UNIVERSIDAD DEL BO- BO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD Y DE LOS ALIMENTOS

DEPARTAMENTO INGENIERA EN ALIMENTOS

MANUAL DE PRCTICAS
DEL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA

Profesores: Juan Esteban Reyes Parra

Fabiola Cerda Leal

MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
LICENCIATURA EN NUTRICIN Y DIETTICA

NORMAS GENERALES
DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIN
El laboratorio de Microbiologa de Alimentos, es un lugar convenientemente habilitado donde se
estudia la microflora de inters para la seguridad, salubridad y/o vida til de los alimentos. En ste se
mantienen y manipulan principalmente bacterias y hongos, incluyendo cepas patgenas de los mismos,
lo que conlleva siempre un riesgo biolgico de contaminacin. Por esta razn, cuando maneje cualquier
tipo de muestra o cultivo microbiano deber tomar todas las precauciones destinadas a evitar la
contaminacin personal (manos y vestimenta) o del ambiente de trabajo (mesones, equipos, utensilios,
etc.).
Tambin deber tomar las precauciones necesarias para evitar lesiones con material cortante o punzante
(trozos de vidrio, bistur, agujas, etc.), quemaduras con objetos calientes o por la exposicin a la llama
de mecheros y vapor de agua, as como a la accin de agentes qumicos txicos y corrosivos.
En consecuencia y teniendo en cuenta que las actividades que se desarrollan en el Laboratorio de
Microbiologa son eminentemente prcticas, es necesario que considere las siguientes Normas
Generales:

PRESENTACIN Y SEGURIDAD PERSONAL

1. Ser obligatorio llevar puesto un delantal largo de algodn, que deber estar limpio, sin roturas y
correctamente abrochado. Igualmente, es obligatorio el uso de un gorro o pao que cubra
completamente el cabello.
2. Se prohbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
3. Se prohbe fumar, aplicarse cosmticos en el laboratorio, el uso de joyas voluminosas y pauelos o
bufandas al cuello.
4. Se deber lavar meticulosamente las manos con agua y jabn antes de retirarse del laboratorio.
5. Es recomendable mantener las uas limpias, cortas y sin pintar.
6. No deben substraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
7. Las personas con un elevado grado de sensibilidad debido a alergias, convalecencia, embarazo, etc.,
debern ponerlo en conocimiento del profesor a fin de adoptar una proteccin especial.

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
1. Al ingresar no toque o cambie de ubicacin el material dispuesto en los mesones. Espere las
instrucciones del profesor o ayudante.
2. Siempre trabaje en las proximidades de un mechero encendido, pero mantenga los productos
inflamables (etanol, isopropanol, xilol, etc), cuadernos y equipos de laboratorio a una distancia
prudente de ste. Los mecheros se debern apagar en cuanto dejen de utilizarse y deber asegurarse
que las llaves de paso queden bien cerradas.
3. Esterilice siempre a la llama del mechero el asa de cultivo y rastrillos de vidrio, antes y despus
de usar. Las asas de cultivo se esterizan calentndolas a la llama del mechero hasta que se pongan
al rojo vivo. Los rastrillos de vidrio se sumergen en una solucin de etanol al 70% y luego se
flamean a la llama del mechero.
4. No pipetear con la boca ningn tipo de cultivo microbiano, sin antes comprobar que las pipetas
estn provistas de un tapn de algodn hidrfobo.
5. Los tubos que contengan medios de cultivo o cultivo de microorganismos, nunca deben abrirse en
posicin vertical, sino lo ms horizontalmente posible; es decir, inclinados, pero evitando derramar
su contenido. Al quitarles la tapa se mantendrn inclinados con una mano y se abrirn con la otra,
que sostendr a su vez el asa o la pipeta y la tapa. Una vez abierto, se flamea por algunos segundos
la boca del tubo, repitiendo dicha operacin una vez realizada la siembra (la tapa nunca debe
dejarse sobre el mesn).
6. Cuando manipule microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la boca, nariz,
ojos, etc. Los lpices y rotuladores o cualquier otro material no bebern entrar nuca en contacto con
la boca.
7. Los medios inoculados o sembrados que se coloquen en las estufas de incubacin debern ir
adecuadamente rotulados, indicando: grupo, nmero de mesn, nombre del alumno, fecha y
procedencia o naturaleza de la muestra.
8. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al
terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente su lugar de trabajo. Cada grupo de
prcticas ser responsable de su zona de trabajo y del material proporcionado.
9. Todo el material usado (tubos de cultivo, pipetas, placas de Petri, porta-objetos, hojas de bistur,
etc.) se debe considerar contaminado. Por este motivo, debern colocarse en los contenedores
adecuados al finalizar la prctica para proceder a su esterilizacin antes de ser desechados o
lavados. Nunca los deje tirados sobre los mesones.
10. Se deber dar cuenta inmediatamente al profesor o ayudante de cualquier accidente tal como
quemaduras, cortes y/o derrame de cultivos.
11. En el caso de derrames de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deber conservar la
calma y adems informar al profesor o ayudante. El procedimiento a seguir es el siguiente: (i)
coloque papel absorbente sobre el material derramado para evitar su dispersin, (ii) ponga
abundante solucin desinfectante sobre el papel, (iii) deje transcurrir al menos 15 minutos, retire el
papel (usando guantes) y depostelo en el receptculo destinado a la eliminacin de material
contaminado, y (iv) vuelva a desinfectar la zona.

MANIPULE CON CUIDADO EL MATERIAL DE LABORATORIO

1. No someta a calentamiento excesivo el material de vidrio, con ello evitar trizaduras o roturas de
los mismos.
2. Todos los instrumentos o equipos, especialmente los aparatos delicados como lupas y microscopios,
deben manipularse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. Siempre deber
dejar limpios todos los equipos utilizados, las lentes de los objetivos debern limpiarse slo con los
lquidos y material suministrados. Informe cualquier irregularidad en el funcionamiento de los
equipos.
3. Evite exponerse en forma directa al aire caliente del horno Pasteur, al vapor a presin del autoclave
y a la llama del mechero Bunsen o de alta calora.
4. Manipule con extremo cuidado los reactivos inflamables (xilol, etanol, isopropanol, etc.) y los
cidos o bases fuertes (HCl y NaOH).
PRINCIPALES OBLIGACIONES DE LOS ESTUDIANTES
1. Concurrir puntualmente al laboratorio, prevenga con anticipacin cualquier eventual demora. No se
permitir el ingreso a alumnos atrasados.
2. Ser obligatorio concurrir al laboratorio con su delantal, gorro, manual de trabajos prcticos y un
lpiz para marcar vidrio (indeleble al agua).
3. Prepare cada sesin prctica con anticipacin, ya que ser evaluada en cada prctico. La
evaluacin no se referir exclusivamente a la informacin que aparece en el manual, sino tambin a
la aportada por el profesor y/o ayudante, as como a la de sus propias observaciones y/o
conclusiones.
4. Tome nota de las instrucciones que se den, pregunte si tiene alguna duda.
5. No comience a trabajar hasta estar seguro de lo que debe realizar.
ACTIVIDADES:
1. Se discutirn las principales normas de seguridad y obligaciones que debern tener en cuenta
durante su permanencia y trabajo en el Laboratorio de Microbiologa.
2. Se mostrarn los diferentes equipos, aparatos y materiales que se utilizarn en las sesiones
prcticas, destacando su funcionalidad y la forma apropiada de uso.
3. Se demostrar la forma apropiada de manipular cultivos microbianos contenidos en tubos y placas
de Petri.
4. Se discutirn los principales riesgos (biolgicos, fsicos y qumicos) a que estn expuestos sino
siguen las Normas Generales del Laboratorio de Microbiologa, destacndose la forma correcta de
proceder en caso de accidentes comunes.

PRCTICA N 1
MTODOS DE ESTERILIZACIN
(ANTISPTICOS Y DESINFECTANTES)
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIN
Los procesos de esterilizacin y/o desinfeccin son diariamente llevados a cabo, no solamente en el
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA, donde son fundamentales para evitar la contaminacin de
medios de cultivos, placas, utensilios, etc., sino tambin en otros mbitos tales como la INDUSTRIA
DE ALIMENTOS, donde fallas en estos procedimientos puede acarrear la disminucin de la vida til
de los alimentos debido a cambios organolpticos ocasionadas por el desarrollo de microorganismos
alterantes (sacarolticos, pectinolticos, proteolticos, lipolticos, etc); o bien, provocar toxi-infecciones
alimentarias por la presencia y/o desarrollo de microorganismos patgenos.
La presencia de microorganismos alterantes (saprfitos) y patgenos es comn en el ambiente de la
industria de alimentos. stos se pueden encontrar en el suelo, agua, aire, superficies de mesones,
equipos, utensilios materias primas vegetales y animales e incluso en el propio personal. Por esta razn,
es preciso conocer los mtodos ms comunes utilizados para controlar, inhibir o destruir
microorganismos, tanto en el laboratorio de microbiologa como en la industria de alimentos.
DEFINICIN DE TRMINOS
1.- Contaminacin microbiana: Se refiere a la presencia de agentes microbianos (biticos) en la
superficie del cuerpo u objetos inanimados (superficies de trabajo, equipos, utensilios, vestimenta,
etc.), incluyendo bebidas y alimentos.
2.- Esterilizacin: Es el proceso destinado a destruir toda forma de vida microbiana de un substrato
determinado, incluyendo las estructuras de resistencia producidas por ciertas bacterias (esporas).
Un objeto estril, en sentido microbiolgico, est libre de microorganismos vivos.
3.- Desinfeccin: Es proceso mediante el cual se inactiva o destruyen los microorganismos indeseables
(patgenos o alterantes) por medio de la exposicin directa a agentes qumicos. La desinfeccin no
implica necesariamente esterilizacin, ya que slo destruye las formas en desarrollo de los
microorganismos (clulas vegetativas) y no las esporas de bacterias.
4.- Desinfectante: Es un agente (usualmente qumico) capaz de matar las clulas vegetativas de los
microorganismos, pero no necesariamente sus esporas. Estos agentes, por su toxicidad, slo se
utilizan sobre objetos inanimados (nunca sobre tejidos vivos: piel o mucosas).
5.- Antisptico: Es un agente qumico que impide el crecimiento o la accin de los microorganismos,
ya sea destruyndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad. Por ser menos txicos se pueden
aplicar sobre tejidos vivos (piel y mucosas).
6.- Limpieza: Es el proceso de remover, por medios mecnicos y/o fsicos, el polvo, la materia
orgnica y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales, personal, etc. Las soluciones
limpiadoras generalmente contienen agentes alcalinos o cidos, con o sin detergentes, por ejemplo,

agentes tensioactivos no inicos. stas deben ser compatibles con la superficie que va a ser
limpiada, tener buena capacidad de humectacin y emulsificacin, adems deben ser capaces de
remover el tipo de suciedad presente sin dejar ningn tipo de residuo.
7.- Sanitizacin: Es el proceso destinado a reducir el contenido de microorganismos viables
remanentes en una superficie limpia. En la industria se emplea este trmino cuando se tratan, con
agentes qumicos o fsicos, las reas de produccin y los equipos empleados en la elaboracin de
productos, con el propsito de reducir el contenido microbiano hasta niveles insignificantes.
8.- Sanitarizante: Es un agente qumico que reduce la poblacin microbiana a niveles seguros (no
peligrosos). Se aplican a objetos inanimados de uso diario en la industria de alimentos; por
ejemplo, superficies de trabajo, equipos, recipientes y utensilios.
9.- Germicida: Es un agente que mata a los microorganismos, pero no necesariamente a sus esporas.
10.- Agente bactericida: Es un agente que mata bacterias. Afecta las clulas vegetativas, pero no
necesariamente a sus esporas, en forma tan grave, que no pueden continuar su reproduccin an
despus de retirada la sustancia.
11.- Agente bacteriosttico: Es un agente que impide o inhibe la multiplicacin de bacterias, mientras
permanece en contacto con ellas.
12.- Agente fungicida: Es un agente que mata hongos y sus esporas. Afectan a los hongos y sus esporas,
en forma tan grave, que no pueden continuar su reproduccin an despus de retirada la sustancia.
13.- Agente fungisttico: Es un agente que inhibe el crecimiento de los hongos, mientras permanece en
contacto con ellos.
14.- Agente virucida: Es un agente que destruye o inactiva virus.
15.- Agente esporocida: Es un agente que destruye o inactiva esporas.
16.- Valor D: Parmetro utilizado con el fin de evaluar los diferentes mtodos de esterilizacin. El valor
D corresponde al Tiempo de reduccin decimal, en otras palabras el tiempo requerido para que el
nmero de microorganismos sobrevivientes caiga a un 10% de la poblacin inicial. Tambin
entendido como, el tiempo necesario a una temperatura dada, para reducir en una unidad
logartmica la carga inicial de microorganismos presentes en la poblacin inicial.
17.- Valor Z: Parmetro utilizado con el fin de evaluar los diferentes mtodos de esterilizacin. El valor
Z corresponde a la temperatura requerida para reducir el 90% de los microorganismos en una carga
dada en un tiempo determinado. Tambin entendido como el incremento de temperatura necesario
para reducir el valor de D de un microorganismo en un 90%.
MTODOS DE CONTROL DE MICROORGANISMOS
Los microorganismos pueden ser controlados, inhibidos o eliminados por medio de agentes fsicos,
mecnicos o qumicos. Existe una gran variedad de tcnicas y agentes de control que actan de
maneras diferentes y cada uno presenta sus propias limitaciones. Por ello, su eleccin depende del tipo
de microorganismos que se desean eliminar y de las superficies o materiales sobre los cuales se va
aplicar.

I.- CONTROL POR MTODOS FSICOS

1.- ALTAS TEMPERATURAS
Los microorganismos mueren rpidamente cuando son sometidos a temperaturas superiores a su ptima
de crecimiento. Esto permite utilizar las altas temperaturas para eliminar microorganismos por
termodestruccin. Los mtodos basados en el calor son quizs los ms utilizados para controlar el
crecimiento microbiano, principalmente por su facilidad de controlar, bajo costo y efectividad. Las
altas temperaturas pueden ser aplicadas tanto como calor hmedo o seco. El calor seco destruye los
microorganismos principalmente por oxidacin de sus componentes intracelulares y se requieren
temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya
que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura
terciaria de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad, por
lo cual su accin se basa en la coagulacin del protoplasma celular.
A. -CALOR SECO
La esterilizacin por calor seco puede hacerse por incineracin (flameado) o mediante estufas de aire
caliente:

Incineracin (Flameado): Se emplea para esterilizar asas de siembra, pinzas, esptulas, etc.
Consiste en someter directamente a la accin de la llama del mechero Bunsen los utensilios que se
desean esterilizar. Este mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar
a objetos combustibles y termolbiles. En el caso del asa de siembre, el filamento de nicrom se
debe exponer a la llama hasta quedar al rojo vivo. En cambio, pinzas y esptulas previamente
deben ser sumergidas en una solucin de etanol (70% v/v), escurridas y flameadas a la llama del
mechero hasta la completa combustin del etanol.

Aire caliente (Horno Pasteur): Consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente
protegidos (envueltos en papel) para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de
un Horno Pasteur. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio (pipetas,
matraces, tubos, etc.) u otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten
estos materiales son muy elevadas (160-180C durante 2 horas) con el fin de asegurar la total
eliminacin de bacterias y sus esporas. Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar
preparados acuosos (como medios de cultivo: agares o caldos), ya que al llegar a los 100C
comenzaran a hervir con la consecuente evaporacin de su fraccin lquida. El material que se
desea esterilizar debe estar seco, envuelto y ordenado de tal manera que el aire caliente pueda
distribuirse homogneamente por todo el material. El tiempo de esterilizacin se tomar cuando el
horno alcance la temperatura de esterilizacin (160-180C). Antes de sacar el material del horno,
ste debe dejarse enfriar para evitar que se rompa por el cambio de temperatura.

B.- CALOR HMEDO

Ebullicin (Bao Mara): Consiste en poner el material en contacto con agua hirviendo (100C) por
un periodo no inferior a 10 minutos (comnmente entre 15 a 30 minutos). Tiene una accin
limitada, pues si es aplicado durante el tiempo sealado slo destruir las formas vegetativas de los
microorganismos, no destruir las esporas bacterianas que son termorresistentes (pueden soportar
hasta 3 horas a 100C). Este mtodo tiene una accin limitada, se utiliza slo con fines de
desinfeccin, cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos
ms eficaces. Usualmente se utiliza para la desinfeccin de utensilios, paos, recipientes o medios
de cultivos que no puedan esterilizarse en autoclave. Tambin se puede emplear en el control de
microorganismos presentes en el agua de consumo.
Una variante de esta tcnica es la Tyndalizacin, que consiste en someter el material a esterilizar
a bao Mara o vapor fluyente durante 3 das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en
los intervalos entre 2 tratamientos consecutivos. La muestra se somete a calentamiento (100C)
durante 30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas, pero no las esporas. Si
stas se encuentran presentes en la muestra germinan despus del calentamiento y luego sern
destruidas en los siguientes ciclos.

Vapor saturado a presin (Autoclave): Esta tcnica requiere el uso del autoclave, que basa su
accin en temperaturas elevadas y presin de vapor de agua. Tal combinacin permite esterilizar
con gran seguridad el material contaminado, principalmente medios de cultivos, fluidos
termoestables, material quirrgico y alimentos enlatados. Es uno de los mtodos ms eficaces de
esterilizacin, ya que destruye todos los microorganismos, incluyendo las esporas de bacterias. Los
parmetros de esterilizacin ms frecuentemente utilizada para esterilizar el material de laboratorio
son 121C//15 Lb/pulg2//15 minutos. En el caso de conservas depender del tipo de producto y de
su acidez; por ejemplo, para productos de baja acidez (pH >4.6) se aplica la coccin botulina
121C//15 Lb/pulg.2/2.52 minutos).

Instrucciones para usar el autoclave que se encuentra en el laboratorio de microbiologa

1.- Verifique que el nivel de agua sea el indicado. Si falta, agregue de preferencia agua destilada.
2.- Introduzca el material que va a esterilizar en forma ordenada y espaciada para que la distribucin
del vapor sea homognea.
3.- Tape el autoclave apretando las manillas en forma cruzada.
4.- Asegrese que la vlvula superior est abierta.
5.- Encienda el autoclave.
6.- Al alcanzar una temperatura de 80-90 C cierre la vlvula superior y, espere que alcance la
temperatura y presin de esterilizacin (121 C- 15 Lb/pulg.2). Una vez alcanzada la temperatura y
presin deseada tome el tiempo de esterilizacin (15 minutos).
7.- Al cumplir el tiempo de esterilizacin, apguelo. No abra hasta que la presin en el interior del
autoclave llegue a cero.

8.- Por ltimo, retire el material del autoclave. El material para desechar se debe vaciar en el recipiente
destinado para ese objetivo. En cambio, los medios de cultivos que se van a utilizar deben enfriarse
y guardarse en el refrigerador (2-8C).

Pasterizacin: Es un tratamiento de calor controlado, donde se emplean temperaturas inferiores a

la de ebullicin del agua, que se aplica a ciertos tipos de alimentos (vinos, cerveza, zumos, leche,
etc.) que no pueden ser tratados a temperaturas altas, pues podran perder algunas de sus
propiedades biolgicas u organolpticas (principalmente, destruccin de vitaminas). Su objetivo es
eliminar microorganismos patgenos y reducir la poblacin de microorganismos alterantes. No
puede ser considerado como un mtodo de esterilizacin, ya que no elimina la totalidad de los
grmenes presentes en el producto; adems las esporas de bacterias resisten los tratamientos
convencionales de pasterizacin. La temperatura seleccionada para el proceso de pasterizacin se
basa en el tiempo letal trmico representativo para los tipos ms resistentes de microorganismos
patgenos que debern ser destruidos mediante este procedimiento. Para la pasterizacin de la leche
se utilizan temperaturas de 62.8 C durante 30 minutos (Tratamiento LTLT: Low Temperatura,
Long Time) o 71.7C durante 15 segundos (HTST: High Temperatura, Short Time). Tambin se
pueden utilizar temperaturas superiores a la ebullicin del agua, pero durante unos pocos segundo;
por ejemplo, 148.9C durante 2-3 segundos (UHT: Ultra High Temperature). Los tratamientos
trmicos sealados permiten reducir considerablemente la carga microbiana total presente en la
leche cruda (alargando cono ello su vida til o comercial) y aseguran la destruccin de bacterias
patgenas comnmente vehiculadas por este alimento (Brucella spp, Staphylococcus aureus,
Mycobacterium bovis y Coxiella burnetti).

2.- RADIACIONES
A.- RADIACIONES IONIZANTES
Estas incluyen las radiaciones beta y X (producidas por electrones acelerados o rayos catdicos)
y las radiaciones gamma (producidas por radioistopos: 60Co). Estas radiaciones al ser absorbidas
por el agua y otros componentes celulares (cidos nucleicos, enzimas y lpidos) se ionizan, crendose
radicales libres que ocasionan daos, principalmente a nivel de ADN (mutaciones) y protenas
(enzimas), que conllevan a la muerte del microorganismo. A la esterilizacin mediante radiaciones
ionizantes se le denomina esterilizacin fra, ya que producen relativamente poco calor en el material
que se irradia.

Radiaciones (gamma): Las radiaciones gamma poseen un gran poder penetracin y, por lo
tanto, posee un elevado poder de destruccin de microorganismos; sin embargo, puede ajustarse la
dosis para producir efectos pasteurizantes o esterilizantes. La principal aplicacin industrial es para
la esterilizacin de materiales quirrgicos y otros equipos mdicos sensibles al calor y para la
preservacin de ciertos productos alimenticios. Las principales ventajas de estas radiaciones es que
pueden aplicarse sobre productos envasados y a temperaturas bajas. No obstante, posee algunas
desventajas, tales como: (i) altera algunas vitaminas (C, E, A y B 1), (ii) los alimentos pueden

adquirir un mal sabor debido a la generacin de radicales libres a partir de lpidos (rancidez
oxidativa), (iii) no destruye virus ni toxinas, (iv) tienen un costo elevado (requieren un riguroso
control e instalaciones especiales), y (v) presenta una baja aceptacin por parte de los
consumidores.

B.- RADIACIONES NO IONIZANTES

Radiaciones ultravioleta (U.V): La luz U.V es normalmente producida por la luz solar, pudiendo
adems ser obtenida por lmparas de mercurio de baja presin. El intervalo germinicida se ubica a
una longitud de onda entre 240-280 nm, pero su mximo poder letal se manifiesta 253.7 nm. La
luz U.V no produce ionizacin, sino que son absorbidas en forma especfica por protenas y cidos
nucleicos, donde excitan electrones y los elevan a niveles mayores de energa, creando diferentes
especies qumicas que producen alteraciones a nivel de protenas y cidos nucleicos, entre ellas la
formacin de dmeros de pirimidina adyacentes que inducen lecturas errneas del cdigo gentico,
produciendo mutaciones que impiden funciones vitales de los microorganismos y, por lo tanto, la
prdida de la viabilidad de las clulas (muerte celular). Este tipo de radiacin tiene una aplicacin
limitada como mtodo de desinfeccin, debido a su bajo poder de penetracin y a que las partculas
circulantes en el ambiente ejercen un efecto protector (absorben ellas mismas las radiaciones UV).
Su uso est principalmente dirigido a la desinfeccin ambiental (quirfanos, laboratorios, cmaras
de atmsferas controladas) y a la desinfeccin de superficies lisas, las que previamente deben ser
tratadas con un agente qumico (etanol o isopropanol al 70% v/v). Tambin puede ser aplicada para
la desinfeccin (potabilizacin) del agua de bebida. El tiempo de exposicin no debe ser inferior a
30 minutos.

II.- CONTROL POR MEDIOS MECNICOS

Filtracin: Consiste en el paso de un lquido, gas o aire a travs de una membrana o filtros
bacteriolgicos que tienen poros lo suficientemente pequeos para retener a los microorganismos
(0.22 m).

o
o Filtros de membranas: Son filtros de membranas de steres de celulosa, que se utilizan para
esterilizar soluciones que no pueden ser tratadas por calor (es decir, termolbiles), tales como la
urea, hidratos de carbono y antibiticos. Esta tcnica se aplica a un producto antes de envasar, por
lo que es imprescindible que el recipiente en que se va a recolectar o guardar est previamente
esterilizado. Esta operacin tiene las ventajas de poder realizarse a temperatura ambiente y ser
capaz de eliminar tanto los organismos vivos como los muertos presentes en una solucin.
o Filtros HEPA: Son filtros de aire de gran eficiencia que forman parte de las campanas o cmaras de
flujo laminar, donde se utilizan para filtrar el aire y as obtener un ambiente libre de polvo,
bacterias y hongos (incluyendo esporas).

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III.- CONTROL POR AGENTES QUMICOS

Existe una amplia gama de productos qumicos utilizados para reducir o eliminar microorganismos, ya
sea desde superficies inanimadas (desinfectantes) o tejidos vivos (antispticos). La accin
desinfectante o antisptica de los agentes qumicos se encuentra influenciada por los siguientes
factores:
1.2.3.4.5.-

Concentracin del agente.

Tiempo de exposicin.
Temperatura (a menor temperatura, menor es su accin).
pH.
Estado fisiolgico de las clulas (las clulas jvenes, metablicamente activas, son ms fcilmente
destruidas que las clulas viejas).
6.- Tipo de microorganismos presentes en el medio.
7.- Nmero de microorganismos presentes en el medio.
8.- Naturaleza del material que se encuentra presente junto con los microorganismos (por ejemplo, la
materia orgnica interfiere con algunos agentes).

Grados de resistencia de los microorganismos

Los diferentes microorganismos presenten diferentes gardos de resistencias a agentes fsicos y
qumicos, lo que radican en sus componentes de envoltura, o membranas (lpidos) y mecanismos de
resistencia que pueden ser inducidos por ejemplo, por estrs trmico o de acidez.
Representacin grfica de los grados de resistencia de diferentes tipos de microorganismos:
Mayor resistencia
Priones
Esporas bacterianas
Mycobacterium
Esporas de hongos
Virus pequeos
Hongos formas vegetativas
Bacterias vegetativas
Menor resistencia
Virus medianos

DESINFECTANTES Y ANTISPTICOS DE USO FRECUENTE

ALCOHOLES (etanol e isopropanol)

Los alcoholes desorganizan las bicapas lipdicas penetrando en la regin hidrocarbonada de los lpidos.
stos poseen una rpida accin bactericida, actuando sobre clulas vegetativas de bacterias Grampositivas y Gram-negativas, tambin actan sobre virus con envoltura. No tienen efecto sobre las

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esporas bacterianas, por lo que no son esterilizantes, sino ms bien son considerados como
desinfectantes de bajo nivel. Su actividad depende de la concentracin, siendo siempre ms efectivos
en soluciones acuosas al 70%, ya que necesitan agua para mejorar su efectividad puesto que sta le
permite penetrar mejor en las clulas y, adems retrasa la evaporacin y aumenta el tiempo de contacto,
permitiendo as la desnaturalizacin de protenas.
El etanol (alcohol etlico) se utiliza como antisptico de la piel (antes de inyecciones cutneas) y en la
desinfeccin de termmetros clnicos. En el laboratorio de microbiologa se utiliza para desinfectar
utensilios como pinzas, esptulas y asas de vidrio. stos se sumergen en etanol al 70% y seguido se
pasan por la llama del mechero (flamean) hasta la completa combustin del etanol.
El isopropanol (alcohol isoproplico) es menos voltil y ms efectivo que el etanol. Se emplea
igualmente en la desinfeccin de termmetros; sin embargo, su efecto txico (narctico) es mayor y
ms duradero que con el etanol. En el laboratorio de microbiologa se utiliza preferentemente para la
desinfeccin de superficies (mesones y plataforma de trabajo de la cmara de flujo laminar) y para
controlar salpicaduras o derrames de cultivos sobre superficies u objetos de trabajo.
Los alcoholes se inactivan en presencia de materia orgnica.

COMPUESTOS HALOGENADOS

Los compuestos halogenados son bactericidas muy potentes. As por ejemplo, el yodo no tiene
parangn como antisptico de la piel y el cloro no tiene igual en el tratamiento de aguas.
Los compuestos halogenados son agentes oxidantes que inactivan enzimas (protenas), convirtiendo los
radicales -SH en disulfuros -S-S. Adems, los ms potentes tambin atacan radicales amino, el grupo
indol (presente en el triptfano), y la tirosina.
Yodo: Es un bactericida muy eficaz, es el nico que acta contra todos los tipos de bacterias (Gram
positivas y Gram negativas), hongos y virus; tambin posee cierta actividad esporocida. Es un agente
oxidante dbil, pero en adicin a este efecto, se combina irreversiblemente con residuos de tirosina de
las protenas. Presentan ciertos inconvenientes, tales como: (i) precipita en presencia de protenas, (ii)
producen manchas en la ropa y piel, (iii) es irritante y alergnico, y (iv) retarda la cicatrizacin de
heridas, sobre todo si se aplica en forma continuada.
Sus principales presentaciones son la tintura de yodo y los iodforos.
La tintura de yodo, es una mezcla de 2% de I2 + 2% de IK en etanol al 70%. Es un magnifico
antisptico de la piel, de hecho el mejor de los conocidos, pero tiene un efecto doloroso y custico en
heridas abiertas.

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Los iodforos, son una mezcla de yodo con agentes tensioactivos (detergentes), formando as un
complejo que libera lentamente yodo orgnico cuando se diluye en agua. El yodo penetra fcilmente en
los microorganismos a travs de sus membranas celulares, destruyendo las protenas. Son bactericidas
de potencia intermedia, su actividad es menos intensa que la de la tintura de yodo y menos rpida, pero
si se deja el tiempo suficiente afecta a formas vegetativas de bacterias, hongos, virus y esporas en
menor grado. Su actividad se reduce en presencia de sustancias alcalinas y materia orgnica. Son
corrosivos para los metales. El ms conocido de los yodforos es la povidona-yodada (compuesto de
yodo y polivinil-pirrolidona), que contiene entre un 9 y 12% de yodo disponible. Se utilizan
preferentemente como antisptico de la piel y mucosas, y lavado de manos antes de intervenciones
quirrgicas. Tambin se emplean en la desinfeccin de instalaciones de industrias de alimentos.
Cloro y compuestos clorados: El cloro se presenta bajos las formas de Cl2 (gaseoso), hipocloritos y
cloraminas. El efecto desinfectante se debe a la liberacin de cloro libre (Cl2), que reacciona con el
agua para dar cido hipocloroso, que a pH cido o neutro es un oxidante fuerte.
El cloro es activo contra la mayora de las clulas vegetativas de bacterias y sus esporas, virus y
hongos. Acta por oxidacin de los componentes celulares.
El cloro gaseoso, a 1-3 ppm, se usa para la potabilizacin de aguas para bebida y piscinas.
Los hipocloritos de sodio, de calcio o de litio se utilizan para la desinfeccin de frutas y hortalizas (50200 ppm). Tambin se emplea como desinfectante/sanitizante (300-500 ppm) de baos, pisos, paredes,
superficies, equipos y utensilios de hospitales, laboratorios e industrias de alimentos. Como el cloro se
inactiva con la materia orgnica, primero habr que limpiar con agua y jabn, enjuagar abundantemente
y posteriormente, desinfectar. Las superficies (excepto pisos y paredes), equipos y utensilios tratados
necesitan ser nuevamente enjuagados.
Los hipocloritos son baratos y de accin rpida. Sin embargo, se ha de tener en cuenta que son
desinfectantes que deterioran los metales (corrosivos), que se inactivan fcilmente en presencia de
materia orgnica, son relativamente inestables y su eficacia se ve afectada por el pH. Adems,
interaccionan con otras sustancias qumicas (soluciones cidas y de amonio), produciendo vapores de
cloro que son muy irritantes para la piel y mucosas. No se deben utilizar en combinacin con
formaldehdo, ya que esta combinacin es altamente carcingena. Su ingestin provoca graves lesiones
en la mucosa esofagogstrica.
El dixido de cloro (ClO2), es otro derivado del cloro que est siendo ampliamente utilizado en la
industria de alimentos. ste no presenta los problemas del hipoclorito de sodio, como generar derivados
halogenados y reaccionar con compuestos nitrogenados, y en contacto con material proteico no forma
cloraminas, ni cidos trihalometanos o haloacticos. El tratamiento de alimentos (frutas, hortlizas y
canales de aves y animales de abasto) con dixido de cloro aumenta su vida media til o comercial, sin
alterar su calidad organolptica ni nutricional. Es soluble en agua y su accin no es afectada por
valores altos de pH. El dixido de cloro es un potente germicida, en comparacin con el cloro acuoso
posee un poder desinfectante siete veces superior y una capacidad oxidativa 2.5 veces mayor. Debido a
las ventajas que presenta sobre los hipocloritos, en los ltimos aos, su uso se ha extendiendo a la
industria de alimentos. Actualmente sus aplicaciones incluyen: (i) la desinfeccin de superficies
ambientales y equipos, incluyendo aquellos que entran en contacto directo con el alimento procesado;

13

(ii) lavado y sanitizado de sistemas CIP; (iii) lavado y sanitizacin de frutas y verduras; (iv)
tratamiento del agua en la industria avcola; (v) fabricacin de hielo para conservacin de pescados y
mariscos; y (vi) sanitizacin de canales de pollo, cerdo, vacuno y subproductos de mataderos.

COMPUESTOS DE AMONIO CUATERNARIO

Los compuestos de amonio cuaternario (conocidos como "quats") son esencialmente sales de amonio
con algunos o todos los tomos de hidrgeno del in (NH4)+ substituidos por grupos tipo alquilo de
complejidad variable. Son detergentes o tensioactivos catinicos que actan, principalmente, a nivel de
la superficie celular, donde producen la desorganizando (rotura) de las membranas fosfolipdicas, lo
que se refleja en el incremento de su permeabilidad, con la consiguiente salida de componentes
citoplasmticos. Posteriormente, la entrada del detergente produce un efecto secundario de
desnaturalizacin de protenas.
Son los detergentes ms potentes en cuanto a su actividad desinfectante. El cloruro de benzalconio fue
el primer compuesto comercial de este tipo introducido en el mercado. Tiene una buena actividad
antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas, pero es menos efectivo sobre bacterias Gramnegativas, particularmente contra Pseudomonas, la cual incluso puede crecer en las soluciones de estos
productos. Tambin presentan actividad fungicida y virucida sobre virus con envoltura, pero sta es
escasa frente a virus sin envoltura y casi nula frente a esporas bacterianas, aunque previene su
germinacin. Factores como la dureza del agua y restos proteicos interfieren en su actividad y reducen
su eficacia. No obstante, los amonios cuaternarios denominados de segunda generacin (por ejemplo,
el cloruro de etilbenzilo) y de tercera generacin (por ejemplo, el cloruro de dodecil dimetil amonio)
son compuestos que permanecen activos en presencia de agua dura.
Los compuestos de amonio cuaternario son considerados como desinfectantes de bajo nivel y
comnmente se utilizan en la industria de alimentos para la desinfeccin y/o sanitizacin de
superficies, paredes y pisos (utilizndose a concentraciones del 0.4 a 1.6%).

BIGUADINAS (Clorhexidina 2-4%):

La clorhexidina es uno de los antispticos de la piel y mucosas ms utilizado. Su espectro de accin

incluye bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (pero su actividad es menor frente a bacterias
Gram-negativas), hongos y virus con envoltura. No es esporicida, aunque inhibe la germinacin de las
esporas. Su mecanismo de accin se basa en la alteracin de la permeabilidad de la membrana celular y
precipitacin de protenas y cidos nucleicos.
Posee una accin germicida rpida y una duracin prolongada, gracias a que esta sustancia tiene gran
adhesividad a la piel, por lo que sus efectos antimicrobianos permanecen hasta 6 horas despus de su
uso. Su actividad se reduce por alteracin de pH (actividad mxima a pH 5,5-7), dilucin con agua
corriente, jabones con aniones orgnicos o inorgnicos. La presentacin ms comn contiene un
detergente como base y un 4% de clorhexidina, y se utiliza para el lavado de manos del personal de

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hospitales, laboratorios de microbiologa e industrias de alimentos. Tambin est presente en enjuagues

bucales y pastas dentales.

COMPUESTOS FENLICOS

El fenol se ha considerado clsicamente como el antisptico y desinfectante estndar con el que se ha

comparado la actividad de otros germicidas (coeficiente fenlico). Los derivados fenlicos inducen una
alteracin de la permeabilidad de la membrana citoplasmtica, lo que produce una progresiva salida de
constituyentes intracelulares, que finalmente provoca la lisis y la destruccin microbiana. Los fenoles
poseen actividad bacteriosttica o bactericida (segn la concentracin), fungicida y virucida, pero en
general no esporicida.
Los derivados fenlicos utilizados como antispticos se encuentran en 2 grupos: bifenoles y
halofenoles. No obstante, solo se mencionar el triclosn, que se ubica dentro de los bifenoles.
Triclosn (Tricloro-hidroxidifenil-eter): Es muy activo frente a bacterias Gram positivas y Gram
negativas, excepto Pseudomona aeruginosa y otras especies de Pseudomonas. Su eficacia contra
bacterias Gram negativas y levaduras puede incrementarse al asociarse con EDTA, ya que aumenta la
permeabilidad de la membrana externa. En estudios con E. coli, se ha demostrado que el triclosn a
concentraciones subinhibitorias inhibe el consumo de nutrientes esenciales, mientras que
concentraciones ms elevadas producen la liberacin de componentes celulares y muerte celular. El
triclosn se presenta en jabones a una concentracin entre 0.2-0.5 %. Se usa principalmente como
antisptico para el lavado de manos de tipo clnico, de laboratorios y en la industria de alimentos.

AGENTES OXIDANTES

Perxido de hidrgeno (H2O2):

El agua oxigenada es activa frente a bacterias vegetativas, hongos, virus y esporas bacterianas segn la
concentracin y condiciones de utilizacin. Su actividad germicida se debe a la destruccin de las
membranas celulares, DNA y otros componentes celulares esenciales. Los preparados comerciales
suelen contener concentraciones entre el 3-6% (10-20 volmenes). Se inactiva rpidamente en
presencia de materia orgnica, luz y contacto con el aire. La forma oxidante activa no es el perxido de
hidrgeno como tal, sino el radical hidrxilo libre formado por su descomposicin. Las soluciones
estabilizadas de agua oxigenada, del 10 al 25%, se utilizan como agentes esporicidas en la desinfeccin
de materiales especiales (implantes de plstico, lentes de contacto y prtesis quirrgicas).
En la actualidad existen en el mercado sistemas cerrados que utilizan perxido de hidrgeno en forma
de vapores como alternativa para desinfeccin y esterilizacin de endoscopios. Estos aparatos utilizan
ciclos que oscilan entre 20 y 25 minutos a temperaturas bajas (25-50C) y alcanzan una concentracin
final de 1-2 mg/L de H2O2. Una de las ventajas fundamentales es que no producen residuos txicos.

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Su uso ms frecuente est asociado con la limpieza y antisepsia de heridas; adicionalmente, se est
estudiando su aplicacin como sanitizante de frutas y hortalizas mnimamente procesadas.
Ozono (O3):
El ozono es una molcula de oxgeno triatmica altamente inestable, que es formada por la unin de
una molcula de oxgeno diatmico (O2) a un tomo de oxgeno. Este es producido por la disociacin
de las molculas de oxgeno cuando stas son sometidas a una fuerte descarga elctrica. La molcula de
ozono es uno de los oxidantes ms poderosos que se conocen despus del fluoruro, con una velocidad
de reaccin tres mil veces superior a la del cloro. El ozono acta como un agente fuertemente oxidante,
que lo hace muy efectivo para destruir microorganismos (bacterias, hongos, virus y protozoos). Es ms
efectivo que el cloro, por ello su uso en soluciones acuosas est siendo evaluado como desinfectante
(sanitizante) de frutas, hortalizas, canales de pollos y animales de abasto. Este agente posee varias
ventajas, por ejemplo: (i) slo agrega oxgeno a los compuestos orgnicos, por lo que pocos
compuestos formados se consideran dainos para la salud; (ii) posee un amplio espectro microbiano;
(iii) elimina olores y sabores extraos del agua; (iv) no libera compuestos txicos al ambiente; (v)
remueve compuestos orgnicos tales como pesticidas, detergentes y fenoles; y (vi) no se requiere de un
enjuague posterior a su aplicacin. No obstante, presenta algunas desventajas, entre las que destacan:
(i) su gran inestabilidad, su reaccin es difcil de predecir en presencia de materia orgnica; (ii) su
efecto antimicrobiano se ve afectado a pH bsico; y (iii) es txico a bajas concentraciones ( 1 ppm),
produce irritacin de las vas nasales, ojos y garganta.
La accin antimicrobiana del ozono se basa en su gran poder oxidativo, siendo la superficie celular el
primer blanco de su actividad (cambia la permeabilidad celular), provocando la lisis celular. En
segundo lugar, daa en el material gentico debido a los cambios que provoca en las bases pirimdicas.

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Tabla resumen de diferentes mtodos de esterilizacin y sus ventajas y desventajas:

Mtodo
Autoclave a vapor

Ventajas
Limitaciones
- Ciclos ms cortos. Menor costo de operacin. -Mtodo no compatible con material termosensible.
- Efectivo frente a la eliminacin de priones.
-No elimina pirgenos.
- No presenta toxicidad para el personal ni para el-No esteriliza sustancias oleosas ni polvos.
ambiente.
- Certificable.
Calor seco
- Equipamiento de menor costo que el autoclave - Dao del material por exposicin a temperaturas
- Facilidad de operacin de los equipos
elevadas.
-Tiempos de exposicin prolongados en
comparacin con la esterilizacin a vapor.
- Dificultad en la certificacin del mtodo.
- Costos de operacin elevados.
- No hay informacin respecto a su efectividad
contra priones
Oxido de etileno
- Permite la esterilizacin de material
- Requieren perodos prolongados de proceso y
termosensible
aireacin.
- Certificable
- No es un mtodo efectivo contra priones Txico
para el personal, pacientes y ambiente
Plasma
- Baja temperatura.
- Incompatibilidad con algunos materiales.
- Ciclos de corta duracin.
- Controversia respecto a utilizacin en artculos
- No txico para las personas ni para el
con lmenes largos entre 1 y 2mt. y angostos
ambiente.
(entre 1 y 3mm).
- No requiere instalaciones especiales
- No elimina priones
Acido peractico
- Rpido
- Slo puede ser utilizado en material sumergible
lquido
- Efectivo en la esterilizacin de endoscopios y - Esteriliza un solo contenedor por ciclo por lo que no
laparoscopios
puede ser utilizado para cantidades mayores de
- Equipo automtico estandarizado
material No elimina priones
- No contamina al medio ambiente
- Debe ser utilizado en forma inmediata
Formaldehdo
- Baja temperatura.
- Incompatibilidad con algunos materiales.
- Ciclos de corta duracin.
- Mtodo no aprobado para su utilizacin en USA
- Certificable
- No elimina priones
Fuente: NORMA GENERAL TECNICA SOBRE ESTERILIZACION Y DESINFECCION DE ELEMENTOS CLINICOS.
REPUBLICA DE CHILE. MINISTERIO DE SALUD (2001).

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ACTIVIDADES:

SESIN I: Determinar la presencia de microorganismos en piel y mucosas, as como en el

ambiente del laboratorio.

1.- Exponga una placa de Petri con Agar Nutritivo (abierta/sin tapa) al ambiente del laboratorio
durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo, tape la placa e incbela a 35C durante 48 h. Como
control, incube una placa con el mismo medio de cultivo, pero No exponga al medio ambiente.
2.- Coloque una placa Petri con Agar Nutritivo a una distancia aproximada de 30 cm de su boca y
estornude vigorosamente sobre ella. Tape la placa e incbela a 35C durante 48 h. Como control,
repita la experiencia, pero antes cubra su boca con una mascarilla.
3.- Abra una placa de Petri con Agar Papa Dextrosa y sacuda su cabello sobre ella. Desinfecte sus
manos con antisptico disponible en el Laboratorio y tome dos a tres cabellos de 3 compaeros,
dispngalos sobre la e incbela a 25 + 2C durante 5 das.
4.- Utilizando una trula estril, tome una muestra de las fosas nasales de un compaero y extindala
sobre la mitad de una superficie de Agar Nutritivo (contenido en una placa de Petri), invierta el
proceso de toma y siembra con su compaero, sembrando en la otra mitad de la placa Petri. Incube
la placa a 35C durante 48 h.

SESIN II: Determinar el efecto de agentes de control microbiolgico.

1.- Efecto del lavado de manos con jabn que contiene triclosn como agente antisptico
Utilizando un lpiz marcador divida en cuatro una placa de Petri con Agar Nutritivo. Luego,
humedezca el dedo pulgar de su mano derecha con una solucin de suero fisiolgico y frtelo con su
dedo ndice durante 15 segundos, seguido imprima la huella de su dedo pulgar sobre una de las
fracciones de la placa. Seguido, lave sus manos slo con agua y deje secar a ambiente, luego imprima
la huella de su dedo pulgar en el cuadrante contiguo de la placa. Otro compaero lavar sus manos con
agua y jabn, secando a ambiente, imprimir su huella en el tercer cuadrante de la placa. Por ltimo, se
realizar un lavado completo de manos, que considera la aplicacin de antisptico, secado al aire y
luego impresin de la huella del pulgar en el ltimo cuadrante de la placa. Incube la placa a 35C
durante 48 h.
2.- Efecto de la radiacin U.V
Se le proporcionara dos tubos que contienen un cultivo de Escherchia coli y de Staphylococcus aureus
a una concentracin aproximada de 108 clulas/ml. Utilizando un hisopo de algodn estril siembre la
mitad de una placa de Agar Nutritivo, con cada uno de los cultivos disponibles. Levante la tapa y cubra
la mitad con papel de aluminio. Exponga la placa abierta bajo una lmpara de luz U.V. durante 5
minutos. Transcurrido este tiempo, quite el papel de aluminio, cierre la placa e incbela a 35C durante
48 h. El mesn contiguo del Laboratorio realizar la misma operacin de siembra, pero cubrir la mitad
de cada cultivo sembrado con la misma tapa de la placa sobrepuesta. Expondr la placa abierta bajo una

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lmpara de luz U.V. durante 5 minutos y luego tapar en la forma que corresponde e incubar las
siembras para luego comparar ambos resultados.

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PRCTICA N 2
MEDIOS DE CULTIVO
________________________________________________________________________________
INTRODUCCIN
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que
crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. En este contexto, los
alimentos, los ambientes sucios y las heridas podran considerarse como medios de cultivos, pero
como medios de cultivos naturales. No obstante, en el laboratorio de microbiologa, cuando se habla
de medios de cultivo se hace referencia a medios de cultivos artificiales; es decir, de aquellos que han
sido formulados para satisfacer las necesidades nutritivas especficas de los microorganismos que se
desean investigar. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es inmensa, la variedad
de medios de cultivo es tambin muy grande.
En general, los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categoras:
(i) fsicos, donde se incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica y, (ii) qumicos, que
comprenden los elementos nutritivos (fuentes de C y N), las sustancias minerales, el oxgeno y
determinados factores orgnicos de crecimiento (por ejemplo: vitaminas y/o aminocidos).
La mayora de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es necesario
rehidratar y esterilizar segn las especificaciones del fabricante. La mayora (salvo contadas
excepciones) se esterilizan en el autoclave, pero algunos suplementos termolbiles se deben esterilizar
por filtracin y se aaden al cultivo previamente esterilizado y atemperado a 50C. Una vez sembrados
o inoculados, deben ser incubados a temperatura y condiciones atmosfricas adecuadas.
En la prctica, la funcin de los medios de cultivos es aportar un substrato que permita:

Cultivar, aislar, seleccionar e identificar microorganismos (principalmente: bacterias, mohos y

levaduras).
Obtener cantidades apreciables de microorganismos con fines industriales; por ejemplo, para la
mantencin de fermentos lcteos o la obtencin de enzimas bacterianas.
Mantener cepas de microorganismos por tiempos prolongados (ceparios).
Aunque existe una gran variedad de medios de cultivos artificiales, cuya formulacin vara segn su
uso, todos deben contener los siguientes nutrientes o elementos bsicos:
Una fuente de carbono (glucosa, sacarosa, almidn u otro azcar asimilable).
Una fuente de nitrgeno (extracto de carne, peptona de casena o peptona de soja).
Una fuente de fsforo (P) y azufre (S).

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 Elementos trazas como Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.

Tampones (sales que mantienen el pH dentro de un rango ptimo, tales como fosfatos bisdicos o
bipotsicos)
Adicionalmente, los medios de cultivos slidos o semi-slidos contienen un agente gelificante, agaragar, que es un polisacrido obtenido de ciertas algas marinas (polimeros de cido galacturnico). En
el caso de los medios de cultivo selectivos, stos poseen uno o ms agentes inhibidores (por ejemplo:
antibiticos, colorantes, sales biliares, etc). Por su parte, los medios de cultivo diferenciales llevan un
indicador de pH (por ejemplo: rojo de fenol, prpura de bromocresol, rojo neutro, etc). Por ltimo, a
los medios de cultivos para bacterias exigentes o fastidiosas se incorporan uno o ms factores de
crecimiento (por ejemplo: vitaminas, aminocidos, hemina, etc.).
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Desde el punto de vista fsico los medios de cultivos se pueden clasificar en medios de cultivo slidos
o agares, lquidos o caldos y semi-slidos. El desarrollo microbiano en un medio de cultivo
lquido se manifiesta por enturbiamiento del mismo, el que puede ser parcial, total, o solamente estar
limitado a la formacin de una pelcula membranosa superficial. En medios de cultivo slidos, se
manifiesta por la aparicin de una colonia, que corresponde a una formacin macroscpica no
filamentosa (bacterias y levaduras) o filamentosa (mohos), que resulta de la multiplicacin de una o
ms clulas y/o esporas de una misma especie (clon).
Por otro lado, segn las caractersticas nutritivas, los medios de cultivos pueden ser clasificados en seis
grupos bien definidos:
1.- MEDIOS BASICOS
Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, ya que no satisfacen ninguna necesidad en
especial. Se utilizan, de preferencia, como base para la preparacin de otros medios de cultivo. En
ellos crecen bacterias poco exigentes y pueden ser usados para mantener cepas bacterianas (cepario).
Ejemplos de stos son el Agar o Caldo Nutritivo y el Agar o Caldo Tripticasa.
2.- MEDIOS BASICOS MEJORADOS
Son medios bsicos a los cuales se les adiciona una sustancia enriquecedora como suero, sangre o
leche. El uso de estos medios es universal y est orientado a obtener un mejor desarrollo de cualquier
tipo de bacterias por exigentes que ellas sean. Por sta razn se utilizan en primera instancia en el
aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros medios de cultivo, alimentos o productos patolgicos.
Ejemplos de stos son el Agar Sangre, Agar Suero, Agar Leche y el Caldo Carne Cocida.

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3.- MEDIOS SELECTIVOS

Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies
microbianas y permiten el desarrollo de otras. Tienen aplicacin en el diagnstico bacteriolgico,
principalmente cuando el problema consiste en aislar un germen de un producto que contiene
numerosos grupos o especies de microorganismos, a menudo sin importancia etiolgica, y las cuales
en un medio de cultivo mejorado creceran de tal forma, que dificultaran el aislamiento del agente que
se desea pesquisar. La mayora de estos medios adems incluyen algn substrato (azcar, aminocido
o de otra naturaleza) y un indicador de pH que permite detectar su utilizacin, permitiendo as
diferenciar entre grupos o especies microbianas.
Entre los medios selectivos ms utilizados en microbiologa de alimentos estn:

Agar BAIRD-PARKER- Yema de Huevo- Telurito

Medio selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

recuento presuntivo de estafilococos coagulasa positivos,
particularmente Staphylococcus aureus.
Este medio de cultivo es selectivo debido a que contiene cloruro
de litio y telurito de potasio, los cuales inhiben el desarrollo de
la flora acompaante. Su poder diferencial est dado por la
yema de huevo y el telurito; la primera permite demostrar la
presencia de lecitinasa y el segundo la reduccin del telurito a
teluro, propiedades que son caractersticas de los estafilococos
coagulasa positivos. Las colonias tpicas de S. aureus se
presentan de color negro-grisceo (reduccin del teluriuto a
teluro) rodeadas de una zona opaca de precipitacin que a
menudo presenta una zona clara ms externa debido a la accin de la lecitinasa.

Agar VRBG (Agar Cristal Violeta- Rojo Neutro-Bilis-Glucosa)

Medio selectivo y diferencial utilizado para la deteccin y
recuento de la familia Enterobacteriaceae. Los miembros de
esta familia son bacilos Gram negativos, oxidasa negativos,
que fermentan la glucosa con o sin produccin de gas. El medio
contiene cristal violeta y sales biliares, que inhiben la mayor
parte de la flora Gram (+) acompaante. El rojo neutro es el
indicador de pH y permite diferenciar entre colonias glucosa
positivas y glucosa negativas. Las colonias fermentadoras de
glucosa se caracterizan por presentar un color rojo prpura, con
o sin una zona de precipitacin a su alrededor. En cambio, las
colonias no fermentadoras de glucosa son incoloras o

22

transparentes. Las colonias tpicas de los miembros de la F Enterioacteriaceae, deben ser confirmadas
mediante la prueba de oxidasa (oxidasa negativa) y fermentacin de glucosa con produccin de cido
en un medio glucosado.

Agar VRBL (Agar Cristal Violeta-Rojo Neutro- Bilis-Lactosa)

Medio selectivo y diferencial utilizado para la deteccin y
recuento
presuntivo
de
bacterias
coliformes
(Enterobacteriaceae lactosa +) y bacterias coliformes fecales
(coliformes termotolerantes). Ambos grupos son miembros de
la F Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad
para fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 35C
(48 h) y 44.5C (24 h), respectivamente.
El medio contiene cristal violeta y sales biliares, los que inhiben
la mayor parte de la flora Gram (+) acompaante. El rojo neutro
es el indicador de pH, que permite diferenciar entre colonias
lactosa positivas y lactosa negativas. Las colonias
fermentadoras de lactosa se caracterizan por presentar un color
rojo prpura, con o sin una zona de precipitacin a su alrededor; mientras que las colonias no
fermentadoras de lactosa son incoloras o transparentes. El carcter de coliforme o coliforme fecal,
debe ser confirmado mediante la produccin de gas a partir de la lactosa a 35C y 44.5C,
respectivamente.

Agar MacConkey-Sorbitol

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para el

aislamiento presuntivo de Escherichia coli O157:H7, un
patgeno asociado con colitis hemorrgica y el sndrome
hemoltico-urmico.
La formulacin de este medio es parecida al agar VRBL y
VRBD, la diferencia est en que contiene sorbitol en vez de
lactosa o glucosa; adems contiene cefixima y telurito de
potasio (inhibidores) con el fin de aumentar su poder selectivo.
E. coli O157: H7 es resistente a dichos inhibidores y a
diferencia de otros serotipos de E. coli no fermentan el sorbitol.
Por lo tanto, las colonias tpicas de E. coli O157:H7 son
incoloras o blancas (sorbitol negativas). En contraste, la mayor
parte de las E. coli de otros serotipos fermentan el sorbitol, originando colonias de color rosado-rojas.
Las colonias tpicas de E. coli O157:H7 se deben confirmar mediante pruebas bioqumicas (test
IMViC) y serolgicas (usando el antisuero O157 y H7).
Test IMViC= Indol (I), Rojo Metilo (M), Vogues-Proskauer (V) y, Citrato (C).

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Agar EMB- Levine (Agar Eosina-Azul de Metilo- Segn Levine)

Medio de cultivo selectivo y diferencial utilizado para aislar y

diferenciar miembros de la F Enterobacteriaceae lactosa
positivas, principalmente E. coli. El medio contiene azul de
metilo y eosina, colorantes que ejercen un efecto inhibitorio
sobre muchas bacterias Gram positivas y, a su vez, permiten la
diferenciacin entre organismos lactosa positivos (como E. coli)
y lactosa negativos (como Proteus spp., Salmonella spp., y
Shigella spp.). En este medio, las colonias de Escherichia coli
se caracterizan por presentar un brillo verde metlico. No
obstante, las colonias tpicas deben ser confirmadas mediante
pruebas bioqumicas (test IMViC).

Agar XLD (Agar Xilosa- Lisina - Desoxicolato)

Medio selectivo y diferencial para el aislamiento e

identificacin presuntiva de Salmonella spp. y Shigella spp.,
preferentemente provenientes de cultivos pre-enriquecidos.
El medio contiene desoxicolato de sodio, que acta como un
inhibidor de bacterias Gram positivas. El medio adems
contiene xilosa, lactosa, lisina y tiosulfato de sodio. La
fermentacin de la xilosa, lactosa y sacarosa, la
descarboxilacin de la lisina y la produccin de H2S a partir del
tiosulfato de sodio, son la base para diferenciar Salmonella spp.
y Shigella spp. de otras enterobactericeas no patgenas.
Salmonella y Shigella son sacarosa y lactosa negativas, por lo
cual el pH del medio se mantiene intacto y, por lo tanto, el indicador de pH mantiene el color rojo
alrededor de las colonias. Por su parte, la mayor parte de las especies de Salmonella producen H2S, el
que acta con el citrato frrico amoniacal presente en el medio, produciendo colonias con un
precipitado de color negro en el centro por las formacin slforo ferroso. Las bacterias coliformes
(lactosa positivas) provocan el viraje del indicador de pH alrededor de las colonias, de rojo a amarillo.
Las colonias sospechosas de Salmonella y Shigella, deben ser confirmadas mediante pruebas
bioqumicas y/o serolgicas.

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Agar PALCAM
Medio selectivo y diferencial utilizado para el aislamiento de
Listeria spp., particularmente Listeria monocytogenes. Su
selectividad est dada por la presencia de cloruro de litio,
polimixina B, acriflavina y ceftazidima, agentes que suprimen
la flora que normalmente acompaa a Listeria spp. El medio
adems contiene manitol y rojo fenol como indicador de pH.
Tambin posee esculina y citrato de fierro amoniacal. Listeria
spp. es manitol negativo y esculina positivo. Por lo tanto, las
colonias tpicas de Listeria spp. producen a su alrededor un
ennegrecimiento del medio debido a la degradacin de la
esculina. La incapacidad para fermentar el manitol se manifiesta
por la mantecin del color rojo del medio. La presencia de L.
monocytogenes debe ser confirmada mediante pruebas

bioqumicas y/o serolgicas.

Agar MYP (Agar Manitol- Yema de Huevo- Polimixina)

Medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de
Bacillus cereus. Su selectividad est dada por la polimixina B,
que inhibe el crecimiento de la mayor parte de la flora
acompaante. El medio contiene D-manitol y rojo de fenol
como indicador de pH, adems de yema de huevo para
determinar la actividad de la lecitinasa. Bacillus cereus no
fermenta el manitol y produce lecitinasa, por lo que las colonias
tpicas se aprecian de color rosa-rojo, rodeadas por un halo de
precipitacin. La confirmacin de la presencia de Bacillus
cereus debe ser confirmada mediante pruebas morfolgicas y
bioqumicas.

Agar DRBC (Agar Dicloran- Rojo de Bengala-Cloranfenicol)

Medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y
recuento de mohos y levaduras. El medio contiene glucosa
como fuente energtica y cloranfenicol como inhibidor de
bacterias Gram (+) y Gram (-). Adems contiene dicloran, un
antifngico que reduce al tamao de las colonias de mohos de
rpido crecimiento, que comnmente impiden el crecimiento o
visualizacin de mohos de crecimiento ms lento o levaduras.
El rojo de bengala tambin acta como supresor del crecimiento
de bacterias y como represor del tamao de mohos de rpido
crecimiento. En adicin, el rojo de bengala es incorporado por

25

las colonias de levaduras, facilitando su reconocimiento y conteo. El pH del medio (5.6) tambin
favorece el crecimiento de mohos y levaduras por sobre el de bacterias. Las colonias de mohos
presentan formas filamentosas de diversos tamaos y colores. En cambio, las colonias de levaduras son
no filamentosas, salvo ciertas excepciones, y exhiben una tonalidad que varia de rosa a rojo.

Agar PDA (Agar Papa Dextrosa)

Medio de cultivo selectivo utilizado para el aislamiento y
recuento de mohos y levaduras. La fuente energtica est dada
por infusin de papa y glucosa. El crecimiento de bacterias se
restringe mediante la adicin de un antibitico de amplio
espectro (generalmente, cloranfenicol) o ajustando el pH a 3.5
con cido tartrico o lctico. Las colonias de mohos son
tpicamente filamentosas, de tamao y color variable. En
cambio, las colonias de levaduras son no filamentosas, salvo
algunas excepciones, y dependiendo de la especie son de color
blanco, crema o pigmentadas (amarillas, rosas o rojas).

4.- MEDIOS ESPECIFICOS

Son medios de cultivo que por su composicin nutricional y qumica slo son capaces de satisfacer los
requerimientos nutricionales mnimos de una especie bacteriana determinada, solamente en ese medio
hallan las condiciones ptimas (factores de crecimiento) para su desarrollo. Ejemplos de stos son el
Agar Chocolate para Haemophilus spp., Agar Stuart para Leptospira spp., y Agar Loweisten-Jensen
para Mycobacterium tuberculosis.
5.- MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
Son medios de cultivos que gracias a su composicin estimulan el crecimiento de un determinado
microorganismo. Adems, poseen sustancias inhibidoras que impiden el crecimiento de
microorganismos que no se desean aislar y forman parte de la microflora acompaante .
Los ms utilizados en microbiologa de alimentos son:

Caldo TETRATIONATO

Es un medio de enriquecimiento selectivo para la deteccin de Salmonella spp. El caldo contiene sales
biliares, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram (+); tiosulfato de sodio y tetrationato (este ltimo
es formado en el medio por la adicin de una solucin de yodo y yoduro de potasio), los cuales
suprimen la microflora comensal del intestino. Tambin contiene carbonato de calcio, que absorbe e
inhibe los metabolitos txicos.

26

Caldo RAPPAPORT-VASSILIADIS.

Tambin es un medio de enriquecimiento selectivo para la deteccin de Salmonella spp. El medio

contiene cloruro de magnesio que eleva la presin osmtica del medio, verde malaquita que es
inhibitorio para la mayora de los microorganismos, excepto para Salmonella spp. Adems su bajo pH
(5.1) selecciona salmonelas altamente resistentes.

Caldo E.C (modificado)

Medio de enriquecimiento selectivo utilizado para la deteccin de Escherichia coli O157:H7. El medio
slo contiene lactosa como fuente de carbono asimilable. Los agentes inhibidores son las sales biliares
y la novobiocina (antibitico). Las sales biliares inhiben bacterias bacterias Gram (+); mientras que la
novobiocina, inhibe la flora bacteriana que normalmente acompaa a E. coli O157:H7.

Caldo FREASER

Medio de enriquecimiento selectivo y diferencial utilizado para la deteccin de Listeria spp.,

particularmente Listeria monocytogenes. El medio contiene cloruro de litio, cido nalidxico y
acriflavina, que inhiben la flora acompaante. Tambin contiene esculina y citrato frrico amoniacal.
Como todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, los productos de su degradacin reaccionan
con el citrato frrico amoniacal, provocando el ennegrecimiento del medio, el que es una seal de la
presencia de especies del gnero Listeria.

6.- MEDIOS DIFERENCIALES

Se emplean para demostrar una propiedad bioqumica de la bacteria, la cual es de gran ayuda para su
identificacin. Por ejemplo: degradacin de hidratos de carbono (Caldo Base Rojo Fenol), hidrlisis de
la urea (Agar Urea), utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono (Agar Citrato de
Simmon`s), etc. Como se trata de fenmenos metablicos que tienden a la identificacin de un gnero
o especie bacteriana, siempre se deben usar cepas puras.
Estos medios poseen indicadores de pH que permiten visualizar una determinada propiedad alterando
sus propiedades cromticas. Medios de este tipo son numerosos, los ms conocidos y utilizados son
aquellos que son utilizados para identificacin de los especies de la F Enterobacteriaceae, ya que stos
no poseen caractersticas muy distintivas en sus cultivos y colonias.

27

Los ms utilizados para este efecto son:

Agar CITRATO DE SIMMONS

Se utiliza para estudiar si una cepa bacteriana tiene la capacidad de utilizar el
citrato de sodio como nica fuente de carbono incorporada en el medio de
cultivo. El medio se prepara en tendido y es de color verde. Se siembra slo en
superficie y se incuba a 37 C durante 24-72 h.

Interpretacin
La degradacin del citrato por los microorganismos da lugar a una alcalinizacin
del medio de cultivo, que se manifiesta por un viraje a azul oscuro del indicador
de pH (azul de bromotimol).

Agar UREA DE CHRISTENSEN

Sirve para demostrar si una cepa bacteriana posee la capacidad de hidrolizar la

urea. El medio se prepara en tendido y es de color levemente amarillo. Se
siembra en superficie y se incuba a 37C durante 24-72 h.

Interpretacin
Si la urea es hidrolizada por la enzima ureasa se forma dixido de carbono y
amoniaco. Este ltimo proporciona una reaccin alcalina al medio, que se
visualiza por el viraje de amarillo a rojo-prpura del indicador de pH (rojo de
fenol).

28

Agar TSI (Agar Tres azcares-Hierro)

En este medio se estudia: i) La fermentacin de la glucosa, con o sin produccin de gas; ii) la
fermentacin de la lactosa y/o sacarosa; y iii) la produccin de H2S. El medio se prepara en tubo
inclinado y se siembra en superficie y picadura con asa recta. Se incuba a 37C durante 24 h.
Interpretacin
La degradacin de los azcares con formacin de cido se manifiesta por un cambio de color del
indicador rojo de fenol, que vira de rojo a amarillo. La utilizacin de la lactosa y/o sacarosa se visualiza
en la parte tendida del tubo, mientras que la utilizacin de la glucosa se observa en la parte profunda
(columna) del mismo. La formacin de gas por fermentacin de la glucosa se aprecia por la aparicin
de burbujas o ruptura del agar en su parte profunda. Por ltimo, la produccin de H2S se observa por la
aparicin de un precipitado de color negro que corresponde al slfuro ferroso.

TUBO ANOTACIN
INTERPRETACIN
Tubo control, sin inocular
A
0/0.
Tendido: Produccin de cido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
B
A/A.
Columna: Produccin de cido a partir de la glucosa.
C

A/A g.

A/A H2S.

0/A

H2S.

Tendido: Produccin de cido a partir de la lactosa y/o sacarosa.

Columna: Produccin de cido a partir de la glucosa con formacin de gas.
Tendido: Produccin de cido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
Columna: Produccin de cido a partir de la glucosa y formacin de H2S.
Tendido: No produce cido a partir de la lactosa y/o sacarosa.
Columna: Produccin de cido a partir de la glucosa y produccin de H2S.

29

Agar LIA (Agar Lisina-Hierro)

En ste medio se estudia la decarboxilacin y la deaminacin de la lisina, la produccin de H2S, y la

formacin de gas. El medio se prepara y se siembra de igual forma que el agar TSI. Se incuba a 37C
durante 24 h.
Interpretacin
La lisina puede ser decarboxilada por microorganismos LD-positivos, que la transforman en la amina
cadaverina. Esto produce un viraje a violeta del indicador de pH (prpura de bromocresol). Puesto que
la decarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6.0), es necesario que se produzca
previamente la fermentacin de la glucosa. Por ello, este medio de cultivo slo puede utilizarse para la
diferenciacin de cultivos que fermentan la glucosa (F Enterobacteriaceae). Por otro lado, los
microorganismos LD-negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un cambio de color en la
parte profunda del medio (violeta a amarillo). La produccin de H2S se visualiza por la formacin de
un precipitado de color negro (slfuro ferroso), mientras que la formacin de gas se visualiza por la
formacin de burbujas o por la ruptura del medio en su parte profunda. Las cepas del grupo ProteusProvidencia, desaminan la lisina a cido -cetocarbnico, que se evidencia por la formacin
compuestos pardorojizos en la regin superficial del medio de cultivo.
A

TUBO
A
B
C
D
E
F

ANOTACIN
K/K
K/K
K/A
K/A g, H2S.
K/K
R/A

H2S.

INTERPRETACIN
Tubo control, sin inocular
Descarboxilacin de la lisina.
Ni descarboxilacin, ni desaminacin de la lisina. Slo fermentacin de la glucosa.
Ni descarboxilacin, ni desaminacin de la lisina. Slo fermentacin de la glucosa y
produccin de H2S.
Descarboxilacin de la lisina y produccin de H2S.
Desaminacin de la lisina.

30

Medio MIO ( Medio Movilidad Indol Ornitina)

Es un medio de cultivo semi-slido que permite comprobar la descarboxilacin de la ornitina,

formacin de indol y movilidad. El medio se siembra en picadura y se incuba a 37C durante 18-24 h.
Interpretacin
La movilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la
picadura. La no movilidad se caracteriza por el crecimiento solamente a lo largo de dicho canal. La
demostracin del indol se efecta mediante la aplicacin de un par de gotas del reactivo de Kovacs (pdimetil-amino-benzaldehido), el que se deja escurrir suavemente por las paredes del tubo; la aparicin
de una coloracin rojo-prpura de la capa de reactivo indica produccin de indol. La descarboxilacin
de la ornitina se manifiesta por la mantencin o intensificacin del color violeta del medio de cultivo en
la parta baja del tubo.

TUBO
MOVILIDAD
INDOL
ORNITINA

A
Control
Control
Control

B
(+)
N.D
(+)

C
(-)
N.D
(-)

D
(-)
N.D
(-)

E
(+)
(+)
(+)

F
(+)
(-)
(+)

31

Caldo MR-VP (Caldo Rojo Metilo Voges Proskauer)

Este medio permite demostrar la produccin de cido (prueba del rojo metilo) o compuestos neutros a
partir de la glucosa (prueba de Voges-Proskauer).
Prueba del Rojo Metilo (RM)
Mediante esta prueba se puede determinar si la produccin de cidos
orgnicos (cido lctico, succnico, frmico, etc. ) a partir de la glucosa
ha sido capaz de bajar el pH a valores inferiores a 4.4. Para realizar la
prueba se inoculan 5 ml del caldo MR-VP con la cepa a estudiar y se
incuba a 30C durante 5 das. Terminada la incubacin, se aaden 5
gotas de una solucin de rojo de metilo. La reaccin positiva se evidencia
por la aparicin de un color rojo en el medio, el que indica acidez (pH
igual o inferior a 4.4). El color amarillo indica reaccin negativa (pH
igual o mayor 5.1).
La solucin indicadora de Rojo de Metilo se prepara disolviendo 0.4 g
de rojo de metilo en 60 ml de etanol absoluto. El pH debe ajustarse a
5.0, la solucin a este pH tendr un color anaranjado.
Prueba de Voges-Proskauer (VP)
Esta prueba permite comprobar la produccin de diacetilo a partir de la
glucosa. Algunas bacterias como E.coli, Salmonella y Shigella fermentan
la glucosa con produccin de grandes cantidades de cidos orgnicos, que
bajan el pH a valores inferiores o iguales a 4,4 y que puede ser verificado
por la prueba del rojo de metilo. En cambio, otras bacterias fermentan la
glucosa y producen compuestos neutros como el acetilmetilcarbinol
(acetona), 2,3-butanodiol o diacetilo, los que son determinados con la
prueba de VP. La prueba se realiza sembrando 5 ml de un caldo MR-VP
con la cepa bacteriana a estudiar y se incuba a 37C durante 48 h. Tras el
periodo de incubacin se agregan 3 ml del reactivo A y 1 ml del reactivo
B, se agita y se deja reposar por 5 a 10 min. Si se desarrolla una
coloracin roja-anaranjada, que se extiende por todo el medio la reaccin
se considerar positiva.
Reactivo A: - naftol al 5 % en alcohol etlico absoluto.
Reactivo B: Hidrxido de potasio al 40% en agua destilada conteniendo 0.3 % de creatina (solucin
muy custica).

32

INSTRUCCIONES PARA PREPARAR UN MEDIO DE CULTIVO

1.- Lea cuidadosamente las instrucciones que aparecen en la etiqueta del medio de cultivo.
2.- Ocupe un matraz cuya capacidad sea aproximadamente el doble del volumen del agua destilada
requerida para la preparacin.
3.- Lave el matraz y una probeta con agua corriente y enjuguela con agua destilada. Mida en la
probeta el volumen de agua destilada requerida y virtalo al matraz. Tape de inmediato con papel
de aluminio
4.- Pese el medio de cultivo deshidratado sobre un papel limpio de acuerdo a la cantidad especificada
por el fabricante. Tape inmediatamente el frasco que contiene el medio de cultivo deshidratado.
5.- Vierta el medio de cultivo pesado dentro del matraz que contiene el agua destilada. Disuelva por
medio de movimientos circulares. Evite que al agitar el medio quede cultivo seco en las paredes
del matraz.
6.- Caliente de acuerdo a las especificaciones del fabricante hasta lograr la total homogenizacin del
medio. Ello se aprecia por un cambio en el tono del color del medio de cultivo, ste se vuelve
translucido. Compruebe el pH y corrjalo si es necesario.
7.- Reparta el medio de cultivo en tubos o matraces de menor volumen.
8.- Esterilice el medio de acuerdo a las especificaciones que aparecen en la etiqueta del frasco
(autoclave o filtracin).
9.- Si el medio fue esterilizado en autoclave espere que ste se enfre e incbelo a 35C durante 24 h
para verificar su esterilidad. Se deben eliminar aquellos tubos o placas que presenten desarrollo
microbiano.
10.- Guarde los medios en el refrigerador (2-8C) hasta su posterior uso.

ACTIVIDADES

SESIN I:

Observacin, descripcin e interpretacin de medios de cultivos selectivos de uso rutinario en el

laboratorio de microbiologa de alimentos.

SESIN II:

Observacin, descripcin e interpretacin de medios de cultivos diferenciales utilizados para la

identificacin de especies de la F Enterobacteriaceae. Usted recibir dos bateras de medios
diferenciales sembrados con diferentes especies de enterobacterias, las que deber identificar en
base a las reacciones bioqumicas evidenciadas en las siembras siguiendo la tabla anexa.

33

Tabla 1a: Reacciones de la familia Enterobacteriaceae en agar TSI

Tabla 1b: Reacciones de la familia Enterobacteriaceae en agar LIA

R: Reaccin alcalina, color rojo

K/K: Descarboxilacin lisina, K/A: Fermentacin glucosa y descarboxilacin lisina

R/A: Desaminacin lisina y fermentacin glucosa.

34

Tabla 1c: Reacciones de la familia Enterobacteriaceae en medio MIO

35

PRCTICA N 3
EXAMEN MICROSCPICO DE BACTERIAS
INTRODUCCIN
La observacin microscpica de bacterias permite conocer algunas caractersticas importantes de stas,
tales como su tamao, morfologa, agrupacin, presencia estructuras (cpsula, espora, flagelos, etc.) y
movilidad. Esta informacin es fundamental para su identificacin o clasificacin dentro de un taxn
determinado, ya que los aspectos morfolgicos constituyen la primera etapa del proceso de
identificacin de un microorganismo.
Para el estudio microscpico de bacterias generalmente se usan dos tcnicas: el frotis fresco o examen
en preparaciones hmedas y el frotis fijo o examen en preparaciones fijas.
FROTIS FRESCO
El frotis fresco permite la observacin de bacterias en su estado vivo y su principal aplicacin es
estudiar su movilidad. En bacterias es posible diferenciar tres tipos de movimientos:
Movimiento browniano: Se manifiesta como un movimiento vibratorio y es el resultado de la colisin
de las bacterias con las molculas presentes en el medio que las rodea. No existe desplazamiento como
tal y, por lo tanto, no se debe a la presencia de flagelos.
Movimiento de corriente: Se caracteriza porque todas las bacterias se desplazan en una misma
direccin del campo visual del microscopio. A primera vista da la impresin que las bacterias se
desplazan por su propia accin, pero no es as, sino que son arrastradas por corrientes que se generan
dentro de la preparacin.
Movimiento de traslacin: Se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos en diferentes
direcciones del campo del microcopio. La observacin de este tipo de movimiento permite afirmar que
una bacteria es mvil y, por tanto, presenta flagelos.
TCNICA
1.- Limpie un portaobjetos y pselo rpidamente sobre la llama del mechero.
2.- Coloque una gota de suero fisiolgico (S.F) sobre el portaobjetos.
3.- Con el asa de cultivo, resuspenda sobre la gota de S.F una muestra del cultivo que desea observar.
Debe usar cultivos frescos, de no ms de 48 horas de incubacin.
4.- Cubra la preparacin con una lmina cubreobjetos y obsrvela en el microscopio con aumento
mayor (X40).

36

FROTIS FIJO
El frotis fijo, a diferencia del frotis fresco, permite solamente la observacin de bacterias muertas y es
la base para realizar cualquier tincin.
TCNICA
1.- Limpie un portaobjetos y pselo rpidamente sobre la llama del mechero.
2.- Coloque sobre el portaobjetos una gota de agua destilada estril.
3.- Sobre la gota de agua deposite una asada del cultivo que desea observar. Disulvala y extindala
sobre el portaobjetos.
4.- Caliente nuevamente el portaobjetos hasta que la pelcula formada sobre ste se seque
completamente.
5.- Una vez seco, vuelva a pasarlo sobre la llama evitando que la preparacin se queme por
sobrecalentamiento.
6.- Deje enfriar y realice la tincin que desee.
TINCIONES
Las clulas bacterianas son prcticamente transparentes (hialinas), por esta razn es recomendable el
uso de colorantes para su observacin. El empleo de colorantes biolgicos permite aumentar el
contraste entre la clula y el medio que la circunda. Asimismo, el uso de algunas tcnicas especiales de
tincin permite diferenciar entre grupos afines de bacterias o distinguir algunas estructuras bacterianas
(por ejemplo: flagelos, cpsula, grnulos de lpidos, grnulos metacromticos, etc.).
Las tinciones se pueden clasificar en:
1.- TINCIONES SIMPLES
Se basan en el uso de un slo colorante, por lo que todas las clulas bacterianas se observan del mismo
color. Este tipo de tinciones no permite establecer ninguna diferencia entre grupos de bacterias o
diferenciar estructuras. Por esta razn, tienen escasa aplicacin en microbiologa, slo se usan para
estudiar la forma, tamao y agrupacin de las clulas bacterianas. Las tinciones simples se pueden
realizar con azul de metileno, violeta de genciana, cristal violeta, rojo de metilo, safranina, etc.
2.- TINCIONES DIFERENCIALES
Estas tinciones permiten diferenciar grupos de bacterias de acuerdo a su afinidad por determinados
colorantes, por lo que prestan una gran utilidad para el estudio e identificacin de bacterias. La ms
empleada de ellas es la tincin de Gram, la cual permite separar a las bacterias en dos grandes grupos:
bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas.

37

TCNICA
1.2.3.4.5.-

Prepare un frotis fijo de la cepa bacteriana que desea teir.

Cubra el frotis fijo con una solucin de cristal violeta durante 60 segundos.
Lave con agua destilada manteniendo el portaobjeto inclinado.
Cubra con lugol y djelo actuar durante 60 segundos.
Lave nuevamente con agua destilada y decolore la preparacin con alcohol-acetona hasta que deje
de escurrir el colorante, aproximadamente durante 30 segundos.
6.- Lave con agua destilada y luego cbralo con una solucin de safranina durante 15 segundos.
7.- Lave con abundante agua destilada y squelo con cuidado a la llama del mechero.
8.- Observe la preparacin en el microscopio usando el aumento de inmersin (X100).
Las bacterias que resisten la decoloracin y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecern de
color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivas. Aquellos que pierden el color
inicial del cristal violeta tras la decoloracin, se clasifican como Gram negativas y toman el color rosa
debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias qumicas en sus paredes celulares, son las
que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-lugol (yodo). Las bacterias Gram positivas
tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglucano, mientras que en Gram
negativas, aunque la pared est tambin constituida por pptidoglucano, es ms delgada y presenta
adems una membrana externa con lipopolisacridos. Las paredes de las bacterias Gram positivas
tratadas con alcohol sufren una deshidratacin y sus poros se contraen, dificultando la salida del
complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipdica ms
externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglucano.
3.- TINCIONES ESPECIALES O ESTRUCTURALES
Las tinciones especiales tienen por objeto destacar algunas estructuras de la clula bacteriana como por
ejemplo: endosporas, cpsula, flagelos, lpidos, etc.
La tincin especial ms usada en nuestro laboratorio es la tincin de endosporas. Las endosporas son
estructuras que se forman en el interior de las clulas vegetativas de bacterias pertenecientes a los
gneros Bacillus (algunas especies han sido reclasificadas en los gneros Alicyclobacillus,
Brevibacillus, Geobacillus y Paenibacillus), Clostridium, Desulfotomaculum, Oscillospira y
Sporolactobacillus. A diferencia de la clula vegetativa de la que procede, las endosporas son
resistentes a factores ambientales adversos como altas temperaturas, compuestos qumicos txicos,
radiaciones U.V y tambin a los colorantes. Sin embargo, existen colorantes como el verde de
malaquita que, con ayuda del calor, pueden penetrar en ella. Una vez teidas, no pierden el colorante al
ser lavadas con agua, pero s lo perdern las formas vegetativas, que quedarn teidas con el colorante
de contraste. La posicin y morfologa de las esporas en el interior de la bacteria tiene gran inters
taxonmico, ya que es de utilidad para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.

38

TCNICA
1.- Prepare un frotis fijo de la cepa bacteriana que desea estudiar. Fjelo a la llama, pero evite no
sobrecalentar para no romper el portaobjetos.
2.- Cubra la preparacin con una solucin saturada de verde de malaquita (7.5%) y psela por la llama
de un mechero hasta la emisin de vapores. Esta operacin se repite durante 5 minutos, evitando
que la muestra hierva y que se evapore completamente el colorante. Si es necesario agregue ms
colorante.
3.- Lave con agua corriente el exceso de colorante.
4.- Cubra la preparacin con una solucin acuosa de safranina al 0.25% durante 30 segundos.
5.- Lave, seque y observe la preparacin con aumento de inmersin (X100).
6.- Las endosporas se observan de color verde, ya que se tien con el verde de malaquita; en cambio,
el cuerpo de la bacteria tie de color rosado por efecto del colorante de contraste (safranina).
MORFOLOGIA CELULAR BACTERIANA
Las clulas bacterianas presentan una morfologa tpica que facilita su identificacin. Las bacterias se
clasifican de acuerdo a esta propiedad en:
1.- CELULAS COCACEAS
En este caso las clulas son esfricas o aproximadamente esfricas (arrionada u ovoides) y reciben el
nombre de cocos. Segn como se agrupen se denominan:
o Diplococos: Se dividen en un slo plano y permanecen unidas formando parejas (Neisseria
gonorrhoeae -N. meningitiditis).
o Estreptococos: Se dividen en planos paralelos y quedan unidas formando cadenas de distintas
dimensiones (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium).
o Tetracocos: Se dividen en dos planos perpendiculares y forman grupos caractersticos de cuatro
clulas (Aerococcus viridans).
o Estafilococos: Se dividen en tres planos irregulares formando racimos de cocos (Staphylococcus
aureus).
o Sarcina: Se dividen en tres planos perpendiculares dando agrupamientos cuboidales (Sarcina spp).
2.- CELULAS BACILARES
En este caso las clulas son alargadas, pudiendo presentar formas variadas como: cocobacilos
(Escherichia coli), bacilos fusiformes (Fusobacterium spp.), filamentosos (Actinomyces spp.),
elipsoides (Acetobacter spp), curvos o vibriones (Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus),
espiralados o helicoidales (Helicobacter pylori), rectangulares (Bacillus anthracis), etc.

39

Las principales agrupaciones que pueden presentar las bacterias de forma bacilar son: diplobacilos
(Moraxella spp.), estreptobacilos (Bacillus cereus), y letra china o empalizada (Corynebacterium
spp.).

A) Staphylococcus spp., B) Lactobacillus sp., C) Actinomyces sp., D) Pseudomonas sp., E) Neisseria

sp., F) Enterococcus sp.

Endospora de Bacillus sp. (teidas con verde de malaquita)

40

ACTIVIDADES
A cada grupo se les proporcionar cultivos frescos de bacterias: Listeria innocua, Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Enterococcus sp., Bacillus sp. y Pseudomonas fluroescens.
1.- A partir de cada uno de los cultivos realice un frotis fresco y examnelo al microscopio. Describa el
tipo de movilidad que presenta.
2.- Prepare un frotis fijo y tincin de Gram para cada uno de los cultivos disponibles en el laboratorio.
Distinga y relacione cada patgeno con su afinidad al Gram, su forma y su agrupacin, cuando
corresponda.
3.- De acuerdo a los resultados de las observaciones microscpicas y apoyado en la informacin de la
tabla para identificacin para bacterias hetertrofas (en pgina siguiente) seleccione y realice las
pruebas disponibles que apoyen la identificacin de los gneros de patgenos en alimentos que se
la he entregado en el laboratorio.

41

42

PRCTICA N 4
FORMUACIN DE UNIDADES DE INVESTIGACIN Y
EXAMEN BACTERIOLOGICO DE ALIMENTOS
_______________________________________________________________________________
I.- INTRODUCCIN
Los riesgos microbiolgicos de los productos alimenticios constituyen una de las principales fuentes de
enfermedades de origen alimentario para las personas. Por esta razn, los alimentos no deben contener
microorganismos patgenos, ni sus toxinas o metabolitos, en cantidades que supongan un riesgo
inaceptable para la salud humana.
Los microorganismos de inters para la aceptabilidad o rechazo de los alimentos se pueden agrupar en:
Microorganismos infectivos:
Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli enteropatgena (por ej: E. coli O157 o
enterohemorrgica y E. coli enterotixignica), Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio
parahaemolyticus, entre otros.
Microorganismos toxignicos:
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringes, Clostridium botulinum y Bacillus cereus.
Microorganismos indicadores:
Enterobacterias (Fam. Enterobactericeae), coliformes totales, coliformes termotolerantes (coliformes
fecales), Escherichia coli, Enterococcus spp., microorganismos aerobios mesfilos, microorganismos
aerobios psicrtrofos, mohos y levaduras, etc.
Microorganismos alterantes:
Pseudomonas spp., microorganismos pectinolticos, microorganismos proteolticos, microorganismos
lipolticos, microorganismos sacarolticos, etc.
El Reglamento Sanitario de los Alimentos (N977/96) establece los requisitos generales de seguridad
alimentaria, en virtud de los cuales se comercializarn solo alimentos que sean inocuos (libres de
microorganismos patgenos o sus toxinas) y salubres (microorganismos indicadores dentro de los
rangos especificados para el alimento). Con este fin establece Criterios Microbiolgicos, donde se
especifican los parmetros microbiolgicos que se controlarn en los distintos grupos de alimentos:
microorganismos indicadores, microorganismos patgenos y/o toxinas. Tambin se establecen los

43

planes de muestreo, que pueden ser de 2 tipos: (i) Plan de 2 clases o (ii) Plan de 3 clases. As mismo, se
establecen los lmites microbiolgicos de acuerdo a las recomendaciones internacionales.
As por ejemplo, los criterios microbiolgicos establecidos para el Queso Fresco (quesillo) y los
Moluscos Bivalvos Frescos son los siguientes:
Queso Fresco

Parmetro
Enterobactericeas
E. coli
S. aureus
Salmonella en 25 g

Categora
6
6
6
10

Plan de muestreo Lmite por Gramo

Clases n
c
m
M
2
3
5
1
210
10 3
3
5
1
< 3.0
10
3
5
1
10
10 2
2
5
0
0
-

Moluscos Bivalvos Frescos

Parmetro
Rcto. Aerobios Mesfilos
Coliformes fecales en 100 g
Salmonella en 25 g

Categora
1
4
10

Plan de muestreo Lmite por Gramo

Clases n
c
m
M
5
3
5
3
510
106
3
5
3
2.3102
4102
2
5
0
0
-

n= Nmero de muestras examinadas de un lote.

c= Nmero mximo permitido de unidades de muestras defectuosas.
m= Lmite del valor del parmetro microbiolgico que, en un plan de dos clases, separa la
calidad aceptable de la rechazable. Mientras que, en un plan de tres clases, separa la calidad
aceptable de la marginalmente aceptable.
M=Valor del parmetro microbiolgico por encima del cual el alimento representa un riesgo para la
salud (rechazable).

II. -PRINCIPIOS GENERALES DEL MUESTREO

La necesidad de realizar el muestro se basa en la imposibilidad de poder someter a un lote completo a
un anlisis microbiolgico, ya que analizar cada subunidad del lote sera destructivo y demasiado caro
(un lote es una cantidad de alimentos producida y manipulada bajo condiciones uniformes).
Un muestreo correcto requiere una atencin cuidadosa, ya que su objetivo es obtener una muestra
representativa del alimento. Para que una muestra sea representativa debe contener un nmero
suficiente de unidades de muestra, las que se obtienen por el mtodo de nmeros aleatorios.

44

Las muestras seleccionadas deben trasladarse al laboratorio para su anlisis en condiciones idnticas a
las que tenan en el momento del muestreo. Para ello deben ser enviadas en los recipientes originales,
si no es posible, los recipientes destinados a contener la muestra y utensilios utilizados para su
recoleccin deben ser previamente esterilizados.
Las muestras deben llegar al laboratorio en el mnimo de tiempo posible, y deben ser transportadas a
una temperatura que no estimule el crecimiento microbiano (entre 4 y 5C). Este requisito es de valor
fundamental para la mayora de las muestras; sin embargo, es secundario para muestras como
conservas, preservas o productos deshidratados. Cada muestra debe estar acompaada de la
informacin que la individualice (lugar, hora y persona que la recolect). Una vez en el laboratorio,
los anlisis se deben realizar lo ms pronto posible.

III.- PREPARACION DE LAS DILUCIONES DE MUESTRAS DE ALIMENTOS

III.1.- ALIMENTOS NO LIQUIDOS
El mtodo utilizado para el recuento y aislamiento de microorganismos en los alimentos no lquidos
requiere el tratamiento previo de la muestra, para liberar en el medio fluido (diluyente) los
microorganismos que pueden estar aprisionados en el interior o adheridos en las superficies secas o
gelatinosas del alimento.
El procedimiento ms empleado es el uso del Stomacher 400. Los laboratorios que no cuentan con
dicho aparato debern usar una licuadora. Las muestras blandas como queso, quesillos y pastas pueden
molerse en morteros estriles.
Como diluyente se utilizar principalmente:
- Solucin Salina Peptonada (SSP),
- Agua Peptonada al 0.1% (AP), o
- Citrato de Sodio al 2% (para quesos).
PROCEDIMIENTO
a) Una vez recibida la muestra, realice el anlisis lo ms pronto posible.
b) Si debe postergar el procedimiento, mantener:
- A -18C las muestras de productos congelados.
- Entre 0 y 4C los alimentos perecibles no congelados, por un perodo no superior a 36
horas.
- A temperatura ambiente las muestras no perecibles como conservas o alimentos de baja
humedad.

45

- Si la muestra est congelada, descongelada en su envase original (o bien en el

recipiente en el que lleg al laboratorio) durante un perodo mximo de 18 horas en
refrigerador (a 5C).
- Si la muestra congelada puede ser fcilmente triturada, como sucede con los helados,
no es necesario descongelarla.
c) Pese 10g, 25g. 50g de la muestra en el interior de una bolsa de Stomacher estril. Si la
muestra no es homognea, por ej. platos preparados, se deben tomar 50 g de una mezcla de
todos los componentes.
d) Aada a la bolsa de Stomacher 90, 225 o 450 mL de diluyente (siempre en una proporcin 1:9).
Homogenice la muestra en el Stomacher (230 rpm/1-2 minutos). De este modo obtendr la
dilucin 1:10 (10-1).
e) Prepare diluciones decimales seriada de la muestra. Para ello, traspasar 1 mL de la dilucin 10-1
a un tubo que contenga 9 mL del diluyente; as obtendr la segunda dilucin (10-2). Agitar y
repetir esta operacin para preparar las diluciones decimales consecutivas necesarias (10 -3, 10 -4,
etc.).
Importante:
- La preparacin de cada dilucin requiere el uso de una pipeta estril.
- El perodo transcurrido entre la preparacin del homogeneizado de la muestra y la siembra,
NO debe superar los 20 minutos.

III.2. - ALIMENTOS LIQUIDOS

a) Agite manual o mecnicamente la muestra para asegurar la distribucin uniforme de los
microorganismos.
b) Medir 10 mL de la muestra y transferir a un frasco de boca ancha que contenga 90 mL del
diluyente apropiado. As obtendr la dilucin 10-1.
c) Proseguir segn tcnica descrita para los alimentos no lquidos.

III.3.- ALIMENTOS QUE NECESITAN TRATAMIENTO ESPECIAL

Alimentos cidos (pH inferior a 4,5): Jugos, nctares, yogurt, etc.
a) Mezclar 10g o mL de la muestra con 90 mL de Agua Peptonada Tampona (APT) para
tamponarla.
b) Preparar las diluciones decimales seriadas cono se ha indicado anteriormente.

46

Alimentos deshidratados
a) Alimentos tales como leche en polvo, gelatina, sopas, caldos, flanes, budines, huevo en polvo,
etc. requieren diluyente temperado a 45C para facilitar su disolucin o dispersin.
b) Alimentos con gran capacidad de absorcin, tales como gomas, especias molidas y vegetales
deshidratados. Pesar 2 g y aadir 200 mL de diluyente (dilucin 10-2). En el caso de los
vegetales deshidratados, dejar rehidratar por 30 minutos a temperatura de refrigeracin y luego
agitar por 3 minutos.
c) Proseguir con las diluciones.
Alimentos grasos
a) Para homogeneizar alimentos cuyo contenido en grasa sea superior al 20%, se recomienda
agregar al diluyente 1% de Tween 80 u otro agente tensoactivo no txico, con el fin de
aumentar la dispersin de los glbulos de grasa.
b) En el caso de la mantequilla o margarina, fundir la muestra bajo agitacin en bao
termorregulado a 40C por no ms de 15 minutos.
c) En quesos, preparar la dilucin 10 -1 utilizando como diluyente una solucin de citrato de sodio
al 2%. Para las siguientes diluciones usar el diluyente habitual.

47

Sesin N1
RECUENTO TOTAL DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS
(RAM)
INTRODUCCIN
El nmero de microorganismos aerobios mesfilos encontrados en alimentos es uno de los indicadores
microbiolgicos de calidad ms utilizado. Es aplicable a todos los alimentos con excepcin de los
productos fermentados o madurados tales como yogurt, ciertos tipos de embutidos y quesos.
Los resultados de este anlisis permiten:

Verificar la efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfeccin.

Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
Determinar el origen de la contaminacin durante los procesos de elaboracin de los alimentos.
Verificar condiciones de almacenamiento y transporte.
Obtener informacin acerca de la vida til de los alimentos.
Indicar alteracin incipiente en ciertos alimentos.

I.- Procedimiento
a) Preparar diluciones de la muestra de alimento (10-1 hasta 10 -3), segn las indicaciones dadas en
"Preparacin de las diluciones de muestras de alimentos.
b) Depositar 1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10 -2 y 10-3 (o mayores) en placas de Petri
previamente identificadas.
c) Vertir en cada placa de Petri aproximadamente 15 mL de Agar Plate Count, previamente
fundido y mantenido en bao de agua a 45-48C.
d) Mezclar el inculo con el medio fundido. La forma adecuada de llevar a cabo esta operacin
sera la siguiente:

Mover la placa con movimientos de vaivn 5 veces en una direccin,

Hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj,
Mover con movimientos de vaivn en una direccin que forme ngulo recto con la
primera,
Hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

e) Dejar solidificar el agar a temperatura ambiente. Una vez solidificado, invierta las placas
rpidamente, para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulacin de humedad.
f) Incubar las placas en forma invertida a 30C durante 72 +2 horas o 35C durante 48 +2 horas.

48

I.2.- Recuento de colonias y registro

Luego de cumplir el perodo de incubacin, realizar la lectura de las placas.

Contar todas las colonias, incluyendo aquellas de tamao muy pequeo, preferentemente en
aquellas placas que contengan entre 25 y 250 colonias.

Registrar el nmero de colonias contadas en cada placa de cada una de las diluciones.

I.3.- Clculo de resultados

El recuento total de microorganismos aerobios mesfilos se obtiene mediante la siguiente frmula:
N=AxD
Donde N, es el recuento total de microorganismos aerobios mesfilos por gramo mL de producto; A,
nmero de colonias contadas en la placa seleccionada y; D, es el valor recproco del factor de dilucin
respectivo.

Informe el recuento en unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro o gramo segn
corresponda.

Exprese los resultados con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.

Ejemplo:

240.000 ~ 2,4 x 105 ufc/g mL

UNIDADES DE INVESTIGACIN
ACTIVIDAD N 2
Usted y su equipo de trabajo debern presentar el documento formal y presentar a la seccin de
laboratorio, la propuesta de trabajo de su Unidad de Investigacin. Esta debe seguir el formato
presentado en clases, que contempla:
- Ttulo,
- Introduccin,
- Justificacin del estudio,
- Materiales y Mtodos,
- Resultados esperados y
- Bibliografa

49

Sesin N2
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS

INTRODUCCION

La familia Enterobacteriaceae se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente (agua, suelo

y vegetacin). Las especies que la integran son colonizadores normales del tracto intestinal del hombre
y animales de sangre caliente.
Son bacilos Gram negativos, aero-anaerobios facultativos, que fermentan la glucosa con o sin produccin de gas y dan negativa la prueba de oxidasa (oxidasa negativas).
Los principales gneros que conforman la familia Enterobacteriaceae son:

Citrobacter
Edwarsiella
Enterobacter
Escherichia
Hafnia

Klebsiella
Morganella
Proteus
Providencia

Salmonella
Serratia
Shigella
Yersinia

El uso de esta familia como indicador resulta til para detectar contaminacin posterior, en aquellos
productos que han sido sometidos a algn tratamiento tecnolgico, para evaluar la efectividad del
proceso, y tambin en aquellos alimentos en los cuales no se realiza el RAM.
La ventaja de determinar Enterobacterias es que detecta bacterias que pueden o no fermentar la lactosa,
a diferencia de la determinacin de coliformes, que slo incluye aquellas especies de esta familia que
son fermentadores de lactosa.
I.- Procedimiento
a) Preparar la muestra de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado en "Preparacin de
diluciones de muestras de alimentos.
b) Tomar y depositar 1 mL (por duplicado) de las diluciones 10 -1, 10-2 y 10 -3 (o mayores) en
placas de Petri, previamente rotuladas.
c) Verter en cada placa 15 mL de Agar VRBG previamente fundido y temperado a 44 -46C.
d) Mezclar el inculo con el agar siguiendo las instrucciones dadas en "RAM".
e) Una vez solidificado el agar con el inculo aadir una segunda capa con 4 a 5 mL del mismo
agar.
f) Una vez solidificada la segunda capa de agar, incubar las placas invertidas a 35C durante 24
3 horas.

50

g) Elegir las placas que presenten entre 15 y 150 colonias. Si slo se dispone de placas con menos
de 20 colonias, utilizar dichas placas.
Cuente las colonias sospechosas de ser Enterobacterias (fermentadoras de glucosa).
h) Registrar como recuento presuntivo el nmero de colonias contadas en cada dilucin y
multiplicar por el valor recproco del factor de dilucin correspondiente.
I.2.- Pruebas confirmativas
a) Sembrar por estra 5 colonias tpicas en placas con Agar Nutritivo y por picadura en tubos de
medio Agar Glucosa Sal.
b) Cubrir con aceite mineral estril el medio Agar Glucosa Sal.
c) Incubar ambos medios a 35-37C por 20-24 horas.
d) Realizar la Prueba de Oxidasa a las colonias desarrolladas en las placas con Agar Nutritivo.
e) Si la prueba de oxidasa resulta negativa y el Agar Glucosa Sal vira a color amarillo, considerar
las colonias examinadas como pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.
I.3.- Clculos y expresin de resultados
El recuento total de Enterobacterias se obtiene mediante la siguiente frmula:
N = A x B/C
Donde N, es el recuento total Enterobacterias por gramo mL de producto; A, es el recuento
presuntivo (colonias sospechosas x el valor recproco del factor de dilucin correspondiente); B, el
nmero de colonias confirmadas como Enterobacterias mediante la prueba de oxidasa y la produccin
de cido a partir de la glucosa y; C, el nmero (5) de colonias sometidas a las pruebas de confirmacin.
Informe el recuento en unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro o gramo segn
corresponda.
Exprese los resultados con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.
Ejemplo:
2.700 ~ 2,7 x 103 ufc/g mL

51

Sesin N3
RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES FECALES (termotolerantes) Y
E. coli.

INTRODUCCIN
El grupo de microorganismos denominados coliformes forman parte de la familia Enterobacteriaceae.
Son bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, y que producen cido a partir de la glucosa y
otros carbohidratos. Fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 35C en 48 horas. Este grupo
incluye los gneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter.
E. coli es una bacteria cuyo hbitat es el intestino del hombre y animales de sangre caliente y debido a
esto se ha utilizado como indicador de contaminacin fecal. En la actualidad se utiliza el grupo
coliformes termotolerantes (coliformes fecales) como indicador de manipulacin higinica inadecuada.
Los coliformes termotolerantes se define como bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, que
fermentan la lactosa con formacin de cido y gas a 44,5C en 24 horas. Estos microorganismos estn
presentes en el intestino del hombre y animales de sangre caliente e incluye microorganismos que
pertenecen por lo menos a dos gneros: Escherichia y Klebsiella.
Tanto el grupo coliformes como coliformes termotolerantes no tienen validez taxonmica, su
definicin est basada en la metodologa de anlisis establecida para su enumeracin.

Dentro del grupo de los coliformes (o coliformes termotolerantes) Escherichia coli es el

microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperacin se hace de acuerdo a la metodologa
establecida para la enumeracin de coliformes. Tradicionalmente se identifica por los resultados que da
la prueba IMViC.
Para la determinacin de coliformes totales y termotolerantes se utilizan 2 mtodos: (i) Tcnica del
Nmero Ms Probable (NMP) y (ii) Mtodo de Recuento en Placa.

52

I.- RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E. coli EN

ALIMENTOS POR LA TECNICA DEL NMP.
I.1.- Prueba presuntiva
Procedimiento
a) Preparar la muestra y diluciones segn procedimiento indicado en "Preparacin de diluciones de muestras de alimentos".
b) Inocular 9 tubos de caldo LST (Caldo Lauril Sulfato Triptosa):
3 tubos con 1 mL de la dilucin 10 -1
3 tubos con 1 mL de la dilucin 10 -2
3 tubos con 1 mL de la dilucin 10 -3
c) Agitar suavemente la gradilla para mezclar.
d) Incubar a 35C por 24 a 48 horas.
e) Observar la formacin de gas en los tubos de fermentacin a las 24 horas. En caso negativo
incubar por 24 horas ms.
La presencia de gas significa una prueba presuntiva positiva para coliformes. Se registra como positivo, cualquiera sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas a
las 48 horas significa prueba presuntiva negativa para coliformes.
f) Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin.
I.2.- Prueba confirmativa para coliformes totales y termotolerantes
Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas se transfieren a Caldo LBVB (Caldo
Lactosado Bilis Verde Brillante) para confirmar coliformes totales y a caldo EC (Caldo Escherichia
coli) para confirmar coliformes termotolerantes.
I.2.1.- Procedimiento para confirmar coliformes totales
a) Mezclar por agitacin el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inculo con asa madera a
tubos de fermentacin que contienen caldo LBVB. Se debe tener la precaucin de enfriar el asa
para asegurar que se transfiere un inculo de cultivo viable.
b) Incubar los tubos con Caldo LBVB a 35C durante 24 a 48 horas.
c) Al trmino del perodo de incubacin observar la formacin de gas en los tubos de fermentacin
del Caldo LBVB.
d) La presencia de gas en los tubos de fermentacin de Caldo LBVB significa un test confirmativo
positivo para coliformes totales. Ausencia de gas constituye un test negativo.
e) Registrar los resultados de la prueba confirmativa.

53

I.2.2.- Procedimiento para confirmar coliformes termotolerantes

a) Mezclar por agitacin el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inculo con asa a tubos de
fermentacin que contienen caldo EC temperados previamente a 44,5 C por 30 minutos como
mnimo. Se debe tener la precaucin de enfriar el asa para asegurar que se transfiere cultivo
viable.
b) Los tubos de caldo EC se incuban en un bao de agua con cubierta a 44,5C + 0,2C por 24
horas. El nivel de agua del bao debe sobrepasar el nivel de caldo de los tubos.
c) La presencia de gas en los tubos de fermentacin de caldo EC significa una prueba positiva, la
ausencia de gas constituye una prueba negativa. .
d) Registrar los resultados de la prueba confirmativa y de los cultivos control.
I.3.- Clculo y expresin de resultados
El nmero de tubos positivos por dilucin (10-1, 10-2 y 10 -3) permite obtener una cifra compuesta de 3
dgitos Ej. 3 -2 -O, esta combinacin se consulta en la tabla NMP (Anexo N1) y se expresa como:
NMP = 93 coliformes totales / g o mL de muestra, o bien como
NMP = 93 coliformes fecales / g o mL de muestra.
1.4.- Prueba confirmativa para Escherichia coli
a) De cada tubo de caldo EC que presente formacin de gas en el test confirmativo de coliformes
termotolerantes, transferir un inculo a una placa de agar EMB-Levine y sembrar por agotamiento en superficie para obtener colonias aisladas.
b) Incubar las placas invertidas a 35C por 18 a 24 horas. Al trmino del perodo de incubacin
observar las colonias que presentan un centro oscuro con o sin brillo metlico.
c) De cada placa de agar EMB-Levine transferir 2 colonias aisladas a tubos de Agar Nutritivo o
Agar Tripticasa. Tras incubar a 35C durante 24 horas, realizar la prueba IMViC (Indol, Rojo de
Metilo, Voges-Proskauer y Citrato).

Prueba IMViC
Produccin de indol
o Inocular un tubo de caldo triptona e incubar a 35C por 24 2 horas. Al trmino del perodo de
incubacin, agregar al cultivo 0,2-0,3 mL de reactivo de Kovacs.
- Prueba positiva: color rojo intenso en la superficie del medio
- Prueba negativa: color amarillo

54

Reaccin Voges Proskauer

o Inocular un tubo de caldo RM-VP e incubar 48 2 h. a 35C. Transferir 1 mL de este cultivo a
otro tubo y agregar 0,6 mL de solucin a naftol y 0,2 mL de solucin KOH al 40%. Agitar el
tubo. Observar despus de 2 horas.
- Prueba positiva: color rosado
- Prueba negativa: color caf pardo
Reaccin rojo de metilo
o Inocular un segundo tubo de caldo RM- VP e incubar a 35C por 72 horas.Tras el periodo de la
incubacin agregar 5 gotas de solucin rojo de metilo
- Prueba positiva: color rojo
- Prueba negativa: color amarillo
Utilizacin de citrato
o Inocular suavemente en lnea recta, un tubo de Agar Citrato Sirnmons. Incubar a 35C hasta
96 horas. Observar el cambio de color producido en el medio.
- Prueba positiva: color azul
- Prueba negativa: color verde
I.5.- Interpretacin de la prueba IMViC
Todos las colonias cuyas pruebas IMViC sean compatibles con E.coli (Ver Tabla) deben ser
considerados como E. coli.
Reacciones IMViC caractersticas para E.coli

Indol
+
-

+
+

Pruebas IMViC
RM
VP
-

Citrato
-

E.coli
Tipo I
Tipo II

I.6.- Clculo y expresin de resultados

Calcular el NMP de Escherichia coli, basndose en el nmero de tubos de caldo EC en que se confirm
su presencia.

55

II.- RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E. coli EN

AGUA NO CLORADA POR LA TECNICA DEL NMP.
II.1.- Prueba presuntiva
En la prueba presuntiva se utiliza CLST en tubos de fermentacin.
Previo a la inoculacin, la muestra y diluciones deben agitarse vigorosamente 25 veces en 7 segundos en un arco de 45, con movimientos de arriba a abajo para asegurar la homogeneidad de
la muestra. Este procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie de diluciones.
Procedimiento
a) Inocular:
5 tubos de caldo LST doble concentracin con 10 mL de la muestra en cada tubo
5 tubos de caldo LST concentacin simple con 1 mL de la muestra en cada tubo
5 tubos de caldo LST concentracin simple con 0,1 mL de la muestra en cada tubo.
b) Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo e incubar los
tubos a 35C por 24 a 48 horas.
c) Observar la formacin de gas en cada tubo. La presencia de gas se registra como prueba
positiva, cualquiera que sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas a las 48 horas
significa una prueba presuntiva negativa para coliformes.
d) Registrar el N de tubos positivos para cada dilucin.

II.2.- Prueba confirmativa para coliformes totales y fecales

Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas se transfieren a caldo LBVB para confirmar
coliformes totales y a caldo EC para confirmar coliformes termotolertantes.
II.2.1.- Procedimiento para confirmar coliformes totales
a) Mezclar por agitacin el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inculo con asa a tubos de
fermentacin que contienen caldo LBVB. Se debe tener la precaucin de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inculo de cultivo viable.
b) Incubar los tubos con caldo LBVB a 35C durante 24 a 48 horas.
c) Al trmino del perodo de incubacin observar la formacin de gas en los tubos de fermentacin
de caldo LBVB.
d) La presencia de gas en los tubos de fermentacin de caldo LBVB significa una prueba
confirmativa positiva para coliformes totales. Ausencia de gas constituye una prueba negativa.
e) Registrar los resultados de la prueba confirmativa.

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II.2.2.- Procedimiento para confirmar coliformes fecales

a) Mezclar por agitacin el tubo de la prueba presuntiva y transferir un inculo con asa a tubos de
fermentacin que contienen caldo EC temperados previamente a 44,5C por mnimo 30 minutos. Enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inculo de cultivo viable.
b) Incubar los tubos en un bao de agua con cubierta a 44,5C por 24 horas El nivel de agua del
bao debe sobrepasar el nivel de caldo de los tubos.
c) Al trmino del perodo de incubacin observar la formacin de gas en los tubos.
d) La presencia de gas significa una prueba confirmativa para coliformes termotolerantes. Ausencia de gas significa una prueba negativa para coliformes termotolerantes.
e) Registrar los resultados de las pruebas confirmativas y de los controles.
II.3.- Clculo y expresin de resultados
La combinacin de tubos positivos y/o negativos de las pruebas confirmativas es referida a la tabla
NMP para serie de 5 tubos (Anexo N3) y se expresa como:
NMP de coliformes totales por 100 mL de muestra
NMP de coliformes termotolerantes por 100 mL de muestra

III.- RECUENTO DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E. coli EN

ALIMENTOS POR MTODO EN PLACA.
III.1.- Prueba presuntiva
a) Preparar la muestra de alimento de acuerdo al procedimiento recomendado en "Preparacin de
diluciones de muestras de alimentos".
a) Depositar 1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10 -2 y 10-3 (o mayores) en placas de Petri
previamente identificadas.
b) Verter en cada placa 15 mL de Agar VRBL (Rojo Neutro Cristal Violeta Lactosa) temperado a
48C.
c) Mover la placa con movimientos rotatorios para mezclar la muestra y el medio, segn tcnica
descrita en RAM.
d) Una vez solidificado el agar, agregar aproximadamente 5 mL del mismo agar para formar una
capa superficial.
e) Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 35C durante 48 horas.

f) Seleccionar la dilucin cuyas placas contengan entre 25 y 250 colonias. Contar las colonias
sospechosas tanto tpicas como atpicas.

57

 Colonias tpicas: Color rojo intenso, con precipitado (lactosa positiva).

Colonias atpicas: Color rosado, amarillentas o caf claro con o sin precipitado.
g) Registrar el recuento presuntivo, multiplicando el nmero de colonias por el valor recproco de
la dilucin correspondiente.
III.2. Pruebas confirmativas para coliformes totales y fecales
Procedimiento
a) Seleccionar 5 colonias sospechosas e inocular cada colonia en un tubo de fermentacin, que
contiene caldo EC e inocular la misma colonia en un tubo de fermentacin que contiene caldo
LBVB. Tener la precaucin de inocular primero el caldo EC y luego el LBVB.
b) Incubar los tubos de caldo EC en bao de agua a 44,5C durante 24 horas y observar la
formacin de gas. Registrar como prueba positiva la presencia de gas y como negativa, la
ausencia de gas.
c) Incubar los tubos de caldo LBVB a 35C durante 48 horas. Al trmino del perodo de
incubacin observar la formacin de gas.
d) Registrar como prueba positiva aquellos tubos que presentan gas. La ausencia de gas se
considera prueba negativa.
e) Registrar los resultados del test confirmativo.
III.2.1.- Clculo y expresin de resultados
Coliformes totales
Cuando todas las colonias sometidas a confirmacin dan un resultado positivo, significa que el
recuento presuntivo fue confirmado. Si slo algunas colonias resultan positivas, es necesario calcular el
recuento de coliformes totales utilizando la siguiente frmula:
N = A x B/C
Donde N, es el recuento de coliformes totales por gramo mL de producto; A, es el recuento
presuntivo (colonias sospechosas x el valor recproco de la respectiva dilucin); B, el nmero de
colonias confirmadas como coliformes en CLBVB y; C, el nmero (5) de colonias sometidas a
confirmacin.

El resultado se expresa en ufc de coliformes totales por g mL de alimento.

Exprese los resultados con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.
Ejemplo:
2.30 ~ 2,3 x 102 ufc/g mL

58

Coliformes termotolerantes
Cuando todas las colonias sometidas a confirmacin dan un resultado positivo, significa que el
recuento presuntivo fue confirmado. Si slo algunas colonias resultan positivas, es necesario calcular el
recuento de coliformes termotolerantes utilizando la siguiente frmula:
N = A x B/C
Donde N, es el recuento de coliformes termotolerantes por gramo mL de producto; A, es el recuento
presuntivo (colonias sospechosas x el valor recproco de la respectiva dilucin); B, el nmero de
colonias confirmadas como coliformes termotolerantes en caldo E.C y; C, el nmero (5) de colonias
sometidas a confirmacin.
El resultado se expresa de la misma forma que para coliformes totales.
III.3.- Prueba confirmativa para Escherichia coli
a) De cada tubo de caldo EC que presente formacin de gas en el test confirmativo de coliformes
termotolerantes, transferir un inculo a una placa de agar EMB-Levine y sembrar por agotamiento en superficie para obtener colonias aisladas.
b) Incubar las placas invertidas a 35C por 18 a 24 horas. Al trmino del perodo de incubacin
observar las colonias que presentan un centro oscuro con o sin brillo metlico.
c) De cada placa de agar EMB-Levine transferir 2 colonias aisladas a tubos de Agar Nutritivo o
Agar Tripticasa. Tras incubar a 35C durante 24 horas, realizar la prueba IMViC (Indol, Rojo de
Metilo, Voges-Proskauer y Citrato).
Clculo y expresin de resultados
Cuando todas las colonias sometidas a confirmacin dan un resultado positivo, significa que el
recuento presuntivo fue confirmado. Si slo algunas colonias resultan positivas, es necesario calcular el
recuento de Escherichia coli utilizando la siguiente frmula:
N = A x B/C
Donde N, es el recuento de Escherichia coli por gramo mL de producto; A, es el recuento presuntivo
(colonias sospechosas x el valor recproco de la respectiva dilucin); B, el nmero de colonias
confirmadas como Escherichia coli a travs de la prueba IMViC y; C, el nmero (5) de colonias
sometidas a confirmacin.
El resultado se expresa de la misma forma que para coliformes totales y termotolerantes.

59

Sesin N4
RECUENTO DE Staphylococcus aureus

INTRODUCCION
Staphylococcus aureus pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es una bacteria inmvil, Gram
positiva, esfrica y usualmente agrupada en racimos, aero-anaerobia facultativa, catalasa positiva.
Produce generalmente la enzima coagulasa, fermenta el manitol y otros azcares formando cido pero
no gas. El crecimiento ocurre en un amplio rango de temperatura (6,5 a 50C), siendo el ptimo 3040C. Tolera concentraciones altas de cloruro de sodio y es capaz de desarrollarse aerbicamente en
alimentos con bajo aw (0.86).
Staphylococcus aureus es un microorganismo que se destruye fcilmente con altas temperaturas y por
casi todos los agentes desinfectantes, por lo cual la presencia de esta bacteria en alimentos procesados o
en equipos, generalmente indica higiene deficiente o contaminacin post proceso de origen humano.
El crecimiento de S. aureus en alimentos presenta un riesgo en salud pblica debido a que algunas
cepas producen enterotoxinas termoestables (A, B, C1, C2, C3, D Y E), las cuales causan intoxicacin
alimentaria de alta incidencia.
Los sntomas ms caractersticos de esta intoxicacin son: vmito, nuseas, diarrea y el perodo de
incubacin es de 1 a 6 horas.
Los alimentos comnmente asociados a intoxicaciones son: lcteos, productos de pastelera
especialmente con crema, carnes y productos crneos, etc.

I.- RECUENTO DE Staphylococcus aureus POR EL MTODO EN PLACAS

I.1.- Procedimiento
a) Preparar la muestra segn procedimiento indicado en "Preparacin de diluciones de muestras de
alimentos".
b) Depositar 0.1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 (o mayores) sobre la
superficie de Baird-Parker.
c) Extender el inculo mediante rastrillo estril en toda la superficie del agar.
d) Incubar a 35C durante 48 horas.
e) Realizar recuento de todas las colonias de color negro o gris oscuro, brillantes, convexas, de 2-3
mm de dimetro, de consistencia cremosa y que presenten una o ms de las siguientes
caractersticas:
Discreta zona de precipitado debajo de la colonia.

60

 Una zona clara o halo alrededor de la colonia, con una zona de precipitado debajo de ella.
Una zona clara o halo alrededor de la colonia, sin precipitado.
f) Registrar como recuento presuntivo la suma del nmero de colonias tpicas de S aureus
obtenidas en cada dilucin y multiplicar por el valor recproco de la dilucin respectiva.
I.2.- Pruebas de confirmacin
Prueba de la coagulasa
a)
b)
c)
d)

Repicar 5 colonias tpicas y sembrar en caldo cerebro corazn.

Incubar a 35C durante 20 - 24 horas.
Traspasar 0,1 mL de cultivo a un tubo con 0,3 mL de plasma de conejo.
Incubar a 35C y examinar peridicamente por un lapso de 6 horas para observar la formacin
de cogulo. Solamente un cogulo firme y completo que permanece en su lugar al agitar o
invertir el tubo, es considerado positivo para S. aureus.

Prueba de aglutinacin de partculas de ltex

Esta prueba reemplaza puede reemplazar a la prueba de la coagulasa
a) Repicar 5 colonias tpicas y sembrar mediante estras en una placa con Agar Tripticasa
b) Incubar a 35C durante 20 - 24 horas.
c) Confirmar mediante la prueba de aglutinacin de partculas de ltex: Staphytect Plus Latex
Agglutination Kit (Oxoid)
d) Las colonias que origen una reaccin de precipitacin sern consideradas como Staphylococcus
aureus.
I.3.- Clculo y expresin de resultados
El recuento total de Staphylococus aureus se obtiene mediante la siguiente frmula:
N = A x B/C
Donde N, es el recuento total S. aureus por gramo o mL de producto; A, es el recuento presuntivo
(colonias sospechosas x el valor recproco de la respectiva dilucin); B, el nmero de colonias
confirmadas como S. aureus mediante la prueba de coagulas o aglutinacin y; C, el nmero (5) de
colonias sometidas a la prueba confirmativa.
El resultado se expresa en ufc de S. aureus por g mL de alimento.

Exprese los resultados con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.

61

Ejemplo: 27.000 ~ 2,7 x 104 ufc/g mL

II.- RECUENTO DE S. aureus MEDIANTE LA TCNICA DEL NMP

El mtodo de NMP es recomendado para rutina en productos en los cuales se presume que:
El nmero de S. aureus es bajo,
Contengan una gran poblacin de especies competitivas,
Hayan sido sometidos a tratamientos drsticos que impliquen dao celular.

II.1.- Procedimiento
a) Preparar la muestra segn procedimiento indicado en Preparacin de las diluciones de
muestras de alimentos.
b) Inocular 9 tubos de Caldo Tripticasa suplementado con 10% de NaCl y 1 % de Piruvato de
Sodio:
3 tubos con 1 mL de la dilucin 10 -1
3 tubos con 1 mL de la dilucin 10 -2
3 tubos con 1 mL de la dilucin 10 -3
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
l)

Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo.

Incubar a 35C por 48 horas.
Registrar como positivos todos aquellos tubos que presentan turbidez.
De cada uno de los tubos positivos sembrar por agotamiento en estras sobre la superficie de
placas de Agar Baird- Parker, previamente secas.
Incubar a 35C por 48 horas.
Repicar a caldo cerebro corazn o agar Tripticasa una o ms colonias caractersticas
provenientes de cada dilucin.
Incubar a 35C por 18 - 24 horas.
Realizar las pruebas de confirmacin (Coagulasa o Staphytect Plus Latex Agglutination Kit)
Registrar los resultados.
Considerar como positivo el tubo en que se confirma al menos una colonia.

II.2.- Clculo y expresin de resultados

Consultar la tabla NMP (Anexo N1) y calcular como se indica en NMP de coliformes. El resultado se
expresa como NMP de S. aureus por g mL de muestra.

62

UNIDADES DE INVESTIGACIN
ACTIVIDAD:
Presentacin final de Unidades de Investigacin, incorporacin de sugerencias al desarrollo del trabajo
y entrega de requerimientos de materiales e insumos y carta Gantt de trabajo, incluyendo inicio de los
trabajos.

63

Sesin N5
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
INTRODUCCION
Los mohos y levaduras son fcilmente encontrados en alimentos, incluso en aquellos en los cuales el
ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej. a pH 5 o menor, baja actividad de
agua (aw 0.75), alto contenido de sal o azcar, baja temperatura de almacenamiento y presencia de
antibiticos.
Los mohos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer en condiciones
de aerobiosis o anaerobiosis y su desarrollo es ms rpido que el que presentan los mohos.
Existen varios medios de cultivo recomendados para el recuento de mohos y levaduras en alimentos. La
selectividad de estos medios se logra ya sea por disminucin de pH a valores bajo 4 o por adicin de
antibiticos tales como cloramfenicol, oxitetraciclina o gentamicina.

I.- Procedimiento
a) Preparar la muestra segn procedimiento indicado en "Preparacin de diluciones de muestras de
alimentos.
b) Sembrar 0.1 mL (en duplicado) de las diluciones 10-1, 10 -2 y 10-3 (o mayores) sobre la superficie
del agar seleccionado (Agar Papa Glucosa Cloranfenicol, PDA ;Agar Dicloran Rojo de
Bengala Cloranfenicol, DRBC o; Agar Extracto de Malta, MEA).
c) Extender el inculo mediante rastrillo estril en toda la superficie del agar.
d) Incubar a 22-25C durante 3 a 5 das.
e) Seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si slo se dispone de placas con
menos de 20 colonias, utilizar dichas placas.
f) Contar las colonias de mohos que se presentan bajo una forma filamentosa caracterstica
(micelio) y de color variable.
g) Contar por separado las colonias de levaduras. Se presentan en forma de colonias cremosas,
blancas o coloreadas.
h) Para confirmar la presencia de levaduras, se debe realizar un examen microscpico (frotis
fresco).
i) Registrar por separado el nmero de colonias de mohos y levaduras, respectivamente, y
multiplicar por valor recproco del factor de dilucin correspondiente.
Se recomienda NO mover las placas antes del tercer da de incubacin para evitar la formacin
de colonias secundarias por dispersin de esporas.
Las esporas de los mohos se dispersan con gran facilidad, por lo tanto, es necesario manipular
cuidadosamente las placas Petri, para evitar la contaminacin del rea de trabajo.

64

II.- Clculo y expresin de resultados

El recuento total de mohos y/o levaduras se obtiene mediante la siguiente frmula:
N = A x 10
Donde N, es el recuento total de mohos y/o levaduras por gramo mL de producto y A, el nmero de
colonias contadas en la placa seleccionada multiplicado por el valor reciproco del factor de dilucin
correspondiente. Este valor es multiplicado por 10 para que el resultado quede expresado en ufc/g
ml., de lo contrario quedara expresado en ufc/0.1g ml, dado que se sembr 0.1 mL de las respectivas
diluciones.
Exprese los resultados con slo un nmero entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la
potencia correspondiente.
Ejemplo:
2.400 ~ 2,4 x 103 ufc/g mL

65

Sesin N6
INVESTIGACIN DE Salmonella
INTRODUCCION
Los miembros del gnero Salmonella son grmenes patgenos para el ser humano y los animales.
Se clasifican en la Fam. Enterobacteriaceae: son bacilos Gram negativos anarobios facultativos, no
esporulados, mviles por flagelos pertricos, no encapsulados. Pueden resistir la congelacin y la
desecacin, mantienen su infectividad por semanas en hielo, alimentos, tierra y agua.
Salmonella tiene tres tipos de antgenos: Ag O (somtico; LPS), Ag H (flagelar) y Ag Vi o K
(capsular). En base a la combinacin de antgenos se distinguen ms 2.500 serovariedades.
La incidencia anual de aislamientos de Salmonella de origen humano se ha incrementado ao a ao,
y en pases desarrollados se estima que slo un 1% de los casos reales se diagnostica y registra.
La naturaleza de la enfermedad causada por S. Typhi y S. Parathyphi es septismica y produce fiebres
entricas. Otros serotipos, como S. Enteritidis, producen sntomas de gastroenteritis como nuseas,
vmitos, dolor abdominal, fiebre y diarrea. El perodo de incubacin vara de 6 a 48 horas,
dependiendo de la dosis infectiva que puede ser en algunos casos 15 a 20 clulas.
Una de las fuentes principales de contaminacin por Salmonella son los alimentos de origen animal,
aguas contaminadas y vegetales regados con stas.
TAXONOMIA
De acuerdo a la clasificacin de Le Minor y Popoff, el gnero Salmonella comprende dos especies:
Salmonella enterica y Salmonella bongori.
La especie S. enterica esta dividida en 6 subespecies o subgrupos.
I.
S. enterica subespecie enterica
II.
S. enterica subespecie salamae
III. a .S. enterica subespecie arizonae
III. b .S. enterica sub especie diarizonae
IV. S. enterica subespecie houtenae
V. S. enterica sub especie indica
En la subespecie I se encuentra la mayora de las Salmonella sp. que causan enfermedad en el hombre,
tales como S. Typhi , S. Parathyphi, S. Typhimurium y S. Enteritidis.

66

I.- PROCEDIMIENTO
I.1.- Preparacin de la muestra y preenriquecimiento NO selectivo
a) Pesar 25g de muestra en una bolsa de Stomacher.
b) Vierta 225 ml Agua Peptonada Tamponada y homogenice en el Stomacher a 230 rpm durante
1-2 minutos.
c) Transferir el homogenizado a un frasco de boca ancha estril de 500 mL e incbelo a 35C por
18-24 horas.
I.2.- Enriquecimiento selectivo
a) Tras el periodo de incubacin, agitar suavemente y transferir 1mL a 10mL de Caldo Selenito
Cistina (CSC) conteniendo Novobiocina (1%) y 0,1mL a 10mL Caldo Rappaport-Vassiliadis
(CRV).
b) Incubar por 24 horas el CSC a 35C y el CRV a 43C.
I.3.- Aislamiento en agar selectivo
a) Agitar los tubos utilizando un Vortex. Con asa curva sembrar por agotamiento en estra una
alcuota de cada uno de los caldos sobre Agar Salmonella-Shigella (SS) y Agar Xilosa Lisina
Desoxicolato (XLD). La superficie del agar debe estar seca; para ello, preparar las placas el da
anterior y mantenerlas a temperatura ambiente.
b) Incubar las placas a 35C por 24 - 48 horas.
c) Lectura: observar en las placas la presencia de colonias sospechosas.
Agar Salmonella - Shigella (SS): Colonias transparentes u opacas, por lo general lisas
con o sin centro oscuro.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD): Colonias transparentes con o sin centro oscuro.
I.4.- Identificacin (pruebas bioqumicas)
a) Seleccionar 2 o ms colonias tpicas o sospechosas de cada una de las placas de agar selectivo.
Inocular cada una de las colonias en TSI, LIA, MIO y UREA.
b) Incubar los medios a 35C por 24 horas.

I.5.- Confirmacin
Se confirman serolgicamente todas las colonias que cumplan las combinaciones bioqumicas
compatibles con Salmonella (ver Tabla). En nuestro la laboratorio usamos un antisuero polivalente

67

Salmonella O antiserum Poly A-I &Vi (Difco).

Interpretacin de las pruebas bioqumicas del gnero Salmonella

TSI
LIA
O/A, con o sin K/K o K/A, con o sin
produccin de gas y/o produccin de gas y/o
H2S.
H2S.

MIO
+-+
+--

UREA
Negativa

I.6.- Expresin de resultados

Exprese los resultados como ausencia o presencia de Salmonella en 25 g de muestra.
TECNICAS ESPECIALES
Dependiendo de la naturaleza de la muestra en algunos casos se deben considerar algunas etapas en la
tcnica que difieren de la estandarizada
Agua
- Utilizar la proporcin 1:1 muestra/caldo Selenita - Cistina de doble concentracin.
- Incubar a 35C por 18, 48 y 72 horas.
- Realizar traspasos a agares selectivos en cada uno de los tiempos sealados prosiguiendo con la
reincubacin de la muestra hasta completar las 72 horas.
Especias
- En algunas especias como pimienta, canela y organo en que no se conoce bien su capacidad
inhibidora, es necesario aumentar la proporcin a 1:100 muestra/Agua Peptonada Tamponada.
En el caso de clavos de olor, sta debe aumentarse a 1:1.000.

Huevos enteros
- Lavar con agua corriente.
- Sumergir en Hipoclorito de sodio a 18 % o etanol al 70% por 3 minutos.
- Quebrar aspticamente.
- Pesar 25 g de yema en 225 mL de caldo Soya Tripticasa, mezclar.
- Dejar 60 minutos a temperatura ambiente. Ajustar a pH 6,8 0,2.
Huevos lquidos
-

Suspender 25mL en 225mI de Agua Peptonada Tamponada o Caldo Soya Tripticasa.

68

Leche en polvo
- Pesar 25g.
- Disolver a 45C en agua destilada con Verde Brillante al 1 % (2 mL por litro).
- Dejar reposar por 60 5 minutos a temperatura ambiente
- Ajustar a pH 6,8 0.2
Productos congelados
- Descongelar a 2-5C por 18 hrs.
- Pesar 25g en 225 mL de Agua Peptonada Tamponada y dejar reposar por 60 5 minutos.
Nota: Para ajustar pH utilizar NaOH 1N o HCl lN.

69

Sesin N7
INVESTIGACIN DE Listeria monocytogenes
INTRODUCCIN
Listeria monocytogenes es el agente etiolgico de la listeriosis. Es una bacteria Gram positiva, con
forma de bacilos cortos y regulares. Es asporgena, catalasa positiva y oxidasa negativa. Crece tanto en
presencia como en ausencia de oxgeno (anaerobia facultativa) y a una temperatura ptima
comprendida entre 30 y 37C; sin embargo, igual puede crecer a 4C (psicrtrofa). Es usualmente mvil
cuando crece entre 20 y 25 C, pero no a 35C; exhibe un movimiento caracterstico de tumbos.
L. monocytogenes se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y el tracto digestivo de
personas y animales, pudiendo ser stos portadores asintomticos. El organismo tambin existe en la
naturaleza como un saprofito natural de la matera vegetal, particularmente en aquella en
descomposicin. Debido a su amplia distribucin tiene muchas oportunidades de contaminar alimentos
en distintos pasos de la produccin alimentaria, siendo sta la va ms comn por la que el ser humano
adquiere la infeccin.
Los alimentos ms frecuentemente implicados con brotes de listeriosis son los productos crnicos
procesados (pavo, pollo y pat), leche y quesos, ensalada de hortalizas y frutas frescas. Tambin
pescados (principalmente, salmn ahumado). La dosis infectiva mnima de la bacteria es de >102
clulas/gramo.
I.- PROCEDIMIENTO
I.1.- Enriquecimiento selectivo primario
a) Pesar 25g de muestra en una bolsa de Stomacher.
b) Vierta 225 mL de Caldo Demi-Fraser (Caldo Fraser suplementado con la mitad del suplemento
selectivo) y homogenice en el Stomacher a 230 rpm durante 1-2 minutos.
c) Transfiera el homogenizado a un frasco de boca ancha estril de 500 mL e incbelo a 30C por
48 horas.
I.2.- Enriquecimiento selectivo secundario
a) Tras el periodo de incubacin, agitar el frasco suavemente y transferir 0.1 mL del cultivo a un
tubo que contenga 10 mL de caldo Fraser (preparado con la totalidad del suplemento selectivo).
b) Incubar por 24-26 horas a 35C.
I.3.- Aislamiento en agar selectivo

70

a) A partir de los tubos con cultivos ennegrecidos (positivos), tome una alcuota con asa curva y
simbrela por agotamiento en estra sobre Agar Palcam.
b) Incube a 35C por 24 - 48 horas.
c) Tras el periodo de incubacin observe en las placas la presencia de colonias sospechosas:
colonias de color gris-verde con halo negro.
I.4.- Identificacin
a) Seleccionar 2 o ms colonias tpicas y simbrelas por estra sobre la superficie de placas con
Agar ALOA.
b) Incube a 35C durante 24-48 horas.
c) Tras el periodo de incubacin examine las colonias. Las colonias tpicas de L. mononocytogenes
son de color verde con halo transparente.
I.5.- Confirmacin

La confirmacin se realiza utilizando el sistema API Listeria o bien discos para la diferenciacin de
L. monocytogenes de la firma BioLife.

I.6.- Expresin de resultados

Exprese los resultados como ausencia o presencia de Listeria monocytogenes en 25 g de muestra.

71

Sesin N 8 y 9
DESARROLLO DE UNIDADES DE INVESTIGACIN
1.- Desarrollo de actividades relacionadas con las Unidades de Investigacin, trabajo en equipos.
2.- Toma de muestras, anlisis, siembra, incubacin de placas.
3.- Programacin de interpretacin de resultados y desarrollo de informe de Unidad de Investigacin.

72

ANEXO N1
TABLA DEL NUMERO MAS PROBABLE (N.M.P) PARA SERIE DE 3 TUBOS
Nmero ms probable por gramo de muestra, utilizando serie de 3 tubos inoculados con 1 mL de las
diluciones 1:10, 1:100 y 1:1000.

N Tubos
Positivos

NMP/g

N Tubos
Positivos

NMP/g

N Tubos
Positivos

NMP/g

N Tubos
Positivos

NMP/g

0-0-0
0-0-1
0-0-2
0-0-3

<3
3
6
9

1-0-0
1-0-1
1-0-2
1-0-3

3.6
7.2
11
15

2-0-0
2-0-1
2-0-2
2-0-3

9.1
14
20
26

3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-0-3

23
39
64
95

0-1-0
0-1-1
0-1-2
0-1-3

3
6
9.2
12

1-1-0
1-1-1
1-1-2
1-1-3

7.3
11
15
19

2-1-0
2-1-1
2-1-2
2-1-3

15
20
27
34

3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-1-3

43
75
120
160

0-2-0
0-2-1
0-2-2
0-2-3

6.2
9.3
13
16

1-2-0
1-2-1
1-2-2
1-2-3

11
15
20
24

2-2-0
2-2-1
2-2-2
2-2-3

21
28
35
42

3-2-0
3-2-1
3-2-2
3-2-3

93
150
210
290

0-3-0
0-3-1
0-3-2
0-3-3

9.4
13
16
19

1-3-0
1-3-1
1-3-2
1-3-3

16
20
24
29

2-3-0
2-3-1
2-3-2
2-3-3

29
36
44
53

3-3-0
3-3-1
3-3-2
3-3-3

240
460
1100
>1100

73

ANEXO N2.
TABLA DEL NUMERO MAS PROBABLE (N.M.P) PARA SERIE DE 5 TUBOS
Nmero ms probable por 100 mL de muestra, utilizando serie de 5 tubos inoculados con 10 ml, 1 ml y
0.1 ml, respectivamente.
N Tubos
Positivos
0-0-0
0-0-1
0-0-2
0-0-3
0-0-4
0-0-5

NMP/100 ml

NMP/100 ml

< 1.8
1.8
3.6
5.4
7.2
9.0

N Tubos
Positivos
1-0-0
1-0-1
1-0-2
1-0-3
1-0-4
1-0-5

NMP/100 ml

2.0
4.0
6.0
8.0
10
12

N Tubos
Positivos
2-0-0
2-0-1
2-0-2
2-0-3
2-0-4
2-0-5

0-1-0
0-1-1
0-1-2
0-1-3
0-1-4
0-1-5

1.8
3.6
5.5
7.3
9.1
11

1-1-0
1-1-1
1-1-2
1-1-3
1-1-4
1-1-5

4.0
6.1
8.1
10
12
14

2-1-0
2-1-1
2-1-2
2-1-3
2-1-4
2-1-5

6.8
9.2
12
14
17
19

0-2-0
0-2-1
0-2-2
0-2-3
0-2-4
0-2-5

3.7
5.5
7.4
9.2
11
13

1-2-0
1-2-1
1-2-2
1-2-3
1-2-4
1-2-5

6.1
8.2
10
12
15
17

2-2-0
2-2-1
2-2-2
2-2-3
2-2-4
2-2-5

9.3
12
14
17
19
22

0-3-0
0-3-1
0-3-2
0-3-3
0-3-4
0-3-5

5.6
7.4
9.3
11
13
15

1-3-0
1-3-1
1-3-2
1-3-3
1-3-4
1-3-5

8.3
10
13
15
17
19

2-3-0
2-3-1
2-3-2
2-3-3
2-3-4
2-3-5

12
14
17
20
22
25

0-4-0
0-4-1
0-4-2
0-4-3
0-4-4
0-4-5

7.5
9.4
11
13
15
17

1-4-0
1-4-1
1-4-2
1-4-3
1-4-4
1-4-5

11
13
15
17
19
22

2-4-0
2-4-1
2-4-2
2-4-3
2-4-4
2-4-5

15
17
20
23
25
28

0-5-0
0-5-1
0-5-2
0-5-3
0-5-4
0-5-5

9.4
11
13
15
17
19

1-5-0
1-5-1
1-5-2
1-5-3
1-5-4
1-5-5

13
15
17
19
22
24

2-5-0
2-5-1
2-5-2
2-5-3
2-5-4
2-5-5

17
20
23
26
29
32

4.5
6.8
9.1
12
14
16

Contina..

74

Continuacin.
N Tubos
Positivos
3-0-0
3-0-1
3-0-2
3-0-3
3-0-4
3-0-5

NMP/100 ml

NMP/100 ml

7.8
11
13
16
20
25

N Tubos
Positivos
4-0-0
4-0-1
4-0-2
4-0-3
4-0-4
4-0-5

NMP/100 ml

13
17
21
25
30
36

N Tubos
Positivos
5-0-0
5-0-1
5-0-2
5-0-3
5-0-4
5-0-5

3-1-0
3-1-1
3-1-2
3-1-3
3-1-4
3-1-5

11
14
17
20
23
27

4-1-0
4-1-1
4-1-2
4-1-3
4-1-4
4-1-5

17
21
26
31
36
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