PRCTICA N1

RECUENTO EN PLACAS

ESQUEMA EXPERIMENTAL

Tomamos 1 ml de muestra (agua potable) y lo llevamos a un tubo de ensayo que

contiene 9 ml de solucin salina fisiolgica (SSF).

Concentracin 10
-1

Tomamos 1 ml de de agua
potable y lo llevamos al
tubo de ensayo

Muestra de agua
potable

9 ml de SSF

9 ml de SSF + 1 ml
de muestra

Luego tomamos 1 ml de la solucin de concentracin 10 -1 y lo llevamos a otro

tubo de ensayo conteniendo 9 ml para obterner una solucion de concentracin
10-2.
Concentracin 10
-2

Tomamos 1 ml de muestra y
lo llevamos al tubo de
ensayo

Concentracin 10
-1

9 ml de SSF

9 ml de SSF + 1 ml
de muestra (10-1)

Finalmente tomamos 1ml de la solucin al centsimo (10 -2) y lo colocamos en

una placa petri con agar PCA.
Placa petri con agar
PCA

Concentracin 10
-2

Sembramos, incubamos a 37 C por 24 - 48 horas y observamos los resultados

RESULTADOS

Nmero UFC en la placa : 51

Dilucin de la muestra : 10-2

Recuento : 51 x 102 UFC/ml

COMENTARIOS
Es una tcnica sencilla que consiste en obtener una suspensin de la mezcla de
microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta
conseguir colonias aisladas.
Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estriles, flameando la boca de los
tubos antes y despus de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero.
La presicin del recuento aumenta con el nmero de colonias, ya que disminuye el
erro debido al muestreo.

CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento del mtodo de recuento en placa?

Consiste en contar colonias que se desarrollan despus de cierto tiempo en el

medio de eleccin presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en
la muestra.
El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo,
el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de
cultivo.
Existen dos mtodos para el recuento de bacterias viables en placa, siendo el de
uso ms frecuente el mtodo de incorporacin o recuento estndar en placa.
Este mtodo consiste en sembrar cajas de petri con 1 ml de muestra (y de sus
diluciones) y agregar de 10 a 12 ml de agar nutritivo estril fundido (teniendo la
precaucin de dejarlo enfriar hasta 44-46 grados). Se mezcla rpidamente y, una
vez solidificado el agar, se incuban las placas durante 7 das a 20 grados C.
El segundo mtodo es de siembra en placa por extensin y consiste en en
extender sobre la superficie del agar en la placa, un volumen no mayor a 1 ml de la
dilucin correspondiente.

(Incorporacin)

(Extensin)

2. Por qu, para el recuento de bacterias viables, se escogen las placas

que han
desarrollado entre 30 y 300 u.f.c.?

Para obtener resultados estadsticamente significativos es necesario contar placas

que contengan entre 30 y 300 colonias. Para que ello sea posible, en el momento de
la siembra debe tenerse una idea aproximada del nmero de bacterias presentes en
la muestra a fin de realizar las diluciones adecuadas.
Cuando se desconoce totalmente la muestra problema es conveniente realizar la
mxima cantidad de diluciones posibles.

3.

Cules son las

incorporacin y
superficie?

ventajas

desventajas

de

las

siembras

por

SIEMBRA POR INCORPORACIN

VENTAJAS
DESVENTAJAS
Menor error en el recuento
Dificultad para subcultivar colonias.
Mejor aprovechamiento de nutrientes
por parte de los
Difcil visualizacin de colonias
microorganismos.
Se puede utilizar para el recuento de
La temperatura del agar puede afectar a
organismos anaerobios.
ciertos microorganismos

SIEMBRA POR SUPERFICIE

VENTAJAS
DESVENTAJAS
Menor cantidad de muestra a procesar
Mayor error en el recuento
En aerobiosis pueden crecer aerobios
Facilidad para subcultivar colonias.
estrictos y facultativos
Bajo aprovechamiento de nutrientes por
Fcil visualizacin
parte de los microorganismos.

No se afectan las clulas termosensible

Se corre el riesgo que otros

microorganismos entren en el medio de
cultivo y contaminen la muestra

4. Por qu se utiliza el termino unidades formadora de colonias (u.f.c.)?

UFC: Una unidad formadora de colonias es simplemente una clula o grupo de ellas,
que, al ser depositadas sobre un medio nutritivo, dan lugar a una colonia.
Esta es definida en bacteriologa como la masa celular visible al ojo humano
que se forma de un origen comn. As, el trmino ufc no es estrictamente
cuantitativo.

5. Por qu el mtodo de recuento en placa, no nos permite determinar el

total de la
poblacin viable de bacterias presentes en una muestra de alimento?
Debe tenerse en cuenta que las bacterias que desarrollan en el medio de cultivo
elegido, son aquellas que pueden utilizar los nutrientes disponibles y que adems
se adaptan a las condiciones de oxgeno, potencial redox, pH, temperatura y
periodo de incubacin. No existe un medio nutritivo ni una combinacin de
temperaturas y tiempos de incubacin que aseguren la recuperacin de todas las
bacterias viables de una muestra de alimento.
Las bacterias en una muestra de alimento pueden encontrarse aisladas o en
agrupaciones (de a pares o en cadenas) o asociadas a partculas. Por ello cada
colonia que desarrolla puede estar originada por uno o ms organismos y el
resultado de su recuento se expresa como unidades formadoras de colonias por
unidad de volumen

PRACTICA N 2
RECUENTO POR EL MTODO DEL NMERO MS PROBABLE
ESQUEMA EXPERIMENTAL

De una muestra de agua potable, se tomaron 3 muestras de 1 ml las cuales

se depositaron en 3 tubos de ensayo que conteniendo 9 ml de caldo BRILLA,
para obtener una concentracin de 10-1
Concentracin 10
-1

Se toma 1 ml
de muestra

Agua potable
9 ml de caldo
BRILLA en cada
tubo

Luego se tom 1 ml de muestra de agua potable y se mezcl con 9 ml de

solucin salina fisiolgica (SSF) en un tubo de ensayo, para obtener una
concentracin de 10-1
Concentracin 10
-1

Tomamos 1 ml de de agua
potable y lo llevamos al
tubo de ensayo

Muestra de agua
potable

9 ml de SSF

9 ml de SSF + 1 ml
de muestra

Se tomaron 3 muestras de un mililitro cada una y se depositaron cada una

de las muestras en un tubo de ensayo con 9 ml de caldo BRILLA, para
obtener una concentracin de 10-2.

Se toma 1 ml
de muestra
Concentracin 10
-2

Concentracin 10
-1

9 ml de caldo
BRILLA en cada
tubo

De la muestra de
solucin salina fisiolgica (10-1) se
tom 1 ml el cual se deposit en un tubo de ensayo que contena 9 ml de
solucin salina fisiolgica para obtener una concentracin de 10 -2.
Concentracin 10
-2

Tomamos 1 ml de
muestra

9 ml de SSF

Concentracin 10

9 ml de SSF + 1 ml
de muestra

-1

Finalmente se tomaron 3 muestras de 1 ml de la concentracin de SSF (10 -2)

y se depositaron cada una en un tubo de ensayo que contena 9ml de caldo
BRILLA, para poder as obtener una concentracin final de 10 -3 y poder
aplicar la tcnica de recuento del nmero ms probable.

Se toma 1 ml
de muestra
Concentracin 10
-3

Concentracin 10
-2

9 ml de caldo
BRILLA en cada
tubo

RESULTADOS
Concentracin 10
-1

Concentracin 10
-2

Concentracin 10
-3

De la tabla del Nmero ms probable, la combinacin 3,1,0 corresponde a :

40 bacterias/gr. de
muestra
COMENTARIOS

Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observa enturbiamiento,

acidez (detectada por un indicador colocado en el medio) y aparicin de gas en
la campana de fermentacin (campana de Drham), independientemente de su
cantidad. La produccin de gas se pone tambin de manifiesto por el
desprendimiento de pequeas burbujas que atraviesan el medio al agitar
suavemente el tubo. La ausencia del gas al cabo de 48 h
( 3 h) se considera como prueba negativa.

En este caso por la formacin de gas y enturbiamiento, se consideraron los

tubos e concentracin 10-1 y 10-2 como positivos mientras que los tubos de
concentracin 10-1 salieron negativos. Siendo el resultado final 3 / 1 / 0 lo que
en la tabla del nmero ms probable nos da 40 bacterias/gr. de muestra

En la muestra se detecto la presencia de coliformes totales ya que estos

fermentan la lactosa y producen cido y gas a 37C en un tiempo mximo de 48
horas.

Este mtodo esta basado en series de diluciones y clculo estadstico del

nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con
3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto.

CUESTIONARIO
1. Qu otras formas conoce, para realizar el mtodo del NMP?
Es una estrategia eficiente de estimacin de densidades poblacionales
especialmente cuando una evaluacin cuantitativa de clulas individuales no es
factible. La tcnica se basa en la determinacin de presencia o ausencia en rplicas
de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes
en muestras. Por lo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad
de poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es) en el medio de
crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrn
de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla
probabilstica.
Este nmero es calculado a partir de la observacin del crecimiento, tanto con la
aparicin de turbidez como con la formacin de gas, en cultivos en caldo
duplicados, inoculados con porciones de un ml de diluciones decimales de la
muestra. Las cifras que representan resultados positivos con crecimiento en tres
diluciones sucesivas, suelen denominarse nmero significativo.
Existen diversas formas de realizar este mtodo, en la prctica se realizaron
diluciones consecutivas (10-1, 10-2, 10-3) de las 1 ml de muestras en 9 ml de agua
pectonada (1%) en tres tubos, de los cuales se tomo para cada caso 1 ml de
dilucin y se le agreg a otros tres con caldo BRILA a concentracin normal. Otra
forma es transferirse de la muestra original 10 ml a los tres primeros tubos
conteniendo 10 ml de caldo BRILA doble concentrado, 1ml a los tres siguientes y
0.1 ml a los tres restantes; ambos a concentracin normal.
La muestra puede ser diluida ser seriadamente transfiriendo 1 ml a un tubo con 9
ml de caldo. Cada transferencia corresponde a una dilucin de 1 en 10. Se puede
dividir la placa petri en cinco zonas de igual tamao. Use una placa por cada
muestra. Rotule cada zona con el factor de dilucin a ser inoculado:

Transferir 5 l de la dilucin apropiada al rea correspondiente. Repita esta

operacin cinco veces por cada dilucin:

Permitir que el inculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa. Invierta
la placa e incube a 25C por 7 das.
Las muestras a analizar no solo son liquidas, muchas veces son slidas, en estos
casos suele agregarse 10 g de muestra en 90 g de agua, se agita y al sedimentarse
se trabaja con el sobrenadante, a partir de este se podr realizar las diluciones o
trabajar directamente como el procedimiento antes mencionado.
En algunos ocasiones realizar tres diluciones consecutivas no es suficiente, por lo
que es conveniente realizar las diluciones necesarias hasta obtener
resultados mas
2. Cules son las ventajas y desventajas del mtodo de NMP?
VENTAJAS:

La capacidad de estimar tamaos poblacionales basados en atributos

relacionados a un proceso (selectividad).

Provee una recuperacin uniforme de las poblaciones microbianas de suelos

diversificados.

Determina solo organismos vivos y activos metablicamente.

Suele ser ms rpido e igual de confiable que los mtodos tradicionales de

esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

Determina cargas microbianas baja, pero tambin pueden emplearse para

determinar cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

Presenta ventajas frente a otros mtodos para el caso de muestras como

polvos insolubles.

Preferible para microorganismos que presentan crecimiento lento o han sido

sometidos a condiciones adversas.

Es posible enumerar microorganismos

prereducidos, cubriendo con vaselina.

anaerbicos

utilizando

medios

DESVENTAJAS:

No detectan las poblaciones con menos de una clula por mililitro, slo
permite microorganismos viables.

3. Qu otras formas de lectura, permiten determinar tubos positivos en el

mtodo
de NMP?

Por pruebas presuntiva y prueba confirmativa done existe formacin de gas.

Formacin de cido.
Cambio de color (Verde brillante a verda celestino (verde nilo)).
Cambio de aspecto (transparencia a turbidez).

PRACTICA N 3
RECUENTO POR MEMBRANA FILTRANTE
ESQUEMA DE TRABAJO

RESULTADO
El anlisis del agua con el filtro mil poros se realizo con la muestra de agua potable.
Se observ que hubo formacin de colonias rosadas o sea hay presencia de
coliformes y como el nmero de colonias fue bastante, el cual no se poda contar
entonces por teora se considera que es mayor a 2000 UFC / 1 ml.

COMENTARIOS
Es un mtodo utilizado cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un
poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca
el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber
sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la
epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie
especficamente los cidos nucleicos).
Para hacer la lectura se debe de contar las colonias en las membranas. Los
resultados se deben expresar como unidades formadoras de colonias (u.f.c.) por mL
o por 100 mL de agua, considerando el volumen filtrado y el factor de dilucin.

CUESTIONARIO

1.- Cul es el fundamento del mtodo de la membrana filtrante?

Este mtodo de determinacin de coliformes se basa en la filtracin de un volumen
dado de muestra a travs de una membrana de steres de celulosa o de otra
sustancia. Todas las bacterias de la muestra quedan retenidas en la
superficie de la membrana, que a continuacin se incuba en medios de
cultivo apropiados y temperaturas adecuadas.
El nmero de coliformes presentes en la muestra se calcula en funcin del nmero
de colonias y del volumen filtrado.

2.- Cules son las ventajas y desventajas del recuento por el mtodo de
la membrana filtrante?
VENTAJAS:

Posibilidad de estudiar volmenes relativamente grandes de muestra.

Rapidez en la obtencin de resultados con respecto al mtodo clsico.
Economa de personal y material

DESVENTAJAS

No puede utilizarse con aguas muy turbias

Su empleo no esta indicado cuando la muestra de agua contiene poco

nmero de coliformes y gran nmero de microorganismos no coliformes
capaces de multiplicarse en el medio, ya que stos ltimos se extienden
sobre toda la superficie de la membrana e impide el crecimiento de las
colonias de coliformes.
3.- Porqu se dice que el mtodo de la membrana filtrante, es til para
determinar la eficacia de los desinfectantes utilizados en la
industria de alimentos.
El mtodo de la membrana filtrante es til por que nos va permitir determinar que
desinfectante utilizar y que cantidad agregar a un producto despus de
analizarlo y as de esa manera se podr determinar la eficacia que tiene
como desinfectante.
La correcta deteccin e identificacin de los microorganismos presentes en
muestras de alimentos a travs del mtodo de membrana filtrante es
imprescindible para determinar el origen de la contaminacin y seguir el curso de la
acciones correctivas a aplicar. Gracias al filtro por membrana se pueden utilizar
gran cantidad de muestra para realizar los anlisis y optar por un desinfectante
adecuado.

PRACTICA N 4
RECUENTO EN TUBO DE ANAEROBIOS SULFITO REDUCTORES
ESQUEMA DE TRABAJO
Tomamos como muestra agua potable de la cual extremos 1 ml de muestra y lo
llevamos a un tubo de ensayo que contiene 9 ml de solucin salina fisiolgica (SSF)
para obtener una solucin de concentracin 10-1.

Concentracin 10
-1

Tomamos 1 ml de de agua
potable y lo llevamos al
tubo de ensayo

Muestra de agua
potable

9 ml de SSF

9 ml de SSF + 1 ml
de muestra

Luego tomamos 1 ml de la solucin de concentracin 10 -1 y lo llevamos a otro

tubo de ensayo conteniendo 9 ml de ssf para obtener una solucin de
concentracin 10-2.
Concentracin 10
-2

Tomamos 1 ml de muestra y
lo llevamos al tubo de
ensayo

Concentracin 10
-1

9 ml de SSF

9 ml de SSF + 1 ml
de muestra (10-1)

Calentamos los medios de cultivo ( agar SPS y agar agua) hasta se fundan.

Luego colocamos en 2 tubos de ensayo limpios 1 ml de cada muestra de

concentracin 10-1 y 10-2 respectivamente. Luego procedemos a verter los
medios de cultivo ( agar SPS y agar agua) en cada tubo.

Concentracin 10

Concentracin 10

-1

-2

AGAR SPS

AGAR AGUA

Se deja solidificar y luego se lleva a incubar a 37 C por 3 das.

Se hace lectura contando la aparicin de colonias negras, las cuales indican la

presencia de anaerobios sulfito-reductores.

RESULTADOS

El nmero de colonias negras encontradas en el tubo de 10 -1 fue de 50, mientras

que el encontrado en el tubo de 10 -2 fue 1, a cada uno de estos nmeros se le
multiplico por el inverso de la dilucin (10 y 100 respectivamente). De lo anterior
podemos decir que en la dilucin de 10-1 se encontr un mayor nmero de bacterias.

NMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO

Tubo (10-1)
500 ufc/ml
Tubo (10-2)
100 ufc/ml

COMENTARIOS
Este mtodo nos permite determinar el nmero de microorganismos viables
presentes en alimentos, es til particularmente til para el recuento de
microorganismos anaerobios, tales como los clostridios sulfito-reductores.

CUESTIONARIO
1. Qu otros microorganismos se pueden enumerar mediante el mtodo
de recuento en tubo?
El recuento en tubo es una tcnica empleada para el anlisis de muestra que
supone una concentracin de microorganismos pequea. Es una estimacin de la
densidad de bacterias en el alimento; tiene como base estadstica la probabilidad
de obtener tubos con cultivos positivos conforme es menor el volumen de la
muestra inoculada.
Algunos microorganismos que se pueden enumerar mediante el recuento en tubo
son :

Clostridium
Clostridium
Clostridium
Clostridium

botulinum
argentinense
butyricum
baratii

2. Cul es la importancia de enumerar microorganismos anaerobio en

una muestra de alimento?
Es comn en el anlisis diario de alimentos llevar a cabo el recuento de
microorganismos anaerobios, sobre de los sulfito-reductores, como es el caso del
Clostridium botulinum, el cual es el de mayor peligrosidad para la salud.
La importancia de del recuento o la enumeracin de organismos anaerobios es que
cuando el nmero de microorganismos es significativo, puede indicar una incipiente
alteracin del alimento y en algunos casos, riesgos reales o potenciales de
intoxicacin.
3. A qu se debe el color negro de las colonias que aparecen en el medio
de cultivo?
El recuento de anaerobios sulfito-reductores se realiza en medio slidos que
contienen dos tipos de sustancias: una inhibidoras de la flora acompaante y otras

diferenciales para distinguir las colonias pertenecientes a este grupo de

microorganismos. Un medo muy utilizado es el agar SPS (agar sulfito-polimixinasulfadiazina). En este medio, las sustancias inhibidoras principales son la polimixina
y la sulfadiazina. Los productos que sirven para la diferenciacin son el sulfito
sdico y el citrato frrico.
Los microorganismos anaerobios sulfito-reductores reducen los sulfitos y forman
sulfuro de hierro, sustancia que precipita y da un color negro a las colonias.

PRCTICA N5
INVESTIGACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS
Esquema de trabajo
Enriquecimiento selectivo

Enriquecimiento no selectivo

Se lleva 1 ml de la muestra
anterior a 10 ml de caldo
selenito y a 10 ml de caldo
tetrationato verde brillante al
que se le aadi 0.1 ml de
solucin yodo yodurada.

Se pipete 25 ml de agua y se verti en

225 ml de caldo lactosado, luego se
incubo a 37 C x 8 h.

Aislamiento en medios slidos selectivos

Se incuba a 37C
por 24h.

caldo selenito
caldo tetrationato verde
brillante.

Se siembra cada cultivo en agar SS y agar

VRBA Mac Conkey por estra.

Se incuba a 37 C por 48 horas,

luego se hace lectura

En agar SS, las colonias rojas corresponden a las shigelas y en

agar VRBA las colonias rojas son Lactosa +

En agar SS, las colonias incoloras y transparentes corresponden a las

salmonellas y en agar VRBA las colonias transparentes son Lactosa -

IDENTIFICACIN
PRELIMEINAR
(Bioqumica presuntiva)

Se tom una colonia de la

placa anterior y se lo estro en
la superficie en un tubo que
contena TSI (Tres azucares
hierro: Glucosa, Lactosa y
sacarosa), luego se lo incubo
a 37C y luego se hizo la
lectura.

LACTOSA -

H2S +
G

GLUCOSA +

RESULTADOS

En la prctica se detecto la presencia de salmonellas por la formacin de

colonias transparentes , lo cual nos indicaba que la muestra estaba
contaminada.

En el caso de la salmonella el resultado fue: Lactosa - , glucosa +, H 2S + y gas

-.
El color negro que se formo indica la presencia de H 2S, ya que este reacciona
con el citrato de hierro y esto da el sulfuro de hierro que es de color negro.

En general Salmonella es negativa a las pruebas de lactosa y sacarosa, as como

generalmente producen H2S, pero existen variantes atpicas con reacciones
positivas a lactosa o no descarboxilacin de lisina

COMENTARIOS
Por lo general, se investiga la presencia o ausencia de salmonella en los alimentos y
no se hace recuento. La presencia es ya suficientemente significativa y cualquiera
que sea su nmero y el serotipo al que pertnezcan, conlleva al decomiso del
alimento.

Salmonella typhi

CUESTIONARIO
1. Qu alimentos que se consumen en nuestro medio, estn en
relacionados con
Salmonella?

Carnes frescas y productos derivados

Picadillos, embutidos, carnes curadas,(jamn, tocino).
Carne de aves
Tortas
Pasteles elaborada con huevos
Productos lcteos como leche fresca o fermentada, helados, quesos.

2. Cal es la importancia del enriquecimiento no selectivo en el

aislamiento de
Salmonella?

3. Cul es la importancia del enriquecimiento selectivo en el aislamiento

de
Salmonella?

4. De modo general, Cules son los pasos para el aislamiento e

identificacin de
Salmonella?

PRCTICA N6
INVESTIGACIN DE Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus
EN ALIMENTOS
Esquema de trabajo

Despus de incubar y sin

agitar el frasco, se transfiri
una asada de inculo a
partir
de
la
pelcula
(crecimiento superficial) a
dos placas de agar TCBS.
Se estri en 4 cuadrantes.

Colocar 25 ml o 25 g de la
muestra en 225 ml de APA al
0.5% de NaCl en APA al 3%
de NaCl. Luego se incuba a
37C por 12 horas.
APA

Agar
TCBS

Se incuba a 37C por 24 horas

y luego se hace lectura.

Las colonias con el centro de color

verde azuladas (sacarosa negativa)
pequeas, de bordes regulares y
filantes, indican la presencia de
vibrio parahaemolyticus.

Las colonias de color amarillo (sacarosa

positiva), grandes, de bordes regulares,
aspecto cremoso, ligeramente planas, con
centros opacos y periferie translcida,
indican la presencia de vibrio cholerae.

Bioqumica presuntiva
vibrio cholerae

LACTOSA +

SACAROSA +

GLUCOSA +

LACTOSA -

SACAROSA GLUCOSA +

Se tom una colonia de cada placa anterior y se lo estro en

la superficie en un tubo que contena TSI (Tres azucares
hierro: Glucosa, Lactosa y sacarosa), luego se lo incubo a
vibrio parahaemolyticus
37C y luego se hizo la lectura.

RESULTADOS
VIBRIO

vibrio parahaemolyticus

vibrio cholerae

Lactosa
Sacarosa glucosa +
H2S gas -

Lactosa +
Sacarosa +
glucosa +
H2S gas -

Estos dos vibrios son en general glucosa +, el vibrio cholerae, metaboliza la

sacarosa por lo que produce acidez y esto hace que cambie a color amarillo,
mientras que el vibrio parahaemolyticus no lo degrada, manteniendo as el color
rojo, siendo sacarosa -.
En ninguno de los dos se observa la formacin de gas (formacin de burbujas) o
la presencia de un anillo negro (presencia de H2S).

COMENTARIOS
Estos dos microorganismos son bacilos Gram negativos fermentativos
pertenecientes a la familia Vibrionaceae, con implicacin en diferentes procesos
gastrointestinales. Vibrio parahemolyticus (halfilo, facultativamente anaerobio),
constituye un claro riesgo en alimentos marinos que no han sufrido un tratamiento
trmico previo al consumo, siendo su hbitat las aguas litorales, peces y mariscos
de aguas templadas. La manipulacin inadecuada y los hnitos de consumo
previamente mencionados son factores conducentea a la aparcicin de
enfermedades.

CUESTIONARIO
1. Qu alimentos en nuestro medio estn relacionados con V. cholerae y
V.
parahemolyticus?

V. parahemolyticus
Alimentos crudos de origen marino; pescado de agua salada, mariscos, crustceos y
productos de la pesca.
V. cholerae

Todo tipo de aliementos

Verduras de tallo corto

Agua contaminada

2. Cules son las formas de contaminacin de los alimentos con V.

cholerae y V.
parahemolyticus?
El V. cholerae puede sobrevivir en los alimentos y en el agua el tiempo suficiente
para transmitir la enfermedad, adems de sobrevivir en alimentos refrigerados con
actividad de agua elevada. Una vez ingerido el alimento, las clulas de V. cholerae
se multiplican en le intestino delgado y producen la enterotoxina, la cual determina
que el revestimiento intestinal segregue grandes cantidades de fluido que se
excreta en forma de diarrea acuosa.
El V. parahemolyticus causa gastroenteritis debido al consumo de mariscos crudos o
insuficientemente cocidos, o mariscos apropiadamente cocidos contaminados
despus de su coccin.
3. Cmo explica el color que toma las colonias de V. cholerae y V.
parahemolyticus
en el agar TCBS?
El agar TCBS contiene un indicador que es el azul de brotimol, el cual se torna
amarillo cuando el medio se encuentra cido y verde cuando el medio es alcalino.
Para el caso de V. cholerae, el indicador se torno amarillo debido a que hubo
produccin de cido, mientras que para V. parahemolyticus se mantuvo en su color
verde.

4. De modo
son los pasos
aislamiento e identificacin de V.
cholerae y V. parahemolyticus?

general, Cules
para el

PRCTICA N7
DETECCIN DE ANTIBITICOS Y CONSERVADORES QUMICOS EN
ALIMENTOS

Esquema de trabajo
Embeber un disco en Bisulfito de sodio
Bisulfito de sodio

Discos

Colocar el disco con bisulfito de sodio en el centro de una placa conteniendo agar comn,
con la ayuda de una pinza estril.
Con bisulfito de sodio

Sembrar cada uno de los cultivos (salmonella, klebsiella y B. subtilis) con una sola estra en tres zonas diferentes
desde el borde del disco hasta el borde de la placa. (Este procedimiento se sigue para ambas placas)

salmonella

Klebsiella

Con Bisulfito de sodio

B. subtilis

Se incuban las 2 placas a 37 C por

24 horas y luego se hace la lectura

RESULTADOS
Salmonella

Con bisulfito de sodio

No pudo desarrollarse, el bisulfito tiene efecto sobre este microorganismo
(lo inhibe), por lo cual decimos que la salmonella no es resistente a este

klebsiella
B. subtilis

conservante.
Si se pudo desarrollar, el bisulfito permiti que se
podemos decir que este microorganismo es resistente
Si se pudo desarrollar, el bisulfito permiti que se
podemos decir que este microorganismo es resistente

desarrolle, de esto
a este conservante.
desarrolle, de esto
a este conservante.

COMENTARIOS

De la practica se puede concluir que la Salmonella es susceptible a la inhibicin

por presencia de bisulfito de sodio.
El liquido (bisulfito de sodio) embebido del disco depositado el medio de
cultivo, difundi en el agar y caus su accin inhibitoria.
En el caso de Klebsiella y B. subtilis, no se not ningn signo de alteracin de
crecimiento.

CUESTIONARIO
1. Cul es la importancia de determinar la presencia de antibiticos y
conservadores qumicos en alimentos.
La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes tipos de
microorganismos (bacterias, levaduras y mohos). El problema del deterioro
microbiano de los alimentos tiene implicaciones econmicas evidentes, tanto para
los fabricantes (deterioro de materias primas y productos elaborados antes de su
comercializacin, prdida de la imagen de marca, etc.) como para distribuidores y
consumidores (deterioro de productos despus de su adquisicin y antes de su
consumo). Se calcula que ms del 20% de todos los alimentos producidos en el
mundo se pierden por accin de los microorganismos. Por otra parte, los alimentos
alterados pueden resultar muy perjudiciales para la salud del consumidor. La toxina
botulnica, producida por una bacteria, Clostridium botulinum, en las conservas mal
esterilizadas, embutidos y en otros productos, es una de las substancias ms
venenosas que se conocen (miles de veces ms txica que el cianuro). Las
aflatoxinas, substancias producidas por el crecimiento de ciertos mohos, son
potentes agentes cancergenos. Existen pues razones poderosas para evitar la
alteracin de los alimentos. A los mtodos fsicos, como el calentamiento,
deshidratacin, irradiacin o congelacin, pueden asociarse mtodos qumicos que
causen la muerte de los microrganismos o que al menos eviten su crecimiento. En
muchos alimentos existen de forma natural substancias con actividad
antimicrobiana. Muchas frutas contienen diferentes cidos orgnicos, como el cido
benzoico o el cido ctrico. La relativa estabilidad de los yogures comparados con la
leche se debe al cido lctico producido durante su fermentacin. Los ajos, cebollas
y muchas especias contienen potentes agentes antimicrobianos, o precursores que
se transforman en ellos al triturarlos.
Los organismos oficiales correspondientes, a la hora de autorizar el uso de
determinado aditivo tienen en cuenta que ste sea un auxiliar del procesado
correcto de los alimentos y no un agente para enmascarar unas condiciones de
manipulacin sanitaria o tecnolgicamente deficientes, ni un sistema para
defraudar al consumidor engaandole respecto a la frescura real de un alimento.
Las condiciones de uso de los conservantes estn reglamentadas estrictamente en
todos los paises del mundo. Usualmente existen lmites a la cantidad que se puede
aadir de un conservante y a la de conservantes totales. Los conservantes
alimentarios, a las concentraciones autorizadas, no matan en general a los

microorganismos, sino que solamente evitan su proliferacin. Por lo tanto, solo son
tiles con materias primas de buena calidad.
2. Explique otro mtodo
antibiticos en los

usado

para

determinar

la

presencia

de

alimentos.
3. Cules son los antibiticos y conservadores qumicos ms usados en
alimentos?
Antibiticos
Con la excepcin de la nisina (E-234) todos los dems antibiticos quedan
reservados en la Unin Europea al uso mdico, prohibindose taxativamente su
utilizacin como conservantes alimentarios. Esto es as para evitar la aparicin de
cepas bacterianas resistentes y la posible alteracin de la flora intestinal de los
consumidores. El uso de antibiticos en medicina veterinaria est tambin
reglamentado para que no puedan llegar al consumidor como contaminantes de la
carne o de la leche.

Conservadores Qumicos

Conservador

Concentracin
efectiva

Alcoholes
cido propionico y
propionatos

variable

Acido srbico y sorbatos

0,2%

Esteres del cido phidroxibenzoico: metil, etil,

propil, butil y heptil steres
(parabenos o steres del
PHB)

variable

0,32%

Formaldehdo
Acido benzoico y
benzoatos

0,1%

Diacetato de sodio

0,32%

Acido lctico

variable

Dixido de azufre, sulfitos

200-300 ppm

Nitrito de sodio

200 ppm

Cloruro de sodio

variable

Azcar

variable

Ahumados

variable

Usos
Cosmtica
Agente antifngico en
panes, tortas, queso
Agente antifngico en
quesos, mermeladas, jugos
y tortas
Industria farmacutica,
cosmtica, alimentaria
Cosmtica: productos de
enjuague como shampoo
Agente antifngico en
margarina, sidra, bebidas
gaseosas.
Agente antifngico en
panes
Agente antimicrobiano en
queso, manteca, yogur y
pickles.
Agente antimicrobiano en
frutas secas, uvas, melazas
Agente antimicrobiano en
alimentos curados,
pescado
Previene el deterioro
microbiano en carnes,
pescado, etc
Previene el deterioro
microbiano en
mermeladas, jugos,
jaleas,etc
Previene el deterioro

microbiano en carnes,
pescado, etc