PRTICA 1

EFEITO DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE DA ENZIMA -AMILASE

PROFESSOR: Gabriel Castiglioni
GRADUANDOS:
Ana Carolina Burger (113407)
Willian Fagundes Guimares (073905)







Goinia, agosto 2014.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS
ESCOLA DE AGRONOMIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS
SETOR DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CINTICA DE PROCESSOS BIOLGICOS



SUMRIO

1. INTRODUO............................................................................................. 3
2. OBJETIVO................................................................................................... 4
3. MATERIAL E MTODOS........................................................................... 4
3.1 MATERIAIS ................................................................................................. 4
3.2 MTODOS................................................................................................... 5
4. RESULTADOS E DISCUSSO................................................................... 7
5. CONCLUSO.............................................................................................. 9
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................ 9
























3

1. INTRODUO

O amido o principal polissacardeo de reserva dos vegetais, sendo um
polmero formado por monmeros de glicose. Est presente em diferentes
partes da planta: no caule, na raiz ou nos frutos. Seu local de origem na planta
reflete as necessidades de armazenamento deste acar, ou ento, faz parte
da estratgia de disperso de sementes do vegetal por uso do fruto (Qian et al.,
1995).
Algumas dessas culturas so amplamente utilizadas pelo homem, como
o trigo, arroz, milho, cana-de-aucar, batata, entre outras. O amido de
diferentes origens possui diferentes focos de aplicao econmica, como na
produo de combustveis, insumo de bebidas, na lignificao do papel, na
indstria txtil entre outras aplicaes, movimentando a economia de muitos
pases (Gilis, 2005).
As diferenas encontradas entre molculas de amido de diferentes
origens residem na relao entre os dois tipos de polmeros presentes no gro
de amido. Estes polmeros so a amilose, constituda por ligaes alfa-D-(1,4)-
glicosdicas com cerca de 6.000 resduos de glicose, e a amilopectina,
constituda por ligaes alfa-D-(1,4)-glicosdicas, (em pequenas cadeias
lineares de 10 a 60 resduos) e ramificaes alfa-D-(1,6)- glicosdicas (em
pequenos ramos laterais de 15 a 45 resduos) (Entwistle et al., 1998).
Diferentes amilases so utilizadas industrialmente para a produo de
oligossacardeos a partir do amido. Independente da origem do amido e dos
produtos resultantes, existe trs passos no tratamento do amido: solubilizao
do amido, liquefao do amido e sacarificao (Bertoldo et al., 2002).
A famlia -amilase engloba endoamilases presentes nos trs grandes
domnios da vida, sendo considerado o grupo de enzimas mais utilizado na
indstria biotecnolgica (Gillis, 2005).
Enzimas que hidrolisam o amido, em particular a-amilases, so
utilizadas em vrios processos industriais. Da produo do malte para a
cervejaria at seu uso em detergentes (Nielsen et. al., 2000), a-amilases que
hidrolisam o amido representam 30 % das enzimas consumidas no mundo todo
(Haki et al., 2003).
4

O aumento da termoestabilidade e, at mesmo o aumento da atividade
cataltica de uma enzima, podem ser influenciados pela interao da sua
superfcie com o solvente, em regies distantes do stio cataltico e de forma
independente ao longo da enzima (Komeda et al., 2003).
Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores
o mtodo do DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico). um mtodo rpido e prtico na
determinao de acares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial.
Pode ser aplicado no controle de qualidade na caracterizao das matrias
primas para fins de processamento, e verificao se determinado produto est
dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao; indstria aucareira,
no acompanhamento do processo de fermentao, que permite verificar as
taxas de consumo de acar pelo micro-organismo (Miller, 1959).

2. OBJETIVO

O objetivo desta aula prtica foi estudar o efeito da temperatura na
termoestabilidade da enzima -amilase

3. MATERIAL E MTODOS

3.1. Materiais
Soluo de amido gelatinizado (1%)
Banho frio
Banho maria
Bquer
DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico)
Extrato de enzima -amilase
Espectrofotmetro Metrolab
Micropipeta automtica
Pipeta graduada
Ponteiras de plstico
Soluo tampo pH 5,0 (0,1mM)
Suporte de ao para tubos de ensaio
5

Tubos de ensaio

3.2. Mtodos

A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se
na reduo, em meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (colorao amarela). O
produto formado estvel, com colorao laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro
salicilato) na proporo estequiomtrica e mxima absoro da luz visvel no
comprimento de onda de 540 nm. Para a execuo deste mtodo necessrio
se fazer inicialmente uma curva-padro do acar que se deseja quantificar
(Millher, 1959). Neste mtodo ocorre a seguinte reao de oxidao (Figura 1):





Figura 1. Reao de oxidao da carbonila pelo reagente DNS (Millher, 1959).

Foi utilizado 2 mL de soluo de amido gelatinizado, 100 L de extrato
enzimtico de -amilase e 100 L de tampo citrato pH 5,0 0,1M durante 10min
a 30, 45 e 60 C, com agitao para manter a homogeneidade. Aps este
perodo, 100 L do sobrenadante reacional foi transferido para tubo de ensaio
com 80 L de tampo citrato pH 5,0 0,1M e 1 mL de DNS, onde foi aquecido
100C por 5min e logo aps em banho de gelo por mais 5min. Em seguida foi
feita a em espectrofotmetro a 540nm.
O branco foi preparado tanto do tampo quanto do amido que foi
hidrolisado. Na primeira situao foi feita a reao utilizando 180 L de tampo
e 1 mL de DNS. Na segunda situao a reao foi conduzida com 100 L de
amido gelatinizado, 80 L de tampo citrato e 1 mL de DNS.
A atividade da enzima -amilase foi avaliada em relao com
imobilizao em resina hidrofbica e de troca inica, utilizando a curva padro
6

de glicose das diferentes concentraes da amostra, apresentada abaixo na
figura 2.

Figura 2: Absorbncia em funo da Concentrao de soluo de Glicose.

Atravs da regresso linear, foi obtido o seguinte modelo, que permite
obter a concentrao de glicose de qualquer soluo realizada sob mesmas
condies atravs da simples leitura da absorbncia das mesmas:

Eq.01:y =0,5308x

Determinou-se a concentrao de Concentrao de glicose (mg) pela
frmula apresentada acima, na qual se multiplicou pelo fator de diluio.

O fator de diluio anteriormente mencionado foi calculado pela seguinte
equao:
Eq.02::olumc totol =:olumc soluo + :olumc Jilucntc
Onde:
Volume soluo =Amostra da soluo realizada na prtica de laboratrio
Volume diluente =quantidade de gua destilada utilizada para diluir o volume
da amostra
Eq.03:Fotor Jc iluio =
:olumc totol
:olumc soluo

Encontrando fator de diluio de 8,5.
7

A atividade enzimtica da enzima -amilase foi determinada atravs da
quantificao de acares redutores produzidos, utilizando o cido 3,5
dinitrosaliclico (DNS). Uma unidade enzimtica foi definida como a quantidade
de enzima que libera 1 mol de acar redutor por minuto.
Para o calculo da atividade enzimtica (U) em mol/min montou-se uma
regra de trs:
mM da glicose (180,16g\mol) - - - - 1mol
C da glicose (curva padro) - - - - - x

Eq.04:u =
x
tcmpo Jc rcooo (10min )


4. RESULTADOS E DISCUSSES


As reaes necessrias para digerir alimentos, enviar sinais atravs dos
nervos, ou contrair um msculo simplesmente no ocorrem em velocidade til
sem catlise. Uma enzima contorna estes problemas fornecendo um ambiente
especfico dentro do qual uma reao dada energeticamente favorvel. A
caracterstica distintiva de uma reao catalisada enzimaticamente que ela
ocorre no interior dos limites de uma cavidade chamada stio ativo (Lehninger
1995). Assim a necessidade de estudos que permitam um conhecimento capaz
de definir variveis que interfiram a atuao das enzimas, como a temperatura
em questo, considerado de grande importncia.

Tabela 1. Valores de absorbncia obtidos e Concentrao e Atividade
enzimtica calculadas.
Temperatura
(C)
ABS(mdia-
branco)
Concentrao de glicose
(10^-3g/mL) U (10^-3 mol/min)
30 0,237 3,79525 2,106599689
45 0,288 4,6121 2,56000222
60 0,270 4,32395 2,400061057

Conforme apresentado na tabela 1, foi realizada a leitura das
absorbncias das amostras as 30, 45 e 60C, e atravs da equao obtida
8

atravs da curva padro, foram encontrados os valores das concentraes de
glicose na amostra e com a equao 4 encontrou-se a atividade enzimtica.
Para avaliar a estabilidade da enzima, em relao temperatura,
avaliou-se a concentrao das amostras. Quanto maior a concentrao de
maior a quebra do amido, logo melhor a atividade da enzima (Bianconi, 2006).
Analisando a tabela 1, tem-se que os dados referentes ao ponto dois
(temperatura media de 45 C), a melhor estabilidade da enzima apresentou
maior concentrao de glicose, o que segundo Bianconi (2006), sendo as
demais temperaturas foi responsvel pela desnaturao com um menor tempo
em comparativo com os demais.

Figura 3. Valores da Atividade Enzimtica de acordo com a
temperatura.
.

Conforme apresentado na figura 3, observou-se que a temperatura
de 45C foi a que apresentou melhor atividade. J a temperatura de 30C
mostrou-se menos eficiente para a atividade enzimtica, com menor atividade
enzimtica.
De acordo com Spier (2005), o pH timo para a -amilase fngica
est entre 5,0 e 6,0. Possui carter cido e solvel em gua. Sua atividade
diminui rapidamente em temperaturas acima de 50C, mas na presena de um
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
30 45 60
Temperatura (C)
U

(
1
0
^
-
3

m
o
l
/
m
i
n
)
9

excesso de ons clcio a desativao pode ser diminuda. Confirmando a
melhor estabilidade da enzima em temperaturas menores que 60C e no
presena de clcio. Os ons de clcio atuam como cofatores das -amilases,
estabilizando-as, dentro de certos limites, contra a desnaturao produzida
pelo calor e lcalis. J ustificando assim a atividade enzimtica referente a
temperature de 60 C sendo inferior a de 45C, conforme apresentado na figura
3.
O experimento foi realizado com amido gelatinizado pois as amilases
tem escassa ao sobre o amido intacto (Quaglia, 1991). As pesquisas com as
-amilases bacterianas tem recebido grande ateno nos ltimos anos devido
sua maior termoestabilidade. Entretanto a sua utilizao para a liquefao do
amido tem se constitudo na unidade operacional mais cara do processo de
sacarificao principalmente por serem produzidas por fermentao (Aquarone,
2001).

5. CONCLUSO

A -amilase apresentou temperatura tima prxima a 45C em
conformidade com a referncia pesquisada. Esta temperatura permite o maior
numero de colises sem afetar sua atividade. Assim como desnaturao em
temperaturas prximas a 60C e resultados insatisfatrios em 30C.


6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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22 de ago. 2014

10

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