de conservacin utilizan estos conceptos. La deshidratacin es un
mtodo de conservacin de los alimentos basado en la reduccin de la aw (lo que se
consigue eliminando el agua de los productos). Tambin el agregado de solutos
desciende la aw lo cual se da durante el curado y salado, as como en el almbar y otros
alimentos azucarados.
La a
w
de un alimento o solucin se define como la relacin entre la presin de vapor del
agua del alimento (p) y la del agua pura (po) a la misma temperatura
A medida que una solucin se concentra, la presin de vapor disminuye y la a
w
desciende
a partir de un valor mximo de 1 para el agua pura (en ausencia de capilares o fuerzas de
adsorcin). La a
w
est relacionada con el punto de congelacin y con el de ebullicin as
como con la humedad relativa en equilibrio (HRE) y la presin osmtica.
RELACIN ENTRE LA ACTIVIDAD DE AGUA Y LA HUMEDAD RELATIVA EN EQUILIBRIO
(HRE):
La HRE se refiere estrictamente a la atmsfera en equilibrio con una solucin o alimento y
constituye una expresin menos apropiada que la a
w
como forma de medir el agua
disponible.
La HRE, como la a
w
, es la relacin entre la presin de vapor de la solucin y la del agua
pura pero expresadas en porcentaje.
RELACIN ENTRE LA ACTIVIDAD DE AGUA Y LA PRESIN OSMTICA:
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La presin osmtica * est relacionada con la a
w
a travs de la expresin
donde R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, loge a
w
el logaritmo
natural de la a
w
y V el volumen molar parcial del agua. El uso de la presin osmtica
presupone la presencia de una membrana con unas caractersticas de permeabilidad
adecuadas.
HUMEDAD
Las bacterias necesitan agua en el medio ambiente para florecer. La humedad es esencial
para llevar nutrientes dentro y fuera de la clula a travs de la smosis. Para multiplicarse
rpidamente, las bacterias deben estar en un entorno que apoye sus necesidades de
agua (actividad de agua). La actividad del agua es el papel del agua en soluciones de
sales y azcares. La mayora de las bacterias se desarrollan en ambientes con actividad
de agua que oscila entre 0,7 y 1,0. La actividad de agua, por ejemplo, tiene un valor de
1,0 en agua pura. Cuantos ms disolventes haya en el agua, ms baja es la actividad de
agua.
III. PROCESO DE CONJUGACION BACTERIANA
Los mecanismos de trasferencia bacteriana pueden esquematizar en tres:
a) Conjugacin
b) Transformacin.
c) Transduccin.
La conjugacin bacteriana (apareamiento), es un mecanismo de transferencia gentica
que implica el contacto entre clulas. La conjugacin es un mecanismo codificado por un
plsmido. Estos plsmidos conjugativos, usan este mecanismo para transferir copias de
s mismos a nuevas clulas hospedadoras. Por tanto el proceso de conjugacin implica
una clula donadora, que contiene el plsmido conjugativo, y una clula receptora, que
no lo contiene. Los mecanismos de transferencia conjugativa pueden diferir en funcin
del plsmido implicado, pero la mayora de los plsmidos de las bacterias gramnegativos
utilizan un mecanismo similar al que usa el plsmido F.
EL PLSMIDO F
El plsmido F (fertilidad) es una molcula de DNA circular de 99.159 bp. Una regin el
plsmido contiene genes que regulan la replicacin del DNA. Tambin contiene algunos
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elementos transponibles, que permiten al plsmido integrarse en el cromosoma del
hospedador. Adems el plsmido F tiene una regin larga de DNA, la regin tra, que
Contiene genes que codifican las funciones de transferencia.
La conjuncin bacteriana se da a travs de pelos, pilis o fimbrias de conjugacin. Se
cree que tda la conjugacin e las bacterias gramnegativas depende del apareamiento de
las clulas a travs de los pelos. El pelo forma un contacto especfico con un receptor de
la clula receptora despus se retrae desensamblando sus subunidades. Esto atrae
entre s a las dos clulas. Despus de este proceso las clulas donadora y receptora
siguen en contacto mediante las protenas de unin localizadas en la membrana externa
de cada clula. Entonces se transfiere el DNA de la clula donadora a la receptora a
travs de esta conexin conjugativa
MECANISMO DE TRANSFERENCIA DEL DNA DURANTE LA CONJUGACIN.
La sntesis de DNA es necesaria para la transferencia de DNA por conjugacin. Este
DNA se sintetiza por replicacin de crculo rodante, mecanismo que tambin utilizan
algunos virus, la transferencia del DNA es desencadenada por el contacto entre las
clulas, en el momento en que una cadena de DNA circular del plsmido es cortada y
transferida al receptor. La enzima cortadora, necesaria para iniciar el proceso se llama
TraI, y est codificada por el operon tra del plsmido F
IV. LEY DE LAMBERT BEER
La Ley Lambert Beer es un medio matemtico de expresar cmo la materia absorbe la
luz. Esta ley afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres
fenmenos fsicos:
1. La cantidad de material de absorcin en su trayectoria (concentracin)
2. La distancia que la luz debe atravesar a travs de la muestra (distancia de la
trayectoria ptica)
3. La probabilidad de que el fotn de esa amplitud particular de onda sea absorbido
por el material (absorbencia o coeficiente de extincin)
Esta relacin puede ser expresada como:
A = dc
Donde
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A = Absorbencia
= Coeficiente molar de extincin
d = Distancia en cm
c = Concentracin molar

TRANSMITANCIA
A medida que un haz de luz atraviesa un medio absorbente, la cantidad de luz absorbida
en cualquier volumen es proporcional a la intensidad de luz incidente multiplicado por el
coeficiente de absorcin. Consecuentemente, la intensidad de un haz incidente decae
exponencialmente a medida que pasa a travs del absorbente. Esta relacin cuando se
expresa como Ley de Lambert es:
T = 10
-cd
o T = 10
-A

Donde

T = Transmitancia
= Coeficiente molar de extincin
c = Concentracin molar del absorbente
d = Distancia en cm

En un enfoque simplificado, la transmitancia puede ser expresada como la intensidad de
la radiacin incidente, Io, que divide a la luz emergente de la muestra, I. Se refiere a la
relacin I/Io como transmitancia o sencillamente T.
ABSORCIN
La transmitancia puede ser trazada en relacin a la concentracin, pero la relacin no es
lineal. El logaritmo negativo en base 10 de la transmitancia s es, sin embargo, lineal con
la concentracin.
De esta manera, la absorcin es medida como:
A = -log
10
(
I
/
Io
) o A = -log
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(T)

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V. FUNCIN LOGSTICA


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CURVA LOGSTICA.
La funcin logstica, curva logstica o curva en forma de S es una funcin matemtica que
aparece en diversos modelos de crecimiento de poblaciones, propagacin de
enfermedades epidmicas y difusin en redes sociales. Dicha funcin constituye un
refinamiento del modelo exponencial para el crecimiento de una magnitud. Modela la
funcin sigmoidea de crecimiento de un conjunto P.
El estudio inicial de crecimiento es aproximadamente exponencial; al cabo de un tiempo,
aparece la competencia entre algunos miembros de P por algn recurso crtico K ("cuello
de botella") y la tasa de crecimiento disminuye; finalmente, en la madurez, el crecimiento
se detiene.
La funcin logstica simple se define mediante la expresin matemtica:

donde la variable P puede ser considerada o denotada como poblacin, donde e es la
constante de Euler y la variable t puede ser considerada el tiempo.
1
Para valores de t en
el rango de los nmeros reales desde a +, la curva S se puede obtener. En la
prctica, dada la naturaleza de la funcin exponencial, e
t
, es suficiente con computar t
para un pequeo rango de nmeros reales como pueden ser [6, +6].
Podemos construir una grfica para observar cmo vara la absorbancia de una especie
en solucin a una longitud de onda dada en funcin de su concentracin. A esta grfica
se le llama curva de calibracin o curva estndar y para construirla se mide la
absorbancia de varias soluciones de concentracin conocida, llamadas disoluciones
estndar. Es una lnea recta y de acuerdo con la ecuacin 3 la pendiente es b.
Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentracin de la sustancia en
cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Lambert-Beer. La
cuantificacin de la especie debe realizarse a la longitud de mxima absorcin.
La ley de Lambert-Beer para cuantificar compuestos se utiliza de manera rutinaria en el
laboratorio de bioqumica. Una de sus aplicaciones principales es para determinar la
concentracin de protenas en una solucin.
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VI. CURVA DE CALIBRACIN

1. PESO HMEDO
Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin
de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes
de muestra. La principal desventajas que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede
ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede
contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de
lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello
se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en
el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
PESO SECO
La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de
peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o
slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido bien por
centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de
estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo microorganismos activos sino
microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica
adsorbida. Adems, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles.
Los mtodos gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco
reproducibles. A la vez este mtodo este mtodo los componentes voltiles de las
clulas pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la
muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente
tiene humedad relativa alta.
3. ABSORCIN
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de
la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La
nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide
la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin.
Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de
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dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para
monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero
pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco
(contenido macromolecular).
TURBIDIMETRA
La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una
suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales
han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias,
independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de
concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao
celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes
por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las
clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de
microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin
bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo,
slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero
de microorganismos totales o con UFC.

Figura 1. Absorbancia en funcin del Peso Seco
K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso
seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la
absorbancia (1/W
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Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco
(g/ml-mg/ml).
La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones
diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3,
ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el
inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de
pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin