Biosensores

Por el Dr. Eduardo Cortón
Grupo de Biosensores y Bioanálisis
Pertenecemos al CONICET y a la FCEN, UBA
Formamos parte del Departamento de Química Biológica
Cooperamos con el INTI, la CONEA, y dos grupos en Canadá
y Madrid

Grupo independiente
El grupo realiza tareas de desarrollo y transferencia de tecnología,
investigación básica, divulgación científica, y docencia.
Lo componen 9 personas, entre investigadores, técnicos, estudiantes
doctorales y de grado.

1

Biosensores para Calidad de
Aguas
Durante la siguiente hora:
-Introducción
-Los biosensores, que son, ejemplos
-Características y ventajas de los biosensores
-Materiales biológicos utilizados
-Biosensores enzimáticos y microbianos
-Biosensores enzimáticos, aplicaciones
-Biosensores microbianos, aplicaciones, BOD y Toxicidad
-Sensores de alerta temprana en el contexto internacional
-El denominado “Proyecto Pilcomayo”
-Otros sistemas, otras aplicaciones

2

Introducción a los Biosensores
Señal
Bioquímica

Material
Biológico

u

u

Señal
Eléctrica

Transductor

Señal
Eléctrica

Amplificador

Procesado
y archivo

Los biosensores son instrumentos
analíticos basados en la respuesta de un
material biológico en estrecho contacto
con un transductor físico/químico, que
convierte la respuesta biológica en una
señal eléctrica.
La especificidad del reconocimiento
biológico permite que muchos de los
biosensores puedan operar en matrices
complejas (sangre, leche, aguas).
3

Precursor Histórico de los
Biosensores (Canary on a cage)

Debido a ello, se suele hablar actualmente de “canary on a
chip”, debido a la tendencia actual a los ensayos en
microvolumenes
4

Precursor Histórico de los
Biosensores
The Kemberton Colliery Mines Rescue Brigade 'C' Team,
photographed in front of the Rescue Station in 1914. The man
on the left is carrying a canary in a cage to detect carbon
monoxide after a fire or explosion - canaries were used simply
because their yellow colour made them easier to see in semidarkness underground - otherwise sparrows or any other
small birds, which were equally sensitive to the effects of gas
would have been just as effective! During WWI the sappers
tunnelling at the Western Front used canaries for gas
detection but they would trim the claws as it was discovered
that a canary could die of gas and the effects of rigor meant
that they would grip their perch and not fall off. If this
happened the miners/sappers might not notice the onset of
gas. The men are wearing 'Proto' breathing sets, developed by
Siebe Gorman & Co from the earlier 'Fleuss' apparatus.

(Madeley, Shropshire, England)
5

Los “Perros Espaciales”
Antes de que el hombre llegara al espacio, los científicos discutían si era posible sobrevivir en
ingravidez. Quizás la radiación a esas alturas fuese mortífera. 1948 USA envía los primeros
monos en V2s. La Unión Soviética emplea los denominados “Space Dogs”, envía unos 13 perros
en distintas misiones para ensayar los trajes presurizados. Abajo Laika en el Sputnik 2, en 1957.
Primer animal en orbita terrestre (pero su capsula no fue diseñada para ser recuperada…)

LAIKA
6

Ventajas de los Biosensores
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø
Ø

Permiten medir un analito sin purificación previa
Altamente específicos (enzimas), o mas o menos
inespecíficos (microbianos)
La información obtenida es mucho mas real que con
los métodos analíticos clásicos (biodisponibilidad)
Mediciones rápidas y equipos portátiles han sido
diseñados
La lista de posibles compuestos tóxicos en el
ambiente aumenta continuamente
Es necesario, entonces, sistemas analíticos de amplio
espectro, inespecíficos
7

Transductores y materiales de origen biológico más
utilizados
(Los materiales biomiméticos no son mencionados en esta tabla)

8

El Método de Inmovilización del Material
Biológico es Crítico

9

Materiales biológicos para
aplicaciones medioambientales
Enzimas, células enteras y anticuerpos son los materiales
biológicos más utilizados

10

Que pueden medir los
biosensores enzimáticos?
Los más importantes (+90%
mercado mundial) son los
que miden glucosa, usados
por diabéticos
Si se inmovilizan enzimas
“sensibles” a determinado
contaminante, este podrá ser
medido
Biosensores basados en la
inhibición de la acetil
colinesterasa detectan
insecticidas fosforados y
otros inhibidores

O2
CH2 OH
H

CH2 OH
O

H
OH

H

H

H
OH

OH
H

Glucosa
Oxidasa

H

O

OH

OH

Glucosa + O2

O
H
OH

H
H2 O2

OH

δ-gluconolact ona + H2 O2

11

Ejemplo de Biosensor Enzimático
u

PAAOs + PEG 400 + E - NH2
(entrecruzante)

u

GEL

Grupos amino de la enzima

El polietilendiglicidileter, una mezcla con un peso molecular promedio de 400
(PEG 400) entrecruza la enzima y el PAAOs obteniéndose un gel redox estable.

[

]m [
NH

Os
Enzima

]n
NH2

N
N

N
Os

Cl

N

PAAOs

N

Electrodo de trabajo
12

Biosensor para pesticidas basado
en inhibición enzimática

Acetilcolina: La acetilcolina es el neurotransmisor específico de las
sinapsis, tanto del sistema nervioso somático como en las sinapsis
ganglionares del sistema nervioso autónomo y en los órganos diana de la
división parasimpática. La síntesis de acetilcolina tiene lugar en el botón
terminal y es metabolizada por la acetilcolinesterasa en el espacio
sináptico

Los organofosforados y
carbamatos son inhibidores
de la colinesterasa, enzima que
cataliza la hidrólisis de los
ésteres del neurotransmisor
acetilcolina. Los
organofosforados se unen a la
acetilcolinesterasa e inhiben su
actividad de manera
irreversible, tanto en los
glóbulos rojos como en el
plasma, por lo cual su
restauración depende de la
síntesis de nuevas moléculas
de la enzima, a diferencia de
los carbamatos en los que esta
unión es reversible de manera
espontánea

13

Biosensor para pesticidas basado
en inhibición enzimática
La detección de cambios de pH muchas veces
no es útil, por ello la combinación con una
segunda enzima, como la colina oxidasa (que
toma la colina y la oxida, produciendo H2O2,
fácil de medir amperométricamente).

La acetilcolina es
degradada a colina y
acetato, por lo tanto el pH
de la solución circundante
se acidifica

S. Sotiropoulou et al., Analytica Chimica Acta, 530, 14, 2005, 199-204
Órganofosforado usado como insecticida.

14

Biosensores microbianos
Se los puede clasificar en dos tipos:
Específicos, en los que un gen reporter, (por
ejemplo lux) se activa en presencia de un activador;
se han descrito para Hg++, y algunos hidrocarburos

Inespecíficos, en los que el metabolismo
microbiano cambia por el conjunto de sustancias
que se encuentran en solución. BOD y Toxicidad

15

Ejemplo de biosensor microbiano
Celda de flujo utilizada en ensayos con
Lactobacillus
80

Electrodo de pH

Concentración de glucosa
0,0 mM
0,1 mM
0,5 mM
2,5 mM
10 mM
25 mM

60

∆ mV

Desperdicio
Carrier
Baño
termostatico

40

20

Cuentas de alginato
0
1

2

3

4

5

T / min

Velocidad de acidificación para distintas concentraciones de glucosa
16

Preguntas que puede responder
un biosensor inespecífico
¿Es la cantidad de materia orgánica la normal?
q ¿Hay elementos tóxicos en el agua?
q ¿Hay cambios en el análisis actual respecto a una
muestra control?
q

En algunos de estos ensayos el criterio de detección es
muy amplio, requieren confirmación, generalmente
mediante métodos de química analítica
instrumental en laboratorio.
17

Demanda bioquímica de oxígeno,
BOD5
a. Principle: The method consists of filling with sample, to
overflowing, an airtight bottle of the specified size and
incubating it at the specified temperature for 5 d. Dissolved
oxygen is measured initially and after incubation, and the BOD
is computed from the difference between initial and final DO.
Because the initial DO is determined shortly after the dilution is
made, all oxygen uptake occurring after this measurement is
included in the BOD measurement.
b. Sampling and storage: Samples for BOD analysis may degrade
significantly during storage between collection and analysis, resulting in
low BOD values. Minimize reduction of BOD by analyzing sample
promptly or by cooling it to near-freezing temperature during storage.
However, even at low temperature, keep holding time to a minimum.
Warm chilled samples to 20 ± 3oC before analysis.
18

Medición de BOD por el método estándar
Es problemático medir
varias muestras
simultáneamente
Sin sensor
electroquímico de
DO (oxígeno
disuelto) la titulación
consume mucho
tiempo
Muestras grandes,
diluciones intensivas

19

Mas inconvenientes del método
estándar para medir BOD
u Tiempo

de medición muy largo
u No se puede medir on-line (por lo tanto
incapacidad de tomar acciones
correctivas en plantas de tratamiento)
u Dificultad de producir equipos
portátiles para gestión medioambiental

20

Biosensor para Toxicidad
Biosensores
Microbianos
para la determinación de
toxicidad total están
basados en la
inhibición del
metabolismo, medido
como disminución de
la producción de luz en
bacterias luminiscentes,
disminución de la
respiración u otros
indicadores
metabólicos.

Biosensores Enzimáticos Basados
a)

b)

en dos principios básicos:
Utilizando una enzima que
degrada el tóxico que se quiere
medir. Por ejemplo, la enzima
polifenol oxidasa para medir
fenol
Utilizando la inhibición de la
actividad enzimática provocada
por diversos tóxicos en enzimas
sensibles; órgano fosforados y
carbamatos inhiben fuertemente
la acetilcolinesterasa
21

El Riachuelo. Muchas veces el efecto de
la contaminación no es tan evidente

22

Biosensores de Alerta Temprana, estado
de desarrollo a nivel mundial
u

Diferentes organismos son utilizados, desde bacterias a peces.

23

Sistemas (redes) de Alerta Temprana
funcionando en USA
ORSANCO–Ohio River Valley Water
Sanitation Commission.
Lower Mississippi River early warning system.
Delaware Valley early warning system.
Upper Mississippi River early warning system

Algunos usan biosensores basados en bacterias
(Microtox), otros basados en almejas, algas o
microinvertebrados.
Casi todos miden también parámetros físicoquímicos del agua, por ejemplo usando una sonda
multiparamétrica (temperatura, pH, oxígeno
disuelto y conductividad).
(BEWS) biological early warning systems
24

Los sistemas usados en otros ríos no
se adaptan a los grandes ríos
sudamericanos
Alta cantidad de sólidos en suspensión (Pilcomayo), lo que
impide el funcionamiento de cualquier sistema óptico, así
como dificulta la supervivencia de peces y almejas.

25

Pocos biosensores de toxicidad en el mercado
Bio-Sensor model 7008.

Algae Toximeter - Online
Biomonitoring Using
Green Algae

What These Fish Know
Can Hurt You!
Employing fish sensors,
the Bio- Sensor® detects
the presence of a broad
range of toxic substances.
Changes in ventilatory
behavior and certain
locomotor activities are
detected immediately
through noninvasive
electronic sensors in each
tank

Biological Monitoring, Inc. (BMI)
Virginia, USA

bbe Moldaenke GmbH
Alemania

26

Desarrollo de Tecnología, Grupo Biosensores
Proyecto Pilcomayo

Proyecto BOD
Biosensor para la determinación de
la Demanda Bioquímica de Oxígeno
Se desarrolla un método
electroquímico, para medir de
manera rápida el BOD. El método
se basa en la utilización de
compuestos mediadores (como el
ferrocianuro) que son reducidos
por el metabolismo microbiano, el
aumento de su concentración (en
su forma reducida) en el medio es
proporcional al BOD

Desarrollo y Construcción de un Sistema
Automático de Alerta Temprana para el Río
Pilcomayo.
Diseñar y construir un sistema que
permita monitorear en forma continua o
discontinua el estado general del agua de
ríos de la cuenca del Pilcomayo, que
permita detectar eventos anómalos,
básicamente el incremento de la
toxicidad por presencia de elevadas
concentraciones de metales pesados u
otras sustancias químicas.
Equipo:
Pablo Nuñez (estudiante Biología e Ingeniería),
Leonardo Cantoni ( Tecnólogo), Celina Bonetto
(Bióloga) y Eduardo Cortón (Director)
Patrocinado por la Subsecretaria de Recursos
Hídricos

Equipo:
Anahí Weinstock (Química), Dra. Liliana
Fraigi (Ingeniera Electrónica), Norberto
Mancuso (Químico) y Eduardo Cortón
FCEyN, UBA; INTA; DIRANSA (PYME)

25mV/s
50mV/s
100mV/s

40
30
20
10

µA

0
-10

5mV
ferro/ferri
cupla_B

-20
-30
-40
-50
-60
-70
-600

-400

-200

0

mV

200

400

600

27

Proyecto BOD
Tres diferentes enfoques para medir BOD rápida
1) Basado en biosensor potenciométrico de dióxido de carbono, con
comunidad microbiana mixta inmovilizada en membrana. Se ha
publicado, y el material especifico se encuentra en estudio por la
oficina de patentes del CONICET, evaluando su patentabilidad.
2) Basado en respirometría de ferricianuro. Se ha enviado un poster, se
esta preparando una publicación, y de acuerdo a los resultados se
considerará la posibilidad de protección
3) Basado en Celdas de Combustible Microbianas. Estudios a nivel
académico, acerca de las comunidades microbianas que colonizan los
electrodos y crecimiento de biofilms sobre electrodos.

28

Proyecto BOD
Basado en respirometria de ferricianuro
Se desarrolla un método electroquímico, para medir de manera rápida
el BOD. El método se basa en la utilización de compuestos
mediadores (como el ferrocianuro) que son reducidos por el
metabolismo microbiano, el aumento de su concentración (en su forma
reducida) en el medio es proporcional al BOD
Equipo:
Celina Bonetto, Natalia Sacco, Anahí Weinstock (Química), Dra. Liliana
Fraigi (Ingeniera Electrónica), Norberto Mancuso (Químico) y Eduardo
Cortón FCEyN, UBA; INTA; DIRANSA (PYME)
25mV/s
50mV/s
100mV/s

40
30
20
10
0

µA

-10

5mV
ferro/ferri
cupla_B

-20
-30
-40
-50
-60
-70
-600

-400

-200

0

mV

200

400

600

29

Proyecto BOD
Basado en sensor potenciométrico de dióxido de carbono

-62
-64
-66

-10
-64

-20

-68

-72

Y = -77.48 + 0.374 X
r2 = 0.991

-76

0

-68

Biosensor response (mV)

Biosensor response (mV)

-60

-60

Biosensor response (mV)

-58

10

20

30

40

50

-1

BOD 5 (mg L )

-70
-72
-74

-30
-40
-50
-60
-70

-76
-80

-78
0

50

100

Tim e (minutes)

150

200

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

-1

Glucose (m g L )

30

Orígenes y objetivos del
“Proyecto Pilcomayo”
u

u
u

Durante el año 2007, se realizan reuniones con el Ing. Claudio Laboranti y la Lic. Mariana Jakomin para analizar las
posibilidades existentes para un sistema de alerta temprana; las características esperadas/necesarias del biosensor se definen
con el Dr. Andrés Rodríguez y sus colaboradores durante los años 2009 y 2010, para el desarrollo y construcción de un sistema
de alerta temprana.
La cuenca trinacional del Río Pilcomayo es puede ser afectada por contaminación en la cuenca alta o media. Existe la necesidad
de conocer la calidad del agua en Misión La Paz.
Son requisitos que funcione de manera automática, analice y transmita datos, y pueda sobrevivir a condiciones extremas de
temperatura, así como a fluctuaciones en la provisión de energía eléctrica.

El proyecto empieza a
ser delineado.
¿Porque se necesita un sistema de alerta temprana?
ØLos ríos son vulnerables a eventos de contaminación
que (muchas veces) no son reportados.
ØLa detección temprana permite una respuesta temprana
por las Agencias Regulatorias, minimizando los daños y
sus costos asociados.
ØNo se puede gestionar un recurso sin conocerlo. Hasta
ahora la información disponible no es abundante.

31

El grupo “Pilcomayo”
Pablo Nuñez (estudiante Biología e Ingeniería)

Ø Diseño del software y firmware de los
dispositivos involucrados en el biosensor.
Ø Desarrollo y puesta a punto de técnicas de
fabricación in-house de circuitos impresos.
Ø Trabajo conjunto con Leonardo Cantoni en
la instalación y puesta a punto de las
instalaciones para comunicación.

32

El grupo “Pilcomayo”
Leonardo Cantoni
Desarrollos Electrónicos e Informáticos
•Sistemas de campo en ambientes extremos
•Adquisición, control y transmisión de datos.
•Experiencia en el área de Oceanografía Antártica (I.A.A.),
instrumental científico de laboratorio y de campo.
•Participación en proyectos multidisciplinarios nacionales e
internacionales .
•Experiencia Docente en el área de informática nivel
terciario (Prof. CON.SU.DEC)

33

El grupo “Pilcomayo”
Celina Bonetto (Bióloga)

Lic. Bonetto
María Celina

Microbiología: Elección de
cepa bacteriana sensible ante
la presencia de metales
pesados. Estudio de
condiciones de crecimiento
óptimas.
Bioensayos: Estudios de
metabolismo bacteriano
(respiración) empleando un
electrodo de CO2. Análisis de
muestras artificiales con
metales pesados. Análisis de
muestras de agua del Río
Pilcomayo.

34

Avances del Proyecto: Esquema en
Bloques

35

Avances del Proyecto: sistema
electromecánico
Ø
Ø
Ø

Diagramación del sistema electromecánico
Análisis de las opciones disponibles
Diseño preliminar
•Tanques de Reactivos
•Dispensers automáticos
•Sistema de movimiento de Sensores
•Cinta transportadora Muestras
•Recipientes de muestras
•Bacha de lavado y desagüe
•Sist. Lavado automático
•Sistema de Control y
transmisión de datos

36

Desarrollo de electrónica compatible
con proyecto Pilcomayo
. Hasta el momento se han utilizado placas ADC comerciales, principalmente de
National Instruments; si bien estas placas son perfectas para las etapas de
desarrollo, el costo de las placas ADC sumado al software propietario de
National Instruments hace necesario que su reemplazo por tecnología propia
Características técnicas de la placa ADC-Minicomputador, 16 canales
Computador monoplaca basado en el microcontrolador LPC2478 de NXP
(ARM7, 512KB Flash, 32KB SRAM, controlador LCD) con 16 MB de RAM
dinámica externa, slot para tarjetas SD/MMC, USB host y device (1 y 1),
bus CAN, Ethernet 10/100, puerto RS-232, conectores para interfaz a
través de I2C y SPI, conector JTAG, conector para display LCD (STN o
TFT). 16 canales de adquisición de 16-bits de resolución máxima, 125
kilomuestras por segundo (máximo). Pueden utilizarse sistemas
operativos GNU/Linux o FreeRTOS, además de firmware específico
desarrollado ad hoc para aplicaciones en particular. Aplicaciones posibles:
adquisición de datos (local y remota), automatización, control industrial,
robótica.
37

Desarrollo de electrónica compatible con
proyecto Mastitis y Pilcomayo

38

Avances del Proyecto: sistema de
adquisición y control
ØDiseño y armado de una microcomputadora basada
en placas industriales Intel para biosensor.
ØPrimera versión de una distro Linux para sistemas
embebidos optimizada para biosensor.
ØInterfaz con modem GSM/GPRS para transmisión
de datos y emisión de alertas via SMS.
ØInstalación y puesta en funcionamiento del foro y
del wiki de desarrollo con documentación del
proyecto. (Sólo uso interno de momento)

39

Avances del proyecto, selección de cepa
microbiana, transductor y ensayos
Elección de cepa bacteriana
Pseudomonas putida KT2440:
u Sensible a metales pesados como
Pb2+, Cr6+, Zn2+, Cd2+, Hg2+.
u Requerimientos nutricionales
medios, temperatura óptima 32 °C,
resistente a la liofilización, aerobia
estricta.

•P. putida es tan sensible como V. fischeri
a metales pesados.
•Condiciones de incubación y crecimiento
más sencillas para P. putida.

Tabla: Patrones de inhibición comparando el
crecimiento de V. fischeri y P. putida

40

Proyecto Pilcomayo

Incubación por 60 min
Figura 1. Esquema que muestra el flujo de la señal que proviene desde
las soluciones prueba (control y muestra). Se obtiene una grafica de E
(mV) vs. tiempo. Se utilizó una frecuencia de toma de datos de 1 Hz).

Concentraciones de 1,48 mg/l de 3,5diclorofenol son efectivamente
detectadas por el sistema de medición
como EC50. Estos valores presentan un
limite de detección menor a los
informados para ensayos que utilizan la
misma bacteria, pero diferente método
de detección y principio de
funcionamiento (análisis colorimétricos
y crecimiento, respectivamente, ISO
10712:1995 [1], que son de 21,4 mg/l.
Los resultados se presentan aquí luego
de 60 min de incubación y son
favorablemente comparables a los
valores publicados en la norma
internacional ISO 10712 que estipula

tiempos de incubación de 16 hs.
41

Futuro de la utilización de
biosensores en monitoreo ambiental
Ø

Ø

Métodos inespecíficos, BOD
y Toxicidad
Métodos específicos,
basados en genes reporters
o interacción antígeno anticuerpo

A portable biosensor called RAPTOR
Plus for detecting pathogens.
Antibody-coated, fiber-optic probes
are secured inside disposable
plastic cartridges in the center
hatch. Up to four target pathogens
can be detected simultaneously in
only 10 min.

Problemas:
Es necesario validar los
biosensores respecto a
métodos aceptados
Falta aceptación legal
acerca de su utilización
Limites de detección
relativamente altos
considerando
legislación ambiental
actual (poco sensibles
en general)
42

El proyecto y “nuestra visión”
El proyecto Biosensores utiliza un sistema de
monitoreo de calidad de agua específicamente
desarrollado para su utilización en aguas turbias,
como la de los grandes ríos sudamericanos. Incluye
la medición de parámetros físico-químicos del agua
en forma continua.

El proyecto es mucho más que
Biosensores; se desarrollan también
los sistemas de comunicación,
procesado y circulación de la
información vía WEB. Este podría
ser el comienzo de una Red Nacional
de Monitoreo Automático de
Calidad del Agua, siguiendo la
tendencia de los países más
industrializados.
43

Gracias por su tiempo!

44

Importancia de la medición de BOD
Efecto de diferentes
volúmenes de
descarga cloacal en
el curso de un río.
La descarga mayor
(inaceptable) no
puede ser depurada
por el ecosistema,
ocasionando
perjuicios (muerte de
peces y otros
organismos, perdida
de calidad del agua,
etc.).
45

Biosensor para BOD y Calibración
Biosensores. Las células se
inmovilizan utilizando
membranas de filtración
(similar a papel de filtro) u
otros métodos (geles) al
electrodo. La señal eléctrica
entregada por el electrodo
es medida y registrada en
forma continúa. Mediante el
agregado de patrones se
puede calcular la BOD de
una muestra incógnita. El
patrón es una mezcla
estandarizada de material
orgánico.
46

Método especifico, RAPTOR
A portable biosensor called RAPTOR Plus for detecting pathogens. Antibodycoated, fiber-optic probes are secured inside disposable plastic cartridges. Up to
four target pathogens can be detected simultaneously in only 10 min.

47

Limits of detection for toxins and pathogens using a 1010minute assay performed with RAPTOR
Hazard

Type and Limit of Detection

Staphylococcal enterotoxin B (SEB)
Ricin
Cholera toxin
Yersinia pestis F1
Bacillus anthracis
Bacillus globigii
Brucella abortus
Francisella tularensis
Giardia lamblia

Toxin, 1 ng/ml
Toxin 10 ng/ml
Toxin 1 ng/ml
Bacterial surface protein 10 ng/ml
Gram positive bacterium (vegetative form) 50 cfu/ml
Gram positive bacterium (spore) 5 x 104 spores/ml
Gram negative bacterium 7 x 104 cfu/ml
Gram negative bacterium 5 x 104 cfu/ml
Protozoan cysts 3 x 104 cysts/ml

48