4.

Synthetic PrP 106-126 pptido

El primero in vitro modelo para estudiar el papel patognico de la PrP se aprovecharon
de pptidos sintticos homlogos a segmentos consecutivos de la protena amiloide
purificados a partir del tejido cerebral de los pacientes con Enfermedad de Gerstmann-
Straussler-Scheinker (GSS) de la enfermedad [45 ]. A partir del anlisis de la actividad
biolgica de los diferentes segmentos de aminocidos cidos, un pptido que abarca los
aminocidos 106-126 de la secuencia de PrP (PrP106-126), y capaz de reproducirse in
vitro en varias propiedades bioqumicas y biolgicas de PrP
Sc
(-hoja rica estructura,
amiloidosis, y los efectos neurotxicos y gliotrophic), fue identificado
[ 27 , 28 , 46 , 47 ]. Por lo tanto, se propuso que este pptido contiene el "motivo de la
muerte" interno a la secuencia de PrP.
Anlisis de dicrosmo circular de PrP106-126, combinado con in vitro en estudios de
neurotoxicidad, revel que la actividad de este pptido es dependiente de la presencia
de una regin hidrofbica interna, como mutaciones en los residuos hidrfobos en el
interior de este ncleo causada incapacidad de PrP106-126 para adoptar una
conformacin -hoja y de inducir neurotoxicidad [ 37 ].
La relevancia de la secuencia 106-126 de la actividad biolgica de PrP se demuestra
adems por la observacin de que este fragmento contiene la secuencia de AGAAAAGA
palndromo amiloidognica (aminocidos 113 a 120) que se demostr que era la regin
ms conservada dentro de las molculas de PrP en diferentes especies [ 48 ]. In vitro ,
PrP106-126 muestra una -sheet-rica estructura, con una alta tendencia a la
espontnea agregarse en fibrillas amiloides [ 39 , 46 , 49 ] y la resistencia a la
proteolisis parcial PK [ 47 ].
Por otra parte, se inform de este pptido para inducir la apoptosis en cultivos
primarios de hipocampo [27 ], cortical [ 50 ] y las neuronas del cerebelo [ 36 , 37 , 51 ]
y para ejercer una accin trfica sobre las clulas gliales [ 28 , 52 , 53 ]. Por otra parte,
la absorcin del pptido por las clulas neuronales y gliales se ha demostrado
recientemente [ 54 ], lo que sugiere que un pptido internalizado puede ser
responsable de los efectos sobre estas clulas.
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5. PrP106-126 agregacin no es un requisito previo para su actividad
txica
Con el fin de dilucidar si PrP106-126 agregacin est implicada en su actividad
neurotxica, generamos un PrP106-126 mutante, en la que dos glycines dentro del
ncleo palindrmica hidrofbica del pptido (A 113 GAAAAGA 120 ) se sustituyen por dos
alaninas. Hemos demostrado que el G 114 y G 119 son los principales determinantes para
la fibrilognesis de PrP106-126. En silico y anlisis experimental demostr que la alta
propensin de PrP106-126 para formar agregados fibrilares era dependiente de la
presencia de G 114 y G 119 , mientras que la presencia de dos alaninas podra reducir la
flexibilidad del pptido y la propensin de agregacin [ 48 ]. Curiosamente, este
mutante PrP106-126 (PrP106-126AA) se pliega en una hoja de -rica en estructura
secundaria, pero, en contraste con el peso de pptido, es completamente soluble en
agua y no forma grandes agregados o cantidades importantes de amiloide-al igual
fibrillas [ 48 ]. Sin embargo, desde un punto de vista biolgico, PrP106-126AA mostr
efectos biolgicos similares a los del peso pptido, ser capaz de inducir la muerte
celular por apoptosis a travs de la activacin de la cascada de la MAP quinasa p38
[ 48 ]. Estos datos indican que glicinas 114 y 119 en PrP106-126 secuencia son los
principales determinantes necesarios para la fibrilognesis del pptido, probablemente
debido a la alta flexibilidad que introducen en la estructura molecular, pero no son
necesarios para la activacin de la va apopttica [ 48 ]. Esta observacin apoya la tesis
de que la formacin de amiloide no es necesario para la actividad txica de los pptidos
PrP.
Se obtuvieron resultados similares usando un enfoque diferente: la amidacin del C -
terminal de PrP106-126 causa la prdida de la actividad fibrilognico pptido, pero
retiene la actividad neurotxica [55 ].
Por lo tanto, PrP106-126 agregacin no es un requisito previo para su actividad txica.
En estudios ms recientes, la estructura tridimensional de PrP106-126 oligmeros se
analiz mediante resonancia magntica nuclear de estado slido (RMN). Se propuso
un modelo en el que estos oligmeros se estructuran como conjuntos esfricas
hidratados, que corresponden a la estructura de los oligmeros de A neurotxicos en
la enfermedad de Alzheimer [ 56 ]. Por lo tanto esta estructura podra representar una
conformacin neurotxico general de pptidos amiloidognicos. En detalle, se
demostr que PrP106-126 oligmeros contienen los elementos bsicos de las fibrillas
de amiloide, pero son diferentes de fibrillas debido a un trastorno de largo alcance y la
movilidad locales [ 56 ].
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6. Los pptidos recombinantes PrP-derivados
Aunque las bacterias-sintetizaron protenas recombinantes derivadas de PrP carecen
de modificaciones post-traduccionales tales como las glicosilaciones observados en PrP
natural, que comparten varias propiedades biofsicas y biolgicas con PrP
C
[ 57 ]. Por
tanto, se acepta generalmente que la estructura tridimensional de protenas prinicas
recombinantes es muy similar o idntica a las protenas prinicas celulares naturales
correspondientes [ 58 ].
En varios estudios, fragmento de PrP, que abarca los residuos 90-231, se sintetiz
como protena recombinante en E. coli para obtener un confrmero de PrP mal
plegada para analizar mejor la relacin estructura-efecto biolgico PrP que no era
posible el uso de pequeos pptidos sintticos [ 29 , 32 , 34 , 57, 59 - 64 ]. Este pptido
corresponde al ncleo resistente a proteasa de PrP
Sc
que se acumula en el sistema
nervioso central (SNC) de pacientes afectados por EET y puede representar un posible
candidato responsable de la neurotoxicidad de PrP mal plegada [ 65 ]. In vivo , la
PrP
C
se somete a un proceso fisiolgico, la generacin de dos fragmentos distintos:
112-231 (C1) y 90-231 (C2) [ 66 ]. Sin embargo, mientras que el fragmento C1 se
produce predominantemente en el sistema nervioso central normales, un cambio hacia
la generacin de C2 se produce en los cerebros afectados por EET [ 67 , 68 ]. Por otra
parte, PrP90-231 contiene la mayora de los sitios conocidos en los que se producen
mutaciones puntuales TSE-asociados, lo que representa un buen modelo tambin para
el estudio de los efectos de estas mutaciones sobre la estructura de PrP, agregacin y
efectos biolgicos [ 69 ].
En los ltimos aos, la estructura tridimensional de ratn, hmster, PrP recombinante
bovina y humana se determin en solucin por espectroscopa de RMN. Se encontr
estructura de PrP de todas las especies a ser muy similares, que se caracteriza por una
larga, flexible desordenada N -terminal de la regin (residuos 23-120), y un plegado C -
terminal de dominio (121-231) que contiene tres -hlices y un par de antiparalelas, -
hojas de dos trenzados cortos [ 70 ].
El anlisis por RMN de PrP tanto recombinante y derivado del cerebro confirm que
los residuos 23-125 forma una cola flexible, desordenada, mientras que los residuos
128 a 230 se organizan en un dominio globular, que comprende tres hlices y dos -
captulos que flanquean hlice 1 [ 58 , 71 ] . La parte no estructurada de PrP, entre los
residuos 90 y 120, se somete a profundos reordenamientos en PrP
Sc
[ 72], y de forma
espontnea forma amiloide in vitro cuando se sintetiza como un pptido aislado
[ 45 , 73 ], lo que indica que esta regin es esencial para la PrP
C
replegamiento y mal
plegamiento y, posiblemente, la PrP
Sc
agregacin.
De acuerdo con este punto de vista, los fragmentos de PrP suprimido en las regiones
que abarcan los residuos 109-112 o 114-121 son refractarios a la conversin
conformacional inducido por la PrP
Sc
, y tienen un efecto inhibidor trans-dominante
sobre la conversin de peso PrP en la isoforma patolgica [74 , 75 ]. Curiosamente,
entre los tres PrP -hlices, sintetizado como pptidos aislados, slo hlice-3 estaba
dotado de autnoma auto-estructuracin, debido a la presencia de un N -cuadro de
taponado y parcialmente para la formacin de un enlace inico entre E 200 y
K 204 [ 76 ]. Por otra parte, la estructura de hlice 3 se perdi cuando se introdujo la
mutacin D202N relacionada con GSS, proporcionando un mecanismo potencial
estructural para la PrP
Sc
generacin en esta condicin [ 76 ].
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7. Determinantes de Misfolding estructural de los fragmentos de PrP
recombinante
El primer informe del uso de un pptido PrP recombinante para estudiar los
reordenamientos moleculares responsables de la PrP
Sc
formacin y para estudiar sus
efectos neurotxicos fibrilognicas y se proporciona usando humana PrP91-231
expresado en E. coli [ 57 ]. En particular, el pptido se purific tal como un monmero
altamente soluble, rica en estructuras -helicoidales y que muestra un solo puente
disulfuro intactos. La reduccin del enlace disulfuro y reduciendo el pH a 4,0
generaron una diferente PrP91-231 conformacin, caracterizado por alto contenido de
-hoja y un aumento de la tendencia a formar agregados amiloides, a travs de la
estabilizacin de las interacciones intermoleculares entre -estructuras. Es importante
destacar que, el interruptor de a conformaciones era reversible, cuando la forma
reducida se expone a un pH ms alto (8,0), aunque la tasa de la conversin inversa fue
extremadamente lento [ 57 ]. Una variedad de factores adicionales capaces de inducir
la conversin estructural de las molculas de PrP recombinantes se han establecido
con xito en sistemas libres de clulas, incluyendo: (i) incubacin en alta concentracin
de sal o en presencia de agentes caotrpicos [ 29 , 77 , 78 ]; (ii) desnaturalizacin
trmica controlada [ 34 ], (iii) de alta presin [79 ], y (iv) purificada cerebro PrP
Sc
-
semillas [ 80 ]. Baskakov et al ., demostr que diferentes vas se activan para generar
oligmeros de PrP o fibrillas de amiloide. En particular, el diferencial de replegamiento
de PrP90-231 de -monmeros de -oligmeros o fibrillas de amiloide puede ser
inducida, la modificacin de las condiciones de desnaturalizacin (desnaturalizacin
parcial en pH cido inducir la formacin de oligmero, mientras que la fuerte
desnaturalizacin a pH neutro y agitacin continua generar fibrillas de amiloide )
[ 29 , 77 ].
En la Figura 2 se presenta un resumen del pptido PrP derivada de ms comnmente
utilizado y su principal caracterstica con respecto a la agregacin y in vitro toxicidad
[ 27 , 30 , 32 - 38 , 41 - 45 , 51 , 57 , 60 , 64 , 69 , 81 ] .

La figura 2
Representacin esquemtica de los pptidos sintticos ms comnmente utilizados y
recombinante PrP, y sus principales caractersticas biofsicas y biolgicas.
En nuestros estudios, pptido PrP90-231 humano recombinante se aisl como una
isoforma que reproduce PrP
C
-como caractersticas [ 81 ]. Este pptido se purific
como una protena soluble nativa, la adopcin de un protocolo que evita la necesidad
de ciclos de desnaturalizacin y renaturalizacin para disolver las bacterias cuerpos de
inclusin; hPrP90-231 est estructurado en gran parte en -hlice y conserva un
puente de disulfuro intra-molecular intacta. Por desnaturalizacin trmica limitada (1
hora a 53 C), hPrP90-231 se convirti en un rico, el pptido -hoja insoluble,
agregacin propensos hidrofbica (todas estas caractersticas representan identificados
en PrP
Sc
) [ 34 ]. Por otra parte, en esta conformacin, pero no en su estructura -
hlice nativo, hPrP90-231 induce la muerte celular a travs de la apoptosis
dependiente de caspasa, imitando los efectos de la PrP
Sc
purificadas a partir de cerebro
de hmster infectado [ 34 , 82 , 83 ].
Debido hPrP90-231 citotoxicidad es completamente dependiente de la estructura
tridimensional [ 59 , 61, 82 ], el pptido rico en estructuras -hoja ha sido nombrado
HPRP
Tox
[ 84 ].
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8. Recombinante Prion pptidos infectividad
Aunque isoformas agregados de pptidos recombinantes se han caracterizado como
PrP
Sc
molculas-como, la reconstitucin de infectividad es todava difcil de
conseguir in vitro [ 85 ]. La generacin de fibrillas de amiloide libre propagacin de
ratn recombinante PrP89-230 se demostr mediante agitacin continua en una
solucin ligeramente cida en la presencia de agentes desnaturalizantes (urea 2-4 M)
[29 ]. Estas fibrillas, generados por MoPrP89-230, cuando se inocula por va
intracerebral en ratones transgnicos que expresan la misma secuencia (MoPrP89-
230) son capaces de inducir una enfermedad prinica-como en el segundo in
vivo pasaje [ 86 ].
Ms recientemente, Fei Wang et al ., inform de la generacin de una PrP murina
recombinante (rPrP23-230) con los atributos de la isoforma patgena PrP capaces de
infectar en peso de los ratones despus de la inyeccin intracerebral. Curiosamente, en
este modelo, la incubacin con un POPG fosfolpido aninico sinttico (1-palmitoil-2-
oleoylphosphatidylglycerol) y el ARN aislado a partir de hgado de ratn normal
jugaron un papel decisivo en la induccin de la infeccin por priones, proponiendo as
que los lpidos desempean un papel esencial en la conversin de PrP en una unidad
infecciosa [ 87 ].
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9. Los mecanismos de agregacin y la neurotoxicidad de los pptidos
recombinantes prinicas
La observacin de que en la mayora de los modelos, en in vitro generados por fibrillas
son especies no txicas [ 88 ], apoya la hiptesis de que los productos intermedios
oligomricos solubles en lugar de amiloide estructurada son los agentes causantes de la
muerte de las clulas neuronales en EET, como se ya se ha propuesto en otra
trastornos neurodegenerativos asociados con el mal plegamiento y la agregacin de
protenas [ 89 , 90 ].
En este sentido, oligmeros enriquecidos -hoja se han detectado en la va de la PrP
agregacin in vivo [91 , 92 ] y en in vitro [ 77 , 78 , 93 , 94 ].
Tambin en nuestros estudios, pre-fibrilares confrmeros oligomricas, monomricas
o pequea de HPRP
Tox
, en lugar de solubles o fibrilar grandes agregados, representan
las especies neurotxicos [ 95]. En particular, monitoreamos el curso temporal de la
hPrP90-231 agregacin mediante microscopa electrnica, Congo vinculante rojo, y la
evaluacin de la prdida de energa de la luz transmitida (aparente absorbancia) a 380
nm. Hemos informado que la desnaturalizacin trmica leve de hPrP90-231 (1 hora a
53 C), mientras que suficiente para generar HPRP
Tox
, no induce la formacin de
grandes agregados o fibrillas estructurados [ 95 ]. De hecho, slo despus de la
incubacin muy prolongado a 37 C, lo hizo hPrP90-231 generan fibrillas de amiloide-
al igual que sin embargo, pierden su potencial txico [ 95 ].
Del mismo modo, Simoneau et al. , demostr que los oligmeros -PrP ovina derivados
de PrP23-234, son las principales especies neurotxicos in vitro y in vivo , lo que
confirma que esta agregacin isoforma es probable que sea la estructura de PrP
responsable del desarrollo de las EET- neurodegeneracin vinculado [ 96 ]. Uso de
fragmentos recombinantes de PrP ovina [ovPrP (25-234)], correspondientes a la
tembladera-resistentes y susceptibles genotipos (Ala136/Arg154/Gln171, ARR y
Ala136/Arg154/Arg171, ARQ, respectivamente), se confirm que, en contraste con lo
observado para la transmisin de las EET, PrP-ARR fue mucho ms txico para las
neuronas en cultivo que PrP-ARQ, debido a la estabilidad estructural inferior que
reduce la capacidad para formar grandes agregados y fibrillas [ 97 ].
Desde un punto de vista molecular, HPRP
Tox
pequeos oligmeros inducir
neurotoxicidad despus de la neurona internalizacin y la acumulacin en el
compartimento endolisosmica. Estos agregados causan daos lisosomal, fugas de
enzima proteoltica y la activacin de la apoptosis dependiente de caspasa
[ 61 , 95 ]. En estos estudios, hemos demostrado que fibrilar hPrP90-231 isoforma no
se acumula en vesculas cidas, lo que sugiere que la incapacidad de
HPRP
Tox
agregados fibrilares o grandes para ser internalizado suprime su potencial
neurotxico.
Todo esto evidencia experimental apoya la nocin de que la enfermedad prinica
neurotoxicidad est mediada por oligmeros de protenas mal plegadas que
constituyen el disparador importante del proceso de pro-apoptticos, en lugar de
grandes agregados fibrilares ( Figura 3 ).

Figura 3
Importancia biolgica de los productos intermedios durante el proceso de agregacin
de prin. Representacin esquemtica de los pasos de agregacin de
priones. Monomrico PrP
Sc
, se cree que los pequeos oligmeros o PrP estructuras
pre-fibrilares que los agentes causantes de prin-dependiente ...
Algunos estudios de agregacin pertinentes tambin utilizaron PrP recombinante de
longitud completa (aa 23-231) [ 78 , 98 ], sin embargo, las propiedades de agregacin
de esta construccin no han sido analizados tan extensamente como los de las formas
truncadas, tal vez debido a que el C -terminal de la porcin es la parte resistente a la
proteasa de PrP
Sc
y se supuso que este fragmento conserva la mayor parte de la
informacin relevante acerca de la PrP agregacin y toxicidad [ 99 ]. Sin embargo, el
uso de PrP recombinante de longitud completa, se ha demostrado recientemente que al
lado de -oligmeros, algunas especies de PrP estructurados monomricos y -hlice
tambin son capaces de inducir efectos neurotxicos in vivo y in vitro [ 100 ]. Esta
evidencia contrasta con la afirmacin de que el dao neuronal prin slo o
predominantemente est vinculada a la toxicidad de -hoja PrP oligmeros, abriendo
un nuevo captulo en el conocimiento de la neurodegeneracin inducida por priones,
que an queda por explorar.
En otros estudios, los fragmentos de PrP con N -deleciones terminales se muestran
para formar conformaciones atpicas de los agregados de priones. Lawson et al .,
introducido deleciones en el flexible de N -terminal de la regin de PrP de hmster
(residuos 34-124) y se investig el efecto de esta regin en la conformacin de la forma
resistente a la proteasa de la protena prinica codificada por el hospedador (PrP-res)
. Formacin de PrP-res, generado in vitro en un ensayo de conversin libre de clulas,
se redujo significativamente por la eliminacin de los residuos 34 a 94 relativos a de
longitud completa PrP de hmster [ 101 , 102 ]. Se observ que la flexibilidad N -
terminal de la cola de la PrP influy en las interacciones necesarias ya sea para generar
o interrumpir la formacin de PrP-res, lo que sugiere que esta regin puede influir en
la patognesis y la transmisin [TSE 101 , 102 ].
La comprensin de los mecanismos de agregacin de PrP se puede obtener mediante el
examen de la dependencia de su velocidad de polimerizacin en la concentracin de
protena. La agregacin de numerosas protenas implicadas en enfermedades
neurodegenerativas ha sido propuesto para proceder por un mecanismo dependiente
de la nucleacin, lo que representa el modelo ms ampliamente aceptado para este tipo
de proceso [ 103 - 105 ]. En este modelo, la formacin de las especies de ms alta
energa, el ncleo termodinmico, a partir de unidades monomricas, es limitante de la
velocidad para la formacin de agregados de mayor tamao. La velocidad de
agregacin tiene una dependencia de orden alto de la concentracin de protena
monomrica, un mecanismo que se ha utilizado para explicar la aparicin tarda de las
formas espordicas de la enfermedad de Alzheimer y las enfermedades prinicas
[106 ]. Recientemente, a partir de la evidencia de que la agregacin se activa por un
mecanismo de siembra, en el que los oligmeros de PrP son capaces de catalizar la
polimerizacin de nuevas protenas prinicas en agregados ms grandes (vase la
Figura 1 ), Hesketh et al ., analiz la interaccin sustrato con especies oligomricas ,
generada a partir de la PrP recombinante. Ellos demostraron que diferentes dominios
dentro de la PrP se requieren para generar la semilla en comparacin con las
necesarias para inducir an ms la agregacin [ 107 ].
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10. Mal plegamiento / Aggregation Caminos de E200K o D202N
mutaciones relacionadas con la enfermedad de la protena prinica
humana
Aproximadamente el 15% de las enfermedades prinicas humanas tienen un patrn de
herencia autosmico dominante, y estn relacionados con mutaciones en el gen que
codifica la PrP ( PRNP ).Ms de 30 mutaciones patgenas en humanos PRNP se han
identificado ( Tabla 2 ) [ 108 ]. El papel exacto de estas mutaciones en las EET
patognesis no ha sido completamente dilucidado y diferencias significativas con los
infecciosa PrP
Sc
se observaron isoforma. Por ejemplo, las EET genticos muestran una
muy baja tasa de transmisibilidad [ 24 , 25 ]. De hecho, mediante la expresin de
molculas de PrP mutantes en varios tipos de clulas y tejidos, se inform de que la
mutacin E200K, observado en pacientes ECJ familiar, no transmite automticamente
las propiedades de PrP
Sc
a nuevas molculas de PrP sintetizados. Este proceso de
conversin se produce principalmente en los cerebros afectados, lo que sugiere la
presencia de un factor especfico de tejido o dependiente de la edad, de acuerdo con la
naturaleza aparicin tarda de la ECJ hereditaria [ 109 ]. Inicialmente se propuso que
las mutaciones PrP pueden facilitar la generacin espontnea de la PrP
Sc
,
desestabilizando la estructura nativa de PrP
C
. Zhang et al ., estudiando E200K
variante de la PrP humana, que evalu la estructura terciaria columna vertebral de este
PrP mutante es casi idntica a la descrita para el peso de la PrP humana. La nica
consecuencia importante inducida por la mutacin en la estructura de PrP es la
perturbacin de potencial electrosttico de la superficie, lo que sugiere que no todas las
EET hereditarias pueden ser racionalizadas a travs de un mecanismo comn sobre la
base de desestabilizacin termodinmico de PrP
C
[ 110 ]. Por el contrario, Hasegawa et
al ., realiza ab initio clculos orbitales moleculares de fragmentos para el peso de PrP
humana y la variante E200K, modelada en condiciones cidas neutras y suaves. Esta
sustitucin altera notablemente las interacciones intra-moleculares en el PRP, lo que
sugiere que las inestabilidades estructurales locales inducidos por la mutacin E200K
pueden causar la desnaturalizacin inicial de la PrP y su posterior conversin a una
isoforma patgena [ 111 ].

Tabla 2
Mutaciones puntuales representativos responsables de las enfermedades prinicas
familiares.
La evidencia reciente sugiere que prpn mutaciones pueden influir no slo PrP
C
la
estabilidad, sino tambin su procesamiento y / o sus interacciones protena-protena,
de tal manera que puede ocurrir la agregacin y la enfermedad desarrolla [ 112 , 113 ].
A pesar de todos estos datos, los mecanismos celulares por los que las mutaciones de
PrP causan la formacin de especies neurotxicos son todava en gran parte
desconocida. Recombinante D202N y E200K mutantes de hPrP90-231 se sintetizaron
para analizar la influencia de estas mutaciones sobre las propiedades bioqumicas y
biolgicas de la protena [ 114 ]. hPrP90-231 en peso y el mutante D202N eran no
txicos en su conformacin nativa, pero causaron la muerte celular slo despus de
mal plegamiento inducida por desnaturalizacin trmica controlada. Por el contrario,
la introduccin de la mutacin E200K produce un pptido altamente txico ya en su
estructura nativa, lo que sugiere que la mutacin E200K per se favorece la adquisicin
de una conformacin txico, por lo menos dentro de la secuencia truncada 90-231
[ 114 ].
hPrP90-231 E200K mutante mostr una alta propensin a agregarse, en oposicin a
hPrP90-231 en peso y mutante D202N que adoptar esta caracterstica slo despus de
la desnaturalizacin trmica.Curiosamente, la resistencia a la proteolisis PK tambin
fue identificado en nativo hPrP90-231 E200K.Resultados similares fueron reportados
usando la PrP de longitud completa que lleva la mutacin E200K en el que la
resistencia PK fue identificado como una caracterstica intrnseca [ 115 ]. Estos datos
demuestran que la mayora de las caractersticas estructurales de peso y las molculas
de PrP de longitud completa mutantes son de hecho retenido en los 90-231 fragmentos
recombinantes.
Se propuso que la toxicidad de peso hPrP90-231 oligmeros o de E200K y mutantes
D202N se puede explicar con eficacia por un mecanismo comn, que corresponde a un
aumento en la exposicin aminocido hidrofbico que es responsable de los dos
perfiles de agregacin y la actividad txica, probablemente a travs de un aumento de
la interaccin con las membranas neuronales y la internalizacin celular
[ 114 ]. Observado cambios hidrofobicidad en hPrP90-231 en presencia de la mutacin
E200K bien encajan con otros informes [ 111 ] en el que se demostr, mediante
clculos orbitales moleculares de fragmentos, que E200K mutacin provoca un cambio
drstico en las interacciones intra-moleculares de PrP, que conduce a la reorganizacin
estructural de PrP alterar su estabilidad estructural local.
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11. Efecto de la composicin del suelo en PrP recombinante Agregacin y
neurotoxicidad
Composicin del suelo afecta, sin duda, la retencin, la agregacin y la descomposicin
de la bio-macromolculas infecciosos y txicos, as como la de los cidos nucleicos, y es
bien sabido que las sustancias fcilmente descomponibles se pueden estabilizar
mediante la interaccin con el suelo [ 116 ].
Prion interacciones con los componentes del suelo pueden jugar un papel importante
en la transmisin de las EET, y es una cuestin de hecho de que los priones derivados
de animales infectados pueden contaminar el suelo.
Difusin Agrcola de abonos orgnicos infectados pueden haber contribuido a la
difusin de priones durante la epidemia de EEB, antes del establecimiento de las
normas de seguridad adecuadas [ 117 ]. La relevancia de la composicin del suelo en
EET propagacin se demostr por el requisito de la presencia de Cu
+ +
, Mn
+ +
y otros
metales traza en el suelo para la transmisin de la enfermedad [ 118 , 119 ].
Los priones entran en el medio ambiente, en matrices complejas competitivos, tales
como orina, heces, saliva, sangre, y dar a luz cuestin, as como el tejido de la
mortalidad [ 120 , 121 ]. Persistencia en el ambiente de los priones en el suelo se
demostr mediante bioensayos intra-cerebrales, despus de mezclar el tejido cerebral
infectado con el suelo lleno en placas perforadas de Petri, que luego fueron
incorporados dentro del suelo que contienen ollas, y enterrados en un jardn de tres
aos [ 122 ]. Iones disueltos presentes en solucin pueden interactuar con ambas
superficies minerales y protenas para suelo impacto capacidad de adsorcin y la
conformacin de protenas adsorbidas [ 123 ]. Saunders et al ., diferencias evaluados
en prin adsorcin y la eficacia de la replicacin como una funcin de la solucin de
adsorcin y desorcin medido y la replicacin de los priones suelo unidas a lo largo de
perodos de tiempo de hasta un ao. Ellos demostraron que despus de la unin a los
componentes del suelo, los priones siguen siendo un riesgo de transmisin de
enfermedades por mucho tiempo [ 123 ]. Por otra parte, se observ que la PrP
Sc
unido
a suelos con alto contenido de arcilla o de componentes orgnicos exhiben una
capacidad reducida para iniciar la conversin de PrP
C
en conformador patognico,
mientras que despus de la unin a las superficies de arena PrP
Sc
no exhibe dicha
reduccin [ 124 ]. El agente de la tembladera 263K puede persistir en el suelo durante
al menos 29 meses y la administracin oral de extractos de suelo contaminado es capaz
de transmitir la enfermedad a los hmsters sirios [ 125]. Por otra parte, los priones
unidos al suelo mineral montmorillonita (Mte) mejoran significativamente penetrancia
enfermedad y reducir el perodo de incubacin en comparacin con las molculas no
unidas [ 126 ]. Este efecto se observ en dos de cada tres suelos probados, y esta
diferencia se atribuy a la componente orgnico diferente presente en estos suelos que
pueden afectar el acceso de PrP
EET
a los sitios de adsorcin en las superficies minerales
[ 126 ]. Estos datos indican claramente que los diferentes componentes del suelo puede
contribuir a la propagacin del medio ambiente de las EET mediante el aumento o la
reduccin de la transmisibilidad de las pequeas cantidades del agente infeccioso
prin dispersas en el medio ambiente. Los estudios epidemiolgicos muestran que la
tembladera y la caquexia crnica pueden transmitirse horizontalmente a los animales
que pastan en praderas o potreros contaminados por cadveres infectados, las heces y
la orina excretada por los animales infectados o de la placenta infectada que queda en
el suelo despus de cras nacen [ 117 , 127 ]. La interaccin de hPrP90-231 con
sustancias hmicas (SH) se analiz a nivel molecular para verificar si los diferentes
componentes del suelo pueden afectar la generacin de HPRP
Tox
[ 128 ]. SA son los
componentes refractarios de la materia orgnica natural en suelos, sedimentos y aguas,
ampliamente difundidas en todos los ambientes climticos y acumuladas naturalmente
en el suelo debajo de los climas templados fros. Se clasifican como cidos hmicos
(HA), que son solubles slo en soluciones alcalinas, y cidos flvicos (FA), que son
solubles en soluciones alcalinas y cido.
En silico clculos de acoplamiento se llevaron a cabo para identificar los sitios de
interaccin en hPrP90-231 con dos estructuras de modelos de SA: un modelo de HA y
un modelo de Swannee ro FA, que muestra una interaccin significativa en varias
posiciones diferentes en la superficie de hPrP90-231 [ 128] como se observa tambin
con el ratn PrP89-231 [ 129 ]. Tanto HA y FA se unen de manera significativa a
hPrP90-231 en varios residuos de aminocidos localizados en una regin (-hlice A y
-hoja S1) relevante para la conversin de PrP
C
a PrP
Sc
, posiblemente interfiriendo
con su cambio conformacional, agregacin y actividad neurotxica. Por otra parte, la
unin de SA a hPrP90-231 inhibi la adquisicin de varios PrP
Sc
caractersticas-como,
incluida la resistencia de PK, pero indujo la formacin de grandes agregados de
protenas que impiden la internalizacin de HPRP
Tox
confrmeros en las clulas vivas,
probablemente la eliminacin de su toxicidad [ 128 ]. Esta evidencia sobre los efectos
de las partidas en la conversin de hPrP90-231 en HPRP
Tox
apoya la hiptesis de que la
composicin del suelo, cuando el rico en sustancias hmicas, puede afectar a la
infectividad prinica y toxicidad, lo que explica por qu la transmisin de las EET en
animales salvajes se limita a geogrfica especfica reas [ 128 ].
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12. Conclusiones
La comprensin de los mecanismos moleculares implicados en la PrP
C
conversin en
PrP
Sc
y cmo esta protena patgena puede agregada y causar la muerte de las clulas
neuronales es un objetivo importante para biomdica y, posiblemente, la investigacin
farmacolgica.
Fragmentos de priones sintticos y recombinantes representan herramientas
adecuadas para estudiar los efectos celulares y moleculares de PrP
Sc
in vitro. En
particular, la produccin de grandes recombinantesN fragmentos de PrP-truncadas
permiti la determinacin de una relacin precisa estructura-efecto.
En esta revisin se resume la principal evidencia experimental sobre PrP agregacin
determinantes obtenidos utilizando diferentes PrP pptidos sintticos y
recombinantes. Hasta la fecha, a pesar de los progresos hacia la comprensin detallada
de la biologa y la PrP EET patognesis es significativamente avanzada, posibles
enfoques farmacolgicos, capaces de al menos ralentizar la progresin de la
enfermedad, no se han identificado. En efecto, las EET son todava inevitablemente
fatal, y no hay evidencia de que ninguno de los pacientes o animales experimentales
que sufren de una EET clnicamente manifiesta nunca se han curado. Sin embargo,
creemos que la identificacin de los mecanismos por los que la PrP puede convertirse
en infecciosos y / o entidades neurotxicos puede proporcionar informacin valiosa
para la identificacin de nuevos posibles abordajes farmacolgicos de las EET y otras
enfermedades neurodegenerativas. En este contexto, los pptidos recombinantes PrP
puede ser una herramienta valiosa para profundizar en los determinantes moleculares
de la interaccin potencial de las molculas de priones, como con posibles nuevos
frmacos, como ya se ha demostrado en estudios de neurotoxicidad recientes [ 64 ].
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio italiano de Ayudas
Universitarias y de Investigacin (PRIN-2008 num proyecto. 2008KZ37E5 y FIRB
Accordi Programma di 2.011 proyectos num. RBAP11HSZS) a TF