O documento discute técnicas de transformação genética em plantas, incluindo Agrobacterium, bombardeamento e eletroporação. Essas técnicas podem ser usadas para introduzir genes de interesse em plantas e permitir pesquisas básicas sobre a expressão gênica ou desenvolvimento de cultivares transgênicas com características desejadas, como resistência a pragas. O método de Agrobacterium envolve a transferência do gene de interesse através de uma bactéria, enquanto bombardeamento e elet
O documento discute técnicas de transformação genética em plantas, incluindo Agrobacterium, bombardeamento e eletroporação. Essas técnicas podem ser usadas para introduzir genes de interesse em plantas e permitir pesquisas básicas sobre a expressão gênica ou desenvolvimento de cultivares transgênicas com características desejadas, como resistência a pragas. O método de Agrobacterium envolve a transferência do gene de interesse através de uma bactéria, enquanto bombardeamento e elet
O documento discute técnicas de transformação genética em plantas, incluindo Agrobacterium, bombardeamento e eletroporação. Essas técnicas podem ser usadas para introduzir genes de interesse em plantas e permitir pesquisas básicas sobre a expressão gênica ou desenvolvimento de cultivares transgênicas com características desejadas, como resistência a pragas. O método de Agrobacterium envolve a transferência do gene de interesse através de uma bactéria, enquanto bombardeamento e elet
Transformao gentica e suas aplicaes em pesquisa e biotecnologia Profa. Dra. Magdalena Rossi Que um organismo geneticamente modificado (OGM)? So aqueles que recebem um ou mais genes de outro organismo e passam assim a expressar uma nova caracterstica de interesse. OGMs= melhoramento gentico clssico. -cruzamentos naturais ou forados com seleo humana (milho/teosinte?) -introgresso de genes de espcies selvagens em S. lycopersicum. OGMs= to antigos quanto a agricultura (mas no so produzidos por transformao). DNA Genes de interesse: existem na natureza, no so inventados nem sintetizados. Clula: animal, vegetal, bactria, etc Que um transgnico? Melhoramento gentico: Caracterstica de interesse Planta de interesse Estabilidade da informao transferida Gene de interesse Planta de interesse Estabilidade da informao transferida Ambos dependemda seleo das cultivares para uso comercial emetapassubsequentes. CLSSICO TRANSFORMAO DIRETA As transgnicas e o melhoramento gentico Tcnicasde transformao gentica de plantas: Aplicaesna pesquisa bsica e aplicada AplicaesBiotecnolgicas(produtos transgnicos) Tcnicasde transformao gentica de plantas: Agrobacterium(mtodo biolgico) Bombardeamento (mtodo fsico) Eletroporao )mtodo fsico) Aplicaesna pesquisa bsica e aplicada AplicaesBiotecnolgicas(produtos transgnicos) Agrobacterium: Angiospermas (eudicotiledneas, mono) e Gimnospermas) Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium) A. tumefaciens (galha-da-coroa) A. rhizogenes A. tumefaciens Histrico 1907; descreve-se a doena 1930; caracteriza-se o agente: Agrobacterium 1970; constata-se a correlao entre a doena e um plasmdeo 1979; transferncia de um fragmento de DNA da bactria para a clula vegetal A. tumefaciens pTi tumor: tecido mosaico! Porque forma o tumor? A. tumefaciens A. rhizogenes pRi raizesso clones celulares porque surgem raizes? Uma interao peculiar ... Agrobacterium - Transfere um fragmento de DNA, o T-DNA, do plasmdio Ti no genoma vegetal. - Insero em posio aleatria dentro do genoma. - Induz a proliferao celular originando tumores ou razes a partir da clula transformada. - As clulas vegetais transformadas sintetizam substncias chamadas opinas que so a fonte de C e N das bactrias. Organizao de pTi ou pRi sntese de opinas e oncogenes (sntese de citocininas, auxinas ou sensibilidade para auxinas) (conjugao entre agrobactrias do solo) (origem de replicao e regio de incompatibilidade) (catabolismo de opinas) (transferncia do T-DNA: genes de virulncia) 200Kb Borda esquerda Borda direita Regio transferida PLANT CELL AGROBACTERIUM Phenolics Produced by Wounded Plant cell VirA VirG Phenolics detected by the VirA/VirGtwo component sensor system. VIP1 associates with the complex to target it to the nucleus VIP2 associates the complex to transcriptionally active DNA T-DNA integrates into plant DNA and gall production is initiated. Gall Formation! Vir Gene expression induced Bacterial Plasmid Formation of T-Pilus(VirB and VirD4 T-DNA Vir D1 & D2 cut T-DNA at right and left borders and starts T-DNA synthesis (VirC) VirD2 attaches to exposed 5 I end Formation of T-complex VirE2 Transferncia do T-DNA Transformao via Agrobacterium -Obteno da construo contendo o gene de interesse e um marcador de seleo. -Introduo da construo na bactria. -Introduo da construo na clula vegetal pela bactria. -Desenvolver a tecnologia para a regenerao da espcie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos). Organizao de pTi ou pRi GENE DE I NTERESSE + MARCADOR DE SELEO (conjugao entre agrobactrias do solo) (origem de replicao e regio de incompatibilidade) (catabolismo de opinas) (transferncia do T-DNA: genes de virulncia) 200Kb Borda esquerda Borda direita Regio transferida Transformao de explantes T-DNA: Gene de interesse + Gene de resistncia para seleo de transformantes SEM GENES DE OPINAS E SEM ONCOGENES Clulas 3-4 dias em cultura liquido 4 ml Bactrias de 1-2 dias em cultura 50 100 ul 3 dias de co- cultivo Replaqueamento Replaqueamento em em meio meio seletivo seletivo Meio + antibiticos para seleo Aps 7 dias 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Transformao de clulas Replaqueamento Replaqueamento em em meio meio seletivo seletivo Meio MS30 slido Carb + Vanc + Higro 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 U3A3MR::GUS U3A2MR::GUS Controle - Transformao de clulase seleo Clulas crescendo em meio seletivo Clulas que no cresceram em meio seletivo U3B::GUS O processo de regenerao: Seleo de linhagensportadorasdo gene de interesse. Transformao via bombardeamento (canho gnico) -Obteno da construo contendo o gene de interesse e um marcador de seleo. -Introduo da construo de interesse por um mecanismo fsico. -Desenvolver a tecnologia para a regenerao da espcie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos). Gene de interesse Prom VETOR Bombardeador Partculas de tungstnio carregando DNA Transformao gentica de plantas: bombardeamento Gene de i nt er esse + Gene de r esi st nci a par a sel eo de t r ansf or mant es Bombardment Diferna com vetor de Agro! Transformao via eletroporao -Obteno da construo contendo o gene de interesse e um marcador de seleo. -Introduo da construo de interesse por um mtodo fsico. -Desenvolver a tecnologia para a regenerao da espcie vegetal a ser transformada (cultura de tecidos). D E F Transformao gentica de plantas: eletroporao Gene de i nt er esse + Gene de r esi st nci a par a sel eo de t r ansf or mant es Gene de interesse Prom VETOR E Tcnicasde transformao gentica de plantas: Agrobacterium(mtodo biolgico) Bombardeamento (mtodo fsico) Eletroporao )mtodo fsico) Aplicaesna pesquisa bsica e aplicada Conhecero padro temporal de expresso de um gene (?) Conhecero padro espacial de expresso de um gene (?) Conhecera resposta de um gene a diferentesestmulos Estudarosgenes envolvidosnosdiferentesprocessos fisiolgicos(ex. resistncia a patgenos, florao, etc) AplicaesBiotecnolgicas(produtostransgnicos)