TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

MAKALAH

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas
Mata Kuliah Bioteknologi





Oleh :
Erlin Fujianti 122154042
Wini Agustin 122154052
Neng Revi Rismayanti 122154061




PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS SILIWANGI
TASIKMALAYA
2014
KATA PENGANTAR

Puji serta syukur penulis panjatkan kehadirat Allah swt. karena berkat
rahmat-Nya yang telah memberi nikmat kesehatan dan kesempatan sehingga
penulis mampu menyelesaikan makalah berjudul Teknologi DNA Rekombinan.
Makalah ini disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Bioteknologi.
Dengan berkembangnya ilmu pengetahuan diketahui bahwa setiap
makhluk hidup menggunakan DNA dan RNA untuk menyimpan dan metransfer
informasi genetiknya. Sehingga para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya
materi gen ini dimanipulasi sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat
genetiknya sesuai dengan yang diinginkan. Kemudian berkembang teknologi baru
dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi
DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik.
Penulis menyadari bahwa selama penulisan makalah ini banyak mendapat
bantuan dari berbagai pihak. Oleh sebab itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada :
1. Egi Nuryadin, S.Pd., selaku dosen mata kuliah Bioteknologi yang telah
membantu selama menyusun makalah ini;
2. rekan-rekan kelas yang telah memotivasi penulis untuk menyelesaikan
penyusunan makalah ini;
3. semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.
Semoga Allah swt. memberikan balasan yang berlipat ganda. Makalah ini
bukanlah karya yang sempurna karena masih memiliki banyak kekurangan, baik
dalam hal isi maupun sistematika dan teknik penulisannya. Oleh sebab itu, penulis
sangat mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun demi
kesempurnaan makalah ini. Semoga makalah ini bisa membarikan manfaaat bagi
penulis dan bagi pembaca. Amin.

Tasikmalaya, 20 September 2014 Penulis


BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah
Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan banyak ditemukan
penemuan-penemuan baru salah satunya tentang biologi molekular. Setelah
banyak penelitian diketahui bahwa setiap makhluk hidup menggunakan DNA
dan RNA untuk menyimpan dan metransfer informasi genetiknya. Sehingga
para ilmuwan berpikir mengenai bisa tidaknya materi gen ini dimanipulasi
sehingga bisa didapatkan DNA dan RNA yang sifat genetiknya sesuai dengan
yang kita inginkan.
Pada awal tahun tujuh puluhan, Paul Berg berhasil menyambungkan
molekul DNA secara in vitro, maka kemudian berkembang teknologi baru
dalam perubahan sifat-sifat genetik suatu jasad yang dikenal dengan teknologi
DNA rekombinan atau disebut sebagai rekayasa genetik. Teknologi ini pada
dasarnya adalah teknik menyambungkan molekul-molekul DNA secara in vitro
sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan sesuai dengan yang diharapkan.
Teknologi ini memungkinkan diperolehnya suatu produk dengan sifat
tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi
secara konvensional.
Berdasarkan uraian latar belakang di atas, maka perlu diakukan
penyusunan makalah terkait dengan teknologi DNA rekombinan untuk
mengetahui lebih jelas mengenai teknologi DNA rekombinan tersebut serta
manfaat yang diperoleh dari aplikasi teknologi tersebut bagi kehidupan
manusia.






B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah diatas, penulis merumuskan
rumusan masalah sebgai berikut.
1. Bagaimana teknik isolasi DNA ?
2. Bagaimana isolasi mRNA dan pembuatan cDNA ?
3. Bagaimana pembuatan gen sintetik ?
4. Bagaimana amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR ?
5. Bagaimana pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi ?
6. Bagaimana penyambungan DNA (ligasi DNA) ?

C. Tujuan Makalah
Sejalan dengan rumusan masalah di atas, makalah ini disusun dengan
tujuan untuk mengetahui :
1. Teknik isolasi DNA;
2. isolasi mRNA dan pembuatan cDNA;
3. pembuatan gen sintetik;
4. amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR;
5. pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi; dan
6. penyambungan DNA (ligasi DNA).

D. Kegunaan Makalah
Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik seara
teoritis maupun secara praktis. Secara teoritis makalah ini berguna sebagai
pengembangan konsep teknologi DNA rekombinan. Secara praktis makalah ini
bermanfaat bagi :
1. penulis, sebagai wahana penambah pengetahuan dan konsep teknologi
DNA rekombinan;
2. pembaca, sebagai media informasi tentang manfaat teknologi DNA
rekombinan.


E. Prosedur Makalah
Makalah ini disusun dengan menggunakan pendekatan kualitatif.
Metode yang digunakan adalah metode deskriptif. Melalui metode ini penulis
akan menguraikan permasalahan yang dibahas secara jelas dan konprehensif.
Data teoritis dalam makalah ini dikumpulkan dengan menggunakan teknik
studi pustaka, artinya penulis mengambil data melalui kegiatan membaca
berbagai literatur yang relewan dengan tema makalh. Data tersebut diolah
dengan teknik analisis isi melalui kegiatan mengeksposisikan data serta
mengaplikasikan data tersebut dalam konteks tema makalah.






















BAB II
PEMBAHASAN

A. Teknik isolasi DNA
B. Isolasi mRNA dan pembuatan cDNA
C. Pembuatan gen sintetik
Suatu gen yang tersusun atas rangkaian nukleotida juga dapat diperoleh
denga melakukan sintesis kimia sehingga diperoleh gen sintetik. Sekarang telah
banyak metode sintesis nukleotida, baik secara otomatis maupun semi-
otomatis. Meskipun demikian, gen-gen dengan ukuran besar tidak selalu
mudah disintesis sehingga seringkali harus dilakukan sintesis secara bertahap.
Hasil sintesis gen tersebut selanjutnya harus dicek kembali urutan
nukleotidanya dengan teknik penentuan urutan DNA (DNA sequencing).
Dengan metode sintesis kimiawi maka dimungkinkan untuk membuat suatu
gen yang sama sekali baru yang tidak pernah ada di alam. Meskipun
demikian, belum tentu gen baru tersebut dapat diekspresikan menjadi suatu
rangkaian asam amino suatu protein yang fungsional.
Pada tahun 1921, pasien diabetes mellitus yang mengalami peningkatan
kadar gula darah disebabkan gangguan produksi insulin, telah diterapi dengan
menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas hewan.
Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun
komposisinya sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh
pasien menghasilkan antibodi terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha
menetralkan dan mengakibatkan respon inflamasi pada tempat injeksi.
Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk
membuat Humulin dengan memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang
cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk memproduksi insulin yang secara kimia
identik dan dapat secara alami diproduksi.



D. Amplifikasi DNA dan teknik teknik PCR
Kemajuan teknologi telah memungkinkan para ilmuan untuk meniru
urutan nukleotida suatu gen dengan cara melakukan amplifikasi DNA dengan
teknis reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, atau PCR).
Amplifikasi DNA dilakukan secara in vitro (di dalam tabung) dengan
menggunakan :
1. Enzim DNA polimerase,
2. dNTP (dinukleatida triphosphat),
3. oligonukleatida primer,
4. Molekul DNA cetakan (DNA template)
Enzime DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi
polimerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. Dalam teknik PCR, biasanya
digunakan enzim DNA polimerase yang berasal dari bakteri termotoleran yang
berasal dari laut, yaitu Thermus aquaticus, sehingga enzimnya disebut Taq
DNA polymerase. Enzim ini mempunyai kelebihan dibanding dengan enzim
Dna polimerase yang lain karena ketahanannya terhadap suhu sangat tinggi
mencapai suhu 95 - 100C. Suhu setinggi ini diperlukan sebab untuk dapat
menyalin urutan basa DNAcetakan dalam metode PCR, maka DNA cetakan
harus didenaturasi (dipisahkan ikatan antar untaiannya) dengan perlakuan
panas. Sekarang telah banyak enzim DNA polimerase termotoleran lain yang
dikembangkan untuk PCR, misalnya Tth DNA polymerase, dan Pwo DNA
polymerase.
Molekul dNTP (yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP) diperlukan untuk
teknik PCR sebagai bahan dasar untuk membuat untaian DNA karena molekul
DNA disusun oleh keempat nukleotida tersebut.
Oligonukleotida primer adalah molekul nukleotida berukuran pendek
(sekitar 10 30 basa nukleotida) yang diperlukan dalam mengawali proses
sintesis DNA. Perlu diketahui bahwa proses sintesis DNA, baik secara in vivo
(di dalam sel) maupun secara in vitro (di luar sel) memerlukan molekul primer.
Urutan basa nukleotida pada primer ditentukan agar menempel (komplementer)
pada bagian molekul DNA cetakan yang akan disalin atau diamplifikasi.
Molekul primer dapat dibuat dengan cara sintesis kimiawi.
Molekul DNA cetakan adalah molekul DNA yang urutan nukleotidanya
akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel dan selanjutnya digunakan sebagai
cetakan yang akan dibaca oleh enzim DNA polimerase untuk membuat salinan
urutan nukleotida.
PCR silakukan dengan mencampurkan empat komponen tersebut dalam
tabung Eppendorf kemudian dimasukan ke dalam alat thermocycler. Volume
total campuran reaksi diperlukan biasanya berkisar antara 25 100 l.
Thermocycler adalah alat yang dapat diatur untuk membuat suatu siklus
perubahan suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi DNA. Mesin PCR
dilengkapi dengan program komputer yang mengatur secara otomatis pada
setiap siklus. Pertama kali suatu alat diatur sehingga mencapai 95 - 100C
selama beberapa menit (biasanya sekitar 5 menit). Pada saat ini, molekul DNA
cetakan mengalami denaturasi sehingga dua untaiannya terpisah. Pemisahan
untaian ini diperlukan agar oligonukleat primer dapat menempel, karena primer
tidak akan dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam bentuk
untaian ganda (double stranded).
Setelah beberapa menit pada suhu denaturasi, suhu alat diturunkan
sehingga mencapai suhu yang sesuai untuk penempelan primer (primer
annealing) pada DNA cetakan. Biasanya suhu diperlukan sekitar 50 - 60C,
tetapi suhu yang tetap harus ditentukan secara empiris tergantung pada basa
nukleotida primer yang digunakan. Pada suhu yang tepat, molekul primer akan
menempel pada daerah DNA yang komplementer. Sebagai contoh, jika urutan
nukleotida primer adalah GATCTTCG, maka primer tersebut akan menempel
pada daerah DNA cetakan yang mempunyai urutan CTAGAAGC. Molekul
primer yang menempel tersebut berfungsi sebagai molekul awal dalam proses
polimerisasi DNA. Nukleotida-nukleotida baru akan ditempelkan di ujung
primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida pada DNA cetakan.
Proses penempelan primer biasanya memerlukan waktu beberapa menit
(sekitar 2-3 menit), selanjutnya suhu alat dinaikan ke suhu yang optimum
untuk aktivitas polimerisasi DNA oleh DNA polimerase. Jika digunakan Taq
DNA polymerase, maka biasanya suhu dinaikan menjadi 72C. Pada suhu
inilah terjadi proses polimerisasi (sintesis) DNA baru dengan adanya aktivitas
DNA polimerase, dNTP, primer, dan DNA cetakan. Proses polimerisasi
biasanya berlangsung selama 2-5 menit.
Setelah proses polimerisasi, kemudian dilakukan lagi siklus seperti
semula, yaitu dengan menaikan suhu menjadi 95-100C (denaturasi), kemudian
diturunkan menjadi 50-60C (penempelan primer), dan kemudian dinaikan lagi
menjadi 72C (polimerisasi). Siklus perubahan suhu semacam ini dilakukan
berulang-ulang sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi
sintesis DNA secara berulang-ulang sehingga diperoleh molekul DNA baru
dengan jumlah yang jauh berlipat ganda dibanding dengan molekul DNA
cetakannya. Inilah yang disebut sebagai proses reaksi berantai polimerase atau
PCR. Dengan teknik ini dimungkinkan mengamplifikasi suatu fragmen DNA
dengan cepat dan dalam jumlah banyak. Selain itu, amplifikasi juga dapat
diarahkan hanya pada bagian-bagian tertentu suatu gen sehingga dapat
dikembangkan untuk tujuan rakayasa struktur suatu gen atau suatu protein.
Skema dasar proses PCR.
GAMBAR
Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR
(kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan
suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa
menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam
jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai
teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada
tahun 1983
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi berantai polimerase adalah metode
enzimatis untuk melipatgandakan (amplification) secara eksponensial suatu
sekuen nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini ditemukan oleh Kary B.
Mullis pada tahun 1985, seorang saintis dari perusahaan CETUS Corporation.
Metode PCR ini pada awalnya hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul
DNA, akan tetapi dalam perkembangannya dapat digunakan untuk
melipatgandakan molekul mRNA.

Metode PCR dapat melipatgandakan (amplification) suatu fragmen molekul DNA
menjadi molekul DNA (110 bp/5x10-19) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan
20 siklus reaksi selama 220 menit. Kelebihan dari metode PCR adalah DNA
cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga
metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuen DNA dalam
genom bakteri hanya dengan mencampurkan kultur bakteri di dalam tabung PCR.

Cara kerja
Prinsip kerja reaksi berantai polimerase
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali
siklus yang tergantung oleh kebutuhan. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap.
Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:
1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung
pada suhu tinggi, 9496 C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi)
dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR
tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua
berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan
siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu
antara 4560 C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat
menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari
jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai.
Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 C.
Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan
renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer
lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang
dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi
secara eksponensial.
Aplikasi PCR
Sejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi molekular dan
bioteknologi semakin pesat. Beberapa contoh penerapan PCR antara lain:
- analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari atau
jaringan
- deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV
- pengujian kualitas air minum
- identifikasi jenis kelamin

E. Pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi
F. Penyambungan DNA (ligasi DNA)






















BAB III
PENUTUP

A. Simpulan
B. Saran