Uso de Amônia

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS
CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLGICAS

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
GISLENE MOTA DA SILVA
PR-TRATAMENTO DO BAGAO DE CANA DE ACAR

COM AMNIA AQUOSA PARA A PRODUO DE
ETANOL
SO CARLOS SP
Fevereiro de 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLGICAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA
GISLENE MOTA DA SILVA
PR-TRATAMENTO DO BAGAO DE CANA DE ACAR COM

AMNIA AQUOSA PARA A PRODUO DE ETANOL
Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao
em
Engenharia
Qumica
da
Universidade Federal de So Carlos como parte

dos requisitos necessrios obteno do ttulo de
Mestre
em
Engenharia
Qumica,
rea
de
concentrao Pesquisa e Desenvolvimento de

Processos Qumicos.
Orientao: Prof. Dr. Antonio Jos Gonalves da Cruz

Co-Orientao: Profa. Dra. Rosineide Gomes da Silva
SO CARLOS SP
Fevereiro de 2011
Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitria da UFSCar
S586pb
Silva, Gislene Mota da.

Pr-tratamento do bagao de cana de acar com amnia
aquosa para a produo de etanol / Gislene Mota da Silva. -So Carlos : UFSCar, 2011.
104 f.
Dissertao (Mestrado) -- Universidade Federal de So
Carlos, 2011.
1. Engenharia bioqumica. 2. Biomassa. 3. Pr-tratamento
alcalino. 4. Amnia aquosa. 5. Hidrlise enzimtica. 6.
Fermentao alcolica. I. Ttulo.
CDD: 660.63 (20a)
Este trabalho dedicado a

Deus e a toda minha famlia
que sempre me apoiou.
Muito Obrigada.
Na hora de resolver um problema, no descreia da soluo, como quem comea a viajar

sem esperana de atingir o destino.
Descrena mente fraca.
Seja forte e reaja.
Sobretudo, acredite que o problema no existe, existindo apenas um conjunto de idias

que, se achar difcil, um problema e, se achar fcil, nada .
Seguro os pensamentos para no carem na dvida.
Reconhea-se com a fora de um gigante e nada veja como imodificvel.
Reduza o problema.
Uma pessoa pequena frente ao mar, mas grande frente a um pingo.
AGRADECIMENTOS
A minha famlia Me, Pai e Irm, que sempre me incentivaram e me apoiaram ao longo da
realizao desse trabalho.
Aos Professores Antonio Jos Gonalves da Cruz e Rosineide Gomes da Silva pela
orientao, conselhos e apoio.
Aos amigos dos Laboratrios Geral, Controle, Tecnologia Enzimtica e Simulao.

Agradeo a todos, pelo grande companheirismo e amizade.
Ao Programa de Ps-graduao do Departamento de Engenharia Qumica da

Universidade Federal de So Carlos - UFSCar por tornar possvel a realizao deste
trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvomento Cientfico e Tecnolgico - CNPq pelo apoio

financeiro para a realizao do curso de mestrado.
Ao projeto temtico BIOEN-FAPESP pelo apoio financeiro.
empresa Genencor pelo fornecimento das enzimas utilizadas neste trabalho.
E a todas as outras pessoas que, de maneira direta ou indiretamente colaboraram para a

elaborao desse trabalho.
MUITO OBRIGADA!
SUMRIO
Sumrio
Lista de Figuras
iv
Lista de Tabelas
ix
Lista de Abreviaturas
xii
Resumo
xiii
Abstract
xiv
1. INTRODUO
1.1 Objetivos
1.1.1 Objetivos especficos
2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Cana de acar
2.2 Leveduras
2.3 Metabolismo da glicose
2.4 Produo de etanol
10
2.5 Materiais lignocelulsicos
12
2.5.1 Estruturas das fibras e fibrilas
13
2.5.2 Celulose
14
2.5.3 Hemicelulose
16
2.5.4 Lignina
18
2.5.5 Extrativos
20
2.6 Pr-tratamento
20
2.6.1 Amnia aquosa
23
ii
2.7 Hidrlise
27
3. MATERIAIS E MTODOS
31
3.1 Bagao de cana de acar
32
3.2 Enzimas
33
3.3 Microorganismos
33
3.4 Pr-tratamento do bagao de cana
33
3.4.1 Pr-tratamento com amnia aquosa a temperatura ambiente
35
3.4.2 Pr-tratamento do bagao explodido com amnia aquosa a 50C
35
3.4.3 Pr-tratamento do bagao in natura com amnia aquosa a 100C
35
36
3.5 Caracterizao qumica dos bagaos de cana de acar
37
3.5.1 Hidrlise cida
37
3.5.2 Determinao da lignina solvel
38
3.5.3 Determinao de lignina insolvel
38
3.5.4 Determinao de cinzas da lignina e do bagao
39
3.5.5 Determinao de carboidratos e cidos orgnicos
40
3.5.6 Determinao de hidroximetilfurfural e de furfural
40
3.6 Hidrlise enzimtica
41
3.6.1 Determinao da concentrao de glicose
41
3.6.2 Bagao explodido pr-tratado com amnia aquosa a 50C
42
3.6.3 Bagao in natura pr-tratado com amnia aquosa a 100C
42
42
3.6.5 Bagao in natura e explodido pr-tratado com amnia aquosa a 100C
43
3.7 Fermentao alcolica
44
3.7.1 Determinao da concentrao de etanol
44
3.7.2 Preparo do inculo e do meio de fermentao alcolica
44
47
3.8 Anlise por microscopia eletrnica de varredura (MEV)
49
iii
4. RESULTADOS E DISCUSSO
50
4.1 Caracterizao dos bagaos in natura e explodido
50
4.1.1 Caracterizao dos bagaos pr-tratados a temperatura ambiente 243 C
54
4.1.2 Caracterizao dos bagaos pr-tratados a 50C
63
4.1.3 Caracterizao do bagao in natura pr-tratado a 100C
68
4.1.4 Caracterizao do bagao explodido pr-tratados a 100C
71
4.2 Hidrlise enzimtica e fermentao alcolica
75
75
81
83
4.2.4 Bagao in natura e explodido pr-tratados com amnia aquosa a 100C
85
5. CONCLUSO
90
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
93
APNCIE A: Cromatogramas das anlises dos hidrolisados para o bagao explodido no tratado
com NH4OH e pr-tratados a 50C
101
iv
Lista de Figuras
Figura 1. Mapa da produo de cana de acar
Figura 2. Diagrama do catabolismo da glicose em clulas de S. cerevisiae
Figura 3. Estrutura de uma fibra vegetal
13
Figura 4. Unidade de celobiose
14
Figura 5. Cadeias com extremidades no redutora e redutora do polmero de celulose
15
Figura 6. Posio das ligaes inter e intramoleculares
16
Figura 7. Estruturas dos monossacardeos que formam as hemiceluloses
17
Figura 8. Estrutura proposta para a macromlecula de lignina de Fagus sp
19
Figura 9. Estrutura dos precursores da lignina
19
Figura 10. Regies especficas da celulose
28
Figura 11. Modo de ao do complexo celulsico de T. reesei
29
Figura 12. Fluxograma das etapas envolvidas no estudo do pr-tratamento das amostras de
bagao de cana de acar in natura e explodido no lavado
31
Figura 13. Fotografia ilustrando amostra de bagao in natura (matria-prima proveniente da

Usina Iracema, gentilmente cedida pelo CTC, Piracicaba, SP)
32
v
Figura 14. Fotografia ilustrando amostra de bagao explodido. Condies de pr-tratamento:
exploso a vapor a 17 kgf, 205C, tempo de reao 20 minutos (matria-prima gentilmente
cedida pelo CTC, Piracicaba, SP)
32
Figura 15. Fotografia ilustrando reator de ao inoxidvel (autoclave) utilizado nos

experimentos de pr-tratamento do bagao de cana de acar
34
Figura 16. Planejamento dos experimentos de fermentao a partir dos hidrolisados

provenientes do bagao in natura
47

provenientes do bagao explodido
47
Figura 18. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) dos bagaos in natura (A)
e explodido (B)
53
Figura 19. Microscopia eletrnica de varredura do bagao in natura (A) no tratado com
amnia aquosa , (B) in natura tratado por 7 dias, (C) in natura tratado por 15 dias e (D) in
natura tratado por 30 dias
55
Figura 20. Razo celulose/hemicelulose em funo do tempo de pr-tratamento (amostra de

bagao in natura tratado temperatura ambiente)
56
Figura 21. Razo celulose/lignina em funo do tempo de pr-tratamento (amostra de bagao

in natura tratado temperatura ambiente)
57
Figura 22. Razo hemicelulose/lignina em funo do tempo de pr-tratamento (amostra de

bagao in natura tratado temperatura ambiente)
57
Figura 23. Microscopia eletrnica de varredura do bagao explodido no lavado: (A) no

tratado, (B) explodido tratado por 7 dias, (C) explodido tratado por 15 dias e (D) explodido
tratado por 30 dias
59
vi
bagao explodido no lavado tratado temperatura ambiente)
60

explodido no lavado tratado temperatura ambiente)
61

bagao explodido no lavado tratado temperatura ambiente)
61
Figura 27. Microscopia eletrnica de varredura do bagao explodido no lavado

(A) no tratado, (B) tratado com soluo de NH4OH por 30 min, (C) tratado com soluo de
NH4OH por 60 min e (D) tratado com soluo de NH4OH por 90 min
64

bagao explodido no lavado tratado temperatura de 50C)
65

explodido no lavado tratado temperatura de 50C)
66

bagao explodido no lavado tratado temperatura de 50C)
66
Figura 31. Microscopia eletrnica de varredura das amostras de bagao in natura: (A) no
tratado, (B) tratada com soluo 4% (m/m) de NH4OH, (C) tratada com soluo 10% (m/m)
de NH4OH e (D) tratada com soluo 15% (m/m) de NH4OH
70
Figura 32. Microscopia eletrnica de varredura do bagao explodido no lavado (A) no

tratado com soluo de NH4OH, (B) explodido tratado com 5% NH4OH, (C) explodido
tratado com 10% NH4OH e (D) explodido tratado com 15% NH4OH
73
Figura 33. Concentrao de glicose durante o experimento de hidrlise do bagao explodido

pr-tratado com soluo de NH4OH (15% m/m) a 50C por 30 minutos
75
vii
Figura 34. Converso em glicose do bagao explodido tratado por 30 minutos
76

77
Figura 36. Converso em glicose do bagao explodido tratado por 60 minutos
77

78
Figura 38. Converso em glicose do bagao explodido tratado 90 minutos
78
Figura 39. Concentrao de glicose ao longo de experimento de hidrlise enzimtica do

bagao explodido (cominudo a 20 mesh)
79
Figura 40. Converso em glicose do bagao explodido (cominudo a 20 mesh)
79
Figura 41. Concentrao de glicose ao longo dos experimentos empregando bagao in natura
no tratado com amnia aquosa e bagao in natura pr-tratado com soluo de NH4OH nas
concentraes de 4, 10 e 15% (m/m)
81
Figura 42. Concentrao de etanol dos bagaos in natura no tratado e pr-tratado com
soluo de NH4OH nas concentraes de 4, 10 e 15% (m/m)
82
Figura 43. Concentrao de glicose ao longo dos experimentos empregando bagao

explodido no tratado e explodido pr-tratado com soluo de NH4OH nas concentraes de
5, 10 e 15% (m/m)
83
Figura 44. Concentrao de etanol do bagao explodido no tratado e pr-tratado com

soluo de NH4OH nas concentraes de 5, 10 e 15% (m/m)
84
viii
Figura 45. Concentrao de glicose do bagao in natura pr-tratado com soluo de NH4OH
10% (m/m)
85
Figura 46. Concentrao de etanol do bagao in natura em vrias condies de preparo de

inculo
86
Figura 47. Concentrao de glicose do bagao explodido pr-tratado com 15% de soluo de
NH4OH
87
Figura 48. Concentrao de etanol do bagao explodido em vrias condies de preparo de

inculo
88
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1. Proporo da mistura de lcool anidro gasolina
11
Tabela 2. Composio mdia do bagao de cana de acar.
12
Tabela 3. Comparaes das condies e desempenho das hidrlises
27
Tabela 4. Condies de pr-tratamentos estudados neste trabalho
34
Tabela 5. Condies experimentais empregadas nos experimentos de hidrlise enzimtica 41
Tabela 6. Composio do meio de inoculao
45
Tabela 7. Composio dos meios de fermentao
46
Tabela 8. Composio dos meios de inoculao (inculos denominados de rico

e pobre)
48
Tabela 9. Composio dos meios de fermentaes rico e pobre
49
Tabela 10. Composio qumica das amostras de bagao in natura e explodido

no lavado
50
Tabela 11. Fatores de converso para a celulose
51
Tabela 12. Fatores de converso para a hemicelulose
51
Tabela 13. Composio qumica do bagao de cana in natura
51
Tabela 14. Composio qumica do bagao de cana explodido no lavado
52
x
Tabela 15. Composio do bagao in natura e explodido (Gouveia et al., 2009)
52
Tabela 16. Composio qumica das amostras de bagao in natura tratadas por 7, 15 e 30 dias
a temperatura ambiente 243 C
54
Tabela 17. Razes das principais fraes do bagao em funo do tempo de reao para os
experimentos realizados com amostras de bagao in natura tratadas com soluo de
hidrxido de amnio (28% m/m) a 243C
56
Tabela 18. Composio qumica do bagao explodido no lavado tratado por 7, 15 e 30 dias a
temperatura ambiente, 243 C
58
Tabela 19. Razes das principais fraes do bagao em funo do tempo de reao para os
experimentos realizados com amostras de bagao explodido no lavado tratadas com soluo
de hidrxido de amnio (28% m/m) a 243 C
60
Tabela 20. Composio qumica do bagao explodido tratado por 30, 60 e 90 minutos
63
Tabela 21. Resumo das correlaes de todos os experimentos utilizando bagao explodido
tratado com 15% de soluo de amnia aquosa a 50C
65
Tabela 22. Composio qumica do bagao in natura tratado com soluo de NH4OH 4, 10 e
15%
68
Tabela 23. Valores corrigidos da caracterizao qumica das amostras de bagao in natura
tratadas com 4, 10 e 15% de soluo de NH4OH
69
Tabela 24. Composio qumica das amostras de bagao explodido tratadas com soluo de
NH4OH 5, 10 e 15%
71
Tabela 25. Valores corrigidos da composio das amostras de bagao explodido tratadas com
5, 10 e 15% de soluo de NH4OH
72
xi
Tabela 26. Resultados obtidos nos pr-tratamentos realizados a temperatura de 100C para os
bagaos in natura e explodido
74
Tabela 27. Resultados obtidos nos experimentos de hidrlise enzimtica e fermentao das
amostras
de
bagao
explodido
no
tratado
pr-tratados
de NH4OH 15% (m/m)
com
soluo
80
Tabela 28. Resultados obtidos nos experimentos de hidrlise enzimtica e fermentao

alcolica das amostras do bagao in natura no tratado e pr-tratados a 100C
82
Tabela 29. Resultados obtidos nos experimentos de hidrlise enzimtica e fermentao das
amostras do bagao explodido no lavado e pr-tratados a 100C
84
Tabela 30. Influncia dos inculos no desempenho da fermentao alcolica do hidrolisado

proveniente da amostra de bagao in natura
86
Tabela 31. Influncia dos inculos no desempenho da fermentao alcolica do hidrolisado

proveniente da amostra de bagao explodido
88

alcolica das amostras dos bagaos in natura e explodido pr-tratados
89
xii
Lista de Abreviaturas
AFEX
Ammonia Fiber Explosion
ANP
Agncia Nacional do Petrleo
ATP
Adenosina Trifosfato
BIOEN
Programa FAPESP de Pesquisa em Bioenergia
BG
-glucosidase
CBU/g
Cellobiase Unit per gram (Unidade de Celobiase por grama)
CLAE
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
EG
Endoglucanase
FPU/g
Filter Paper Unit per gram (Unidade de Papel de Filtro por grama)
GP
Grau de Polimerizao
HMF
Hidroximetilfurfural
MEV
Microscopia Eletrnica de Varredura
NADH
Nicotinamida Adenosina Dinucleotdeo
RID
ndice de Refrao
SAA
Soaking in Aqueous Ammonia
SCB
Sugar Cane Bagasse
SEAA
Soaking in Ethanol and Aqueous Ammonia
SFS
Sacarificao e Fermentao Separadas
SSF
Sacarificao e Fermentao Simultneas
UV/VIS
Espectrofotometria de Absoro no Ultravioleta e Visvel
xiii
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a etapa de pr-tratamento do bagao de cana de acar
empregando amnia aquosa, um mtodo alcalino. Amostras de bagao (in natura e explodido a vapor
no lavado) foram tratadas na proporo 1:5 (massa de bagao seco por massa de soluo de
NH4OH), em escala de bancada. Ensaios preliminares foram realizados empregando soluo 28%
(m/m) de NH4OH, a temperatura ambiente 24 3 C por 7, 15 e 30 dias em recipiente fechado.
Nestes experimentos verificou-se que o pr-tratamento foi seletivo na remoo de lignina e
hemicelulose. Novos experimentos foram realizados fixando-se a temperatura em 50C e a
concentrao de NH4OH em 15%. Avaliaram-se tempos de reao de 30, 60 e 90 min. Nestes prtratamentos o mesmo comportamento foi observado. Nos prximos ensaios o tempo de reao foi
fixado em 60 min e a temperatura em 100C. Amostras de bagao foram pr-tratadas em solues de
NH4OH (4 a 15%). Experimentos de hidrlise enzimtica foram realizados em frascos de Erlenmeyer
(50C, pH 4,8 e 250 rpm) empregando 30 FPU/g bagao (Accellerase 1500, Genencor) e 5 CBU/g
bagao (BG, Genencor). Na hidrlise das amostras de bagao in natura (pr-tratadas com solues de
NH4OH 4, 10 e 15%, 60 min, 100C) com carga de slidos de 3% a melhor converso em glicose foi
de 64,2% (amostra tratada NH4OH 10%). Na hidrlise da amostra de bagao explodido (pr-tratadas
com NH4OH 5, 10 e 15%, 60 min e 100C) com carga de slidos de 7% a melhor converso em
glicose foi de 79,9% (amostra tratada com NH4OH 15 %). Hidrlises com maior carga de slidos, 5%
(bagao in natura) e 10% (bagao explodido), utilizando 30 FPU/g celulose (Accellerase 1500,
Genencor) foram realizadas. Nestes ensaios obteve-se converso em glicose de 69,6% (bagao in
natura) e 82,2% (bagao explodido). Experimentos de fermentao alcolica (250 rpm, 30C) foram
realizados empregando levedura Saccharomyces cerevisiae (comercial e industrial) em meios de
cultivo denominados rico e pobre. A eficincia na converso da glicose em etanol nos
experimentos foi acima de 78% (meio pobre) e da ordem de 88% (meio rico). A levedura
industrial apresentou eficincia um pouco superior comercial. As amostras de bagao (antes e aps
o pr-tratamento) foram analisadas por microscopia eletrnica de varredura (MEV).
Palavras-chave: Biomassa, pr-tratamento alcalino, amnia aquosa, hidrlise enzimtica e

fermentao alcolica.
xiv
ABSTRACT
The aim of this work was evaluated the sugarcane bagasse (SCB) pretreatment by
aqueous ammonia, an alkaline method. Samples of SCB (in natura and steam exploded
unwashed) were pretreated with ammonium hydroxide solution (NH4OH) at 1:5 solid-liquid
ratio (by weight), in a bench scale. Preliminary assays were carried out employing NH4OH
solution (28% w/w) at room temperature 24 3 C by 7, 15 and 30 days. In these
experiments, it was observed that the pretreatment was selective in removing lignin and
hemicellulose. New experiments were carried out using at 50C and NH4OH 15% during 30,
60 and 90 minutes. In these pretreatments the same behavior was observed. In the next
assays, it decided to fix the reaction time in 60 minutes and the temperature in 100C.
Samples of in nature and steam exploded SCB were pretreated at diffent NH4OH
concentrations (4 to 15%). Enzymatic hydrolysis assays were carried out in Erlenmeyers
flasks (50C, pH 4.8 and 250 rpm) using 30 FPU/g bagasse (Accellerase 1500, Genencor)
and 5 CBU/g bagasse (BG, Genencor). Experiments were carried out employing in natura
SCB (pretreated conditions 4, 10 and 15% NH4OH solution, 60 min., 100C) with 3% of
solid loading. A glucose conversion of 64.2% was reached in the best condition (10%
NH4OH solution). Experiments were carried out employing steam exploded SCB (5, 10 e
15% NH4OH solution, 60 min. and 100C) with 5% of solid loading. A glucose conversion of
79.9% was reached in the best condition (15% NH4OH solution). Hydrolysis experiments
using higher solid loading (5% for in natura and 10% for steam exploded) and 30 FPU/g
cellulose (Accellerase 1500) were carried out. A glucose conversion of 69.6% for in natura
and 82.2% for steam exploded SCB were obtained. Fermentation assays (250 rpm, 30C)
employing commercial and industrial Saccharomyces cerevisiae were conducted, in a rich
and poor medium. A theoretical fermentation yield up to 78% was found for the poor
medium and around 88% for the rich medium. The industrial S. cerevisiae shows a value of
yield slightly superior to those of commercial strain. Samples of SCB (before and after
pretreatment) were analyzed by scanning electron micrograph (SEM).
Key-words: Biomass, alkaline pre-treatment, aqueous ammonia, enzymatic hydrolyzes and
alcoholic fermentation.
1. INTRODUO
Os combustveis fsseis so uma fonte de energia no renovvel e demoram

milhes de anos para se formarem, por isso, nas ltimas dcadas grandes esforos foram
feitos para o desenvolvimento dos biocombustveis. Ao contrrio dos combustveis
fsseis, os biocombustveis so fontes de energias renovveis produzidos a partir de
matrias orgnicas, como a cana de acar. Existem vrios tipos de biocombustveis,
tais como o bioetanol, o biodiesel, a biomassa e o biogs (Bioetanol, 2008).
No Brasil a produo de bioetanol a partir da cana de acar o principal
combustvel substituto da gasolina, sendo empregado na forma hidratada para motores
movidos a lcool e na forma anidra quando misturado na gasolina (Martins, 2009).
Novas tecnologias foram empregadas nas ltimas dcadas com perspectiva de evoluo
no setor com novos produtos obtidos a partir da cana de acar.
O etanol celulsico uma das alternativas sustentveis para obteno de
combustvel renovvel, pois utiliza resduos lignocelulsicos como fonte de energia
sendo, portanto, de grande importncia para o meio ambiente, pois diminui a emisso de
gases poluentes para a atmosfera.
Os materiais lignocelulsicos so muitos abundantes no Brasil e podem ser
obtidos de vrios processos agro-industriais, tais como as usinas de acar e lcool.
Estes resduos agro-industriais contm grandes quantidades de acares fermentescveis
que podem ser hidrolisados e fermentados para a produo de etanol de segunda
gerao.
O bagao de cana de acar constitudo basicamente de celulose, hemicelulose
e lignina. A celulose um polmero linear do dmero glicose-glicose (celobiose), rgido
e difcil de ser quebrada. A sua hidrlise completa gera glicose (acar de seis carbonos
fermentescvel). A hemicelulose constituda de cadeia principal de xilose (ligaes 1,4) com vrias ramificaes de manose, arabinose, galactose entre outras, a sua
hidrlise mais fcil que a da celulose, mas a fermentao das pentoses (acar de
cinco carbonos) no to desenvolvida como a da glicose. Para se produzir o etanol de
celulsico necessrio a deslignificao do bagao, tratamento das pentoses que esto
contidas na hemicelulose e hidrlise da celulose. Por fim, a lignina no est relacionada
s molculas de acares simples, portanto no relacionada produo de bioetanol
por rotas fermentativas (Bioetanol, 2008).
As etapas para a produo de bioetanol a partir de biomassa lignocelulsica se

resumem em pr-tratamento do bagao, deslignificao, hidrlise e fermentao. No
pr-tratamento se faz a quebra do material lignocelulsico a fim de torn-lo mais
acessvel aos tratamentos qumicos ou biolgicos. A etapa seguinte consiste na hidrlise
da celulose, tambm denominada de pr-tratamento, e na remoo da lignina (Bioetanol,
2008).
A fermentao dos acares redutores hidrolisados da biomassa segue o mesmo
princpio da produo com base em acares e amido. O ponto crucial ter uma
converso mxima dos acares com o menor custo possvel (Baudel, 2006).
Novas tecnologias esto sendo apontadas na literatura para aumentar o
rendimento no processo de produo do etanol celulsico como a Fermentao
Simultnea das Pentoses e Hexoses que utiliza a frao solvel e insolvel do material
produzido no pr-tratamento sem separao da lignina-carboidrato, visando maximizar a
sacarificao e a concentrao de acares no hidrolisado (Baudel, 2006).
As hidrlises enzimticas da produo de bioetanol a partir do bagao de cana de
acar levam vantagens (temperaturas moderadas, rendimentos elevados e possibilidade
de Sacarificao e Fermentao Simultneas - SSF) frente s hidrlises qumicas.
Porm, as rotas enzimticas tm um custo ainda elevado o que inviabiliza a sua
aplicao em escala industrial.
Os processos de hidrlise enzimtica devem ser concebidos em funo do tipo
de substrato produzido, do pr-tratamento utilizado, assim como a estratgia de
fermentao utilizada: Hidrlise e Fermentao Simultnea, Hidrlise e Fermentao
Consecutiva e Hidrlise e co-Fermentao Simultneas (Baudel, 2006).
Existe uma grande quantidade de processos de pr-tratamento disponveis,
podendo ser fsicos (reduo do tamanho das partculas), qumicos (cidos, alcalinos ou
oxidativos), biolgicos (empregando fungos e algumas bactrias) ou de fracionamento
por solvente.
O pr-tratamento do bagao de cana de acar com amnia aquosa (soluo de
hidrxido de amnio) tem sido descrito na literatura e apresenta algumas vantagens em
relao aos demais tratamentos. Neste pr-tratamento a amnia utilizada como um
reagente para remover a lignina. Em baixas concentraes a amnia no poluente, no
corrosiva e de fcil manuseio.
Este trabalho se insere no projeto temtico Bioprocess System Engineering
(BSE) applied to the production of bioethanol from sugar cane bagasse que vem sendo
2
desenvolvido pelo grupo de pesquisa do Laboratrio de Desenvolvimento e Automao

de Bioprocessos (LaDABio) do Departamento de Engenharia Qumica da UFSCar
(DEQ/UFSCar) com apoio financeiro do programa de bionergia (BIOEN) da FAPESP
(Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo). O trabalho estudou o prtratamento alcalino empregando soluo de hidrxido de amnio (amnia aquosa) em
diferentes condies operacionais. O objetivo foi identificar condio que conduzisse,
na frao slida, a mximos rendimentos de glicose, na etapa de hidrlise, e de etanol,
na etapa de fermentao.
1.1 Objetivos
O objetivo deste trabalho foi estudar a etapa de pr-tratamento do bagao de

cana de acar empregando soluo de hidrxido de amnio (amnia aquosa). Foram
empregadas amostras de bagao in-natura e explodido no lavado. As amostras dos
materiais pr-tratados foram submetidas hidrlise enzimtica com o objetivo de
avaliar a converso em glicose. Os hidrolisados obtidos foram utilizados em
experimentos para produo de etanol por Saccharomyces cerevisiae.
1.1.1 Objetivos especficos

Realizar experimentos de pr-tratamento empregando amostras de
bagao in natura e explodido no lavado estudando variveis como a
concentrao da soluo de NH4OH, a temperatura e o tempo de reao;
Caracterizar quimicamente e fisicamente (MEV) as amostras do bagao
de cana de acar in-natura e explodido a vapor no lavado, antes e
aps a etapa de pr-tratamento, determinando os teores dos seus
principais constituintes: celulose, hemicelulose e lignina total;
Realizar experimentos de hidrlise enzimtica empregando as diferentes
amostras pr-tratadas de bagao in natura e explodido a vapor no
lavado em diferentes cargas de slido e de enzimas. Os experimentos
foram realizados em frascos de Erlenmeyer em shaker (rotao de
200/250 rpm, pH 4,8 da soluo e temperatura da hidrlise enzimtica
50oC);
Realizar
experimentos
de
fermentao
alcolica
utilizando
os
hidrolisados obtidos a partir das amostras pr-tratadas nas diferentes

condies experimentais. Os experimentos foram realizados em frascos
de Erlenmeyer em shaker (rotao de 250 rpm e temperatura da
fermentao alcolica 30oC) empregando levedura Saccharomyces
cerevisiae.
2. REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Cana de Acar
A cana de acar tem sua origem no sudeste asitico e pertence a famlia das
angiospermas, a Poaceae. So herbceas, perene, com ns (de onde saem gemas) e
entrens, epiderme caracterstica, raiz fasciculada e flores monclinas. As folhas da
cana de acar so alternas ou opostas, possuem nervuras paralelinrvias e bainhas
largas, so lineares e podem chegar a 140 centmetros de comprimento. O seu fruto
bem pequeno, do tipo cariopse. Dentre seus constituintes esto sacarose, as fibras, o
cido ascrbico, o cido hidrocinico e sais minerais (Moreira et al., 2008).
A explorao canavieira no incio foi sobre a espcie S. officinarum, mas com o
surgimento de doenas houve a necessidade do cruzamento da S. officinarum com as
quatro outras espcies do gnero Saccharum e, posteriormente, atravs de recruzamento
com as ascendentes. A cana de acar tem inmeras aplicaes podendo ser empregada
in natura, sob a forma de forragem, para alimentao animal ou como matria-prima
para a fabricao de aguardente, melao, acar e lcool.
No Brasil a cana de acar foi trazida pelos portugueses na primeira dcada do
sculo XVI, sendo desenvolvida com sucesso no nordeste brasileiro, principalmente em
faixas litornea. O Brasil se tornou o principal produtor e exportador de acar nos
sculos XVI e XVII. A Figura 1 apresenta um mapa das regies produtoras de cana de
acar em 2008.
Atualmente no Brasil, a produo de cana de acar se concentra na regio
Centro-Sul, principalmente no interior do estado de So Paulo que se destaca pelo
volume produzido (UNICA, 2008).
Na produo de bioetanol pelas usinas brasileiras a cana processada com a
retirada do colmo (caule), que esmagado, liberando o caldo. Este concentrado,
resultando no mel, a partir do qual se obtm o acar (por cristalizao). O subproduto
deste processo, o melao, ou mel final, ento combinado com o caldo de segunda e
encaminhado para dornas de fermentao, onde se obtm o etanol.
Figura 1. Mapa da produo de cana de acar. Nas reas em vermelho concentram-se

as plantaes e usinas produtoras de lcool, acar e co-gerao de energia eltrica
(UNICA, 2008).
2.2 Leveduras
As leveduras so fungos unicelulares, no filamentosos, caracteristicamente

esfricas ou ovais, so amplamente encontradas na natureza. As leveduras de
brotamento, como Saccharomyces, reproduzem-se formando clulas desiguais de forma
6
assexuada. No brotamento a clula parental forma uma protuberncia na sua superfcie

externa e medida que o broto se desenvolve, o ncleo da clula parental se divide, e
um dos ncleos migra para o broto. A membrana celular sintetizada entre a clula
parental e o broto. E assim, o broto se separa da clula parental. Uma clula de levedura
pode produzir mais de 24 clulas filhas por brotamento (Lehninger, 2002).
As leveduras so capazes de crescimento anaerbico facultativo. Podem utilizar
oxignio ou um componente orgnico como aceptor final de eltrons. Isto permite que
os fungos sobrevivam em vrios ambientes. Se o meio tiver oxignio, as leveduras
respiram aerobicamente para metabolizar hidratos de carbono formando dixido de
carbono e gua; na ausncia de oxignio, elas fermentam os hidratos de carbono e
produzem etanol e dixido de carbono (Lehninger, 2002).
A levedura mais utilizada na produo do etanol a Saccharomyces cerevisiae.
Esta levedura apresenta duas vias de utilizao de sacarose bem definidas: a hidrlise
extracelular pela ao da invertase periplasmtica (produzindo glicose e frutose que so
captadas e fermentadas pela clula), e outra envolvendo o transporte ativo da sacarose
com posterior hidrlise intracelular do acar. Porm, a hidrlise extracelular do
dissacardeo indesejada na produo de etanol combustvel, pois contribui para
incrementar o estresse osmtico sofrido pelas clulas, gerado pelos elevados nveis de
acares redutores formados, e os monossacardeos liberados no meio podem servir de
fonte de carbono para microorganismos contaminantes de processo fermentativo (Drio
et al., 2008).
2.3 Metabolismo da Glicose
Gliclise o processo de quebra e oxidao da glicose que ocorre na ausncia de

oxignio (processo anaerbico), tambm chamado de via da hexose difosfato.
A glicose o principal substrato oxidvel utilizada pela maioria dos organismos
(fonte energtica universal). A glicose (C6H12O6) dividida em duas molculas de
piruvato na via glicoltica (Lehninger, 2002).
A gliclise consiste em 10 reaes enzimticas que ocorrem no citosol das
clulas, e utiliza 10% do potencial energtico da glicose. A primeira fase da gliclise
chamada de fase preparatria que consiste nas cinco primeiras etapas, em que a energia
do ATP (trifosfato de adenosina) investida para aumentar o contedo da energia livre

dos intermedirios para a formao do produto final, o gliceraldedo 3-fosfato e o seu
ismero diidroxiacetona fosfato (Lehninger, 2002).
Na segunda fase da gliclise se tem um ganho lquido de duas molculas de ATP
por molcula de glicose. E a energia tambm conservada na formao de duas
molculas de NADH (nicotinamida adenina dinucleotdeo) para cada molcula de
glicose (Lehninger, 2002).
Em condies aerbicas, o piruvato oxidado com perda de carboxilato na
forma de CO2, para liberar o Acetil-CoA que no ciclo do cido ctrico ser totalmente
oxidado a CO2 (Lehninger, 2002).
Outra rota para o metabolismo do piruvato a sua reduo a lactato por meio da
chamada via da fermentao do cido lctico. E a terceira grande rota do metabolismo
do piruvato leva a produo de etanol, em condies anaerbicas nas leveduras,
denominada de fermentao alcolica (Lehninger, 2002).
A gliclise libera apenas uma pequena frao da energia total disponvel na
molcula da glicose, as duas molculas de piruvato formadas pela gliclise ainda retm
a maior parte da energia potencial qumica existente na molcula da glicose (Lehninger,
2002).
A glicose catabolisada pela Saccharomyces cerevisiae pela via aerbica ou
anaerbica, para produzir ATP. Na ausncia de O2 a nica possibilidade a via
anaerbica, mas mesmo na presena de oxignio, a via anaerbica tambm escolhida
se a concentrao de glicose estiver acima de um valor chamado concentrao crtica
(Ccrit) (Barnett, 1976; Entian e Barnett, 1992; Alexander e Jeffries, 1990). A S.
cerevisiae faz uso exclusivo da via aerbica somente em concentraes abaixo da
concentrao crtica (Ccrit) (Rettori e Volpe, 2000).
A explicao deste comportamento est no fenmeno chamado de represso por
glicose. Na presena de concentraes acima da Ccrit, a glicose reprime a expresso dos
genes que codificam enzimas do ciclo de Krebs, enzimas da cadeia respiratria e
estruturas mitocndriais (Barnett, 1976; Porro et al., 1994).
Portanto, atividade
mitocondrial reduzida leva o piruvato para via anaerbica, ou seja, para a produo de
etanol. Por outro lado, em concentraes de glicose abaixo da Ccrit e na presena de O2,
o piruvato seguir a via aerbica, porque ao no se encontrarem reprimidos os genes em
questo, a S. cerevisiae possuir alta atividade mitocondrial (Rettori e Volpe, 2000). A
Figura 2 ilustra um diagrama do catabolismo da glicose em Saccharomyces cerevisiae.
8
Figura 2. Diagrama do catabolismo da glicose em clulas de S. cerevisiae (Rettori e

Volpe, 2000).
A fermentao alcolica um processo de baixo rendimento energtico no qual

o etanol permanece com a maior parte da energia contida na molcula de glicose,
energia esta que ser utilizada quando o etanol queimar como combustvel (Rettori e
Volpe, 2000).
Para a produo de etanol, a maioria das usinas emprega o processo de batelada
alimentada com recirculao e tratamento da levedura (processo Melle-Boinot). Este
processo o mais seguro quando se tem problemas de assepsia e manuteno, pois ao
final de cada batelada a dorna esvaziada e realiza-se a assepsia antes de iniciar uma
nova fermentao (Martins, 2009).
2.4 Produo de Etanol
O lcool hidratado comeou a ser utilizado no Brasil em larga escala h mais de

trinta anos. Com a preocupao mundial devido ao aquecimento global e o aumento no
preo do petrleo tm-se expectativas de um grande crescimento na produo de
bioetanol. Atualmente, o Brasil o maior produtor mundial de cana de acar, que a
matria-prima mais eficiente para a produo de etanol.
A ascenso do lcool teve incio na dcada de 70, quando foi lanado o
Programa Nacional do lcool (Prolcool). Nessa poca, o mundo enfrentava a crise do
petrleo. O governo brasileiro apostou no pro-lcool como alternativa para reduzir a
dependncia das importaes do combustvel fssil. O alto preo do petrleo fez o
programa de incentivo produo e ao uso de lcool decolar.
O pro-lcool teve grande sucesso at meados da dcada de 90, poca em que
cerca de 96% dos veculos nacionais eram fabricados com motores movidos a lcool.
Depois de um momento de grande incentivo, o pro-lcool entrou em crise, devido ao
esgotamento dos recursos governamentais destinados ao programa e ao descompasso
entre a oferta e a demanda de lcool. Alm disso, a partir de 1986, o preo do petrleo
caiu drasticamente, reduzindo a competitividade do lcool no mercado dos combustveis
(Severo, 2009).
Depois de um perodo de sucesso e de crise, atualmente o setor sucroalcooleiro
est enfrentando uma terceira fase, a de recuperao. Nesta nova etapa, o Brasil voltou a
ser um grande consumidor de lcool, devido adoo da tecnologia flex-fuel nos
motores dos automveis. Alm disso, recentemente o Brasil tornou-se tambm grande
exportador mundial de bioetanol (Severo, 2009).
O bioetanol produzido no Brasil considerado um dos principais substitutos da
gasolina, sendo empregado como combustvel na forma hidratada de 92,6 a 93,8%
INPM, no caso de motores movidos lcool, ou na forma anidra mnimo de 99,3%
INPM, como aditivo gasolina (Martins, 2009). A Tabela 1 apresenta a evoluo da
proporo da mistura de lcool anidro na gasolina.
10
Tabela 1. Proporo da mistura de lcool anidro gasolina (Martins, 2009).

Ano
Volume de lcool
(L)
Volume de
gasolina (L)
Porcentagem de
etanol na gasolina
(%)
1979
0,14
0,86
14
1980
0,17
0,83
17
1981
0,12
0,88
12
1982-1986
0,20
0,80
20
1987-2002
0,22
0,78
22
2002-2007
0,24
0,76
24
2007-2009
0,25
0,75
25
Fonte: ANP (2009).
Para a produo do etanol de segunda gerao, que obtido da hidrlise da

celulose do bagao de cana, se tem h necessidade de fortes investimentos em
tecnologias. As estratgias de produo de bioetanol a partir do bagao de cana de
acar contemplam a fermentao da glicose produzida a partir da hidrlise cida ou
enzimtica da celulose. Basicamente, tais processos consistem na Sacarificao e
Fermentao Separadas (SFS), aplicvel aos processos de hidrlise cida e enzimtica
da celulose e na estratgia de Sacarificao e Fermentao Simultneas (SSF), aplicvel
ao processo de hidrlise enzimtica da celulose (Baudel, 2006).
A implementao de uma unidade autnoma para a produo de etanol
utilizando unicamente bagao de cana de acar como fonte de carboidratos caracteriza
um desafio tecnolgico complexo e particularmente interessante. Tal sistema demanda a
produo de hidrolisados com concentraes sacardicas superior a 60g/L, requerendo
uma etapa de concentrao destes previamente etapa fermentativa. Tal medida resulta
em maior complexidade operacional e maior custo global (Baudel, 2006).
Baudel et al., em 2006, relataram que experimentos realizados na Universidade
Lund (Sucia), evidenciaram a possibilidade de se produzir em mdia 210L etanol/ton
bagao seco utilizando leveduras Saccharomyces cerevisiae convencionais em
estratgias SFS, utilizando unicamente glicose como substrato. A utilizao de
Saccharomyces cerevisiae engenheiradas em sistemas SFS possibilitou um aumento
da ordem de 12% na produo de bioetanol, devido converso parcial da xilose em
etanol. Separadamente, rendimentos produtivos da ordem de 242L etanol/ton bagao
11
seco foram obtidos mediante processos SSF e Fed-Batch SSF utilizando S. cerevisiae
convencionais, enquanto rendimentos da ordem de 254L etanol/ton bagao seco foram
obtidos utilizando S. cerevisiae engenheiradas. Todos os processos utilizaram bagao
pr-tratado por exploso a vapor, utilizando como catalisador SO2 (2%).
O grande desafio da produo economicamente vivel de bioetanol a partir da
biomassa est em selecionar a melhor opo dentre as diferentes tecnologias de
disponibilizao de carboidratos do bagao de cana de acar a partir da hidrlise da
celulose em termos de custo, rendimento glicosdico e fermentabilidade do hidrolisado.
2.5 Materiais Lignocelulsicos
A biomassa oferece uma fonte abundante e barata de recursos de energia

renovvel. O resduo de cana de acar, chamado de bagao, gerado durante a
moagem da cana e abundante em regies tropicais e subtropicais como, Brasil, ndia e
sul dos Estados Unidos. Os materiais lignocelulsicos, como o bagao de cana de
acar, so constitudos por celulose, hemicelulose, lignina e outros componentes
(Knauf et al., 2004). A composio mdia dos seus trs principais constituintes
apresentada na Tabela 2.
Tabela 2. Composio mdia do bagao de cana de acar (Knauf et al., 2004).

Componente
Composio
Celulose
23-53%
Hemicelulose
20-35%
Lignina
10-25%
12
2.5.1 Estrutura das Fibras e Fibrilas
As fibras vegetais podem ser consideradas como compsitos de fibrilas de

celulose mantidas coesas por uma matriz constituda de lignina e hemicelulose
(Jayaraman et al., 2003), cuja funo agir como uma barreira natural degradao
microbiana e servir como proteo mecnica. Suas caractersticas estruturais esto
relacionadas natureza da celulose e sua cristalinidade (Figura 3) (Silva et al., 2009).
Figura 3. Estrutura de uma fibra vegetal. A imagem de MEV refere-se fibra de

Eucalipto (Silva et al., 2009).
A fibra lignocelulsica tem uma estrutura de camadas complexas por uma

parede primria fina durante o crescimento das clulas, que circunda uma parede
secundria (Figura 3). A parede secundria constituda de trs camadas (S 1, S2 e S3),
13
onde a camada intermediria S2 determina as propriedades mecnicas da fibra e consiste

em uma srie de microfibrilas, helicoidalmente formadas por longas cadeias de celulose
e organizadas no sentido da fibra. Tais microfibrilas tm o dimetro de 10 a 30nm e so
resultantes do empacotamento de 30 a 100 cadeias de celulose estendidas (Pietak et al.,
2007; Ren et al., 2008).
2.5.2 Celulose
A celulose (C6H10O5)n um polmero natural de cadeia longa, um

homopolissacardeo linear constitudo por unidades de celobiose ou anidroglicose
sindiottica ligadas entre si por ligaes glicosdicas do tipo -(14), como mostra a
Figura 4.
Figura 4. Unidade de celobiose (Fengel e Wegener, 1989).
O comprimento da cadeia da celulose nativa varia entre 10.000 a 15.000

resduos conforme a sua origem, grau de maturao da parede celular, o tempo de
envelhecimento e o processamento a que as fibras foram submetidas (Fengel e
Wegener, 1989). Hidrolisando a celulose obtm-se polmeros menores, oligossacardeos
com cadeia terminais redutoras e no redutores (Figura 5) que aps hidrlise mais
extensa, decompem-se dando origem a celobiose (dissacardeo redutor) e a glicose.
14
Figura 5. Cadeias com extremidades no redutora e redutora do polmero de celulose.
Com a quebra da ligao -D (1,4) glicosdica forma-se uma cadeia redutora e

outra no redutora. A cadeia redutora tem um aldedo hidratado, derivado da formao
do anel piranose por ligao intramolecular hemiacetal. O grupo no redutor formado
por C4-OH terminal.
O polmero natural celulose possui uma disposio linear devido hidroxila no
carbono anomrico possui orientao equatorial (Figura 6), a conformao do anel
piranosdico assume disposio em cadeira 4C1 e cadeias adjacentes formam uma rede
de ligaes de hidrognio intermoleculares (entre unidades de glicose de molculas
adjacentes) e intramoleculares (entre unidades de glicose da mesma molcula) que
estabilizam o agregado (Fengel e Wegener, 1989).
A estrutura da celulose nativa apresenta duas regies: cristalina e amorfa.
Regies altamente ordenadas so denominadas de cristalinas e as regies onde a cadeia
apresenta orientao randomizada so denominadas de amorfas (Fan et al., 1987).
Feixes de molculas de celulose se agregam na forma de microfibrilas nas regies
cristalinas que se alternam com as regies menos ordenadas (amorfas). As microfibrilas
constroem fibrilas e estas constroem as fibras celulsicas como consequncia dessa
estrutura fibrosa a celulose possui alta resistncia e praticamente insolvel em gua e
em solventes orgnicos comuns.
15
Figura 6. Posio das ligaes inter e intramoleculares na celulose.
2.5.3 Hemiceluloses
As hemiceluloses so polissacardeos que esto intimamente associadas

celulose na parede celular vegetal. So constitudas de vrios monossacardeos
polimerizados, como pentoses (L-arabinose e D-xilose), hexoses (D-glicose, D-manose
e D-galactose) e cidos urnicos (cido 4-O-metil-glucurnico e cido galacturnio). As
estruturas dos monossacardeos que formam as hemiceluloses so mostradas
na Figura 7.
16
Figura 7. Estruturas dos monossacardeos que formam as hemiceluloses.
As hemiceluloses por no possurem regies cristalinas so atingidas mais

facilmente por produtos qumicos, todavia, se ocorrer perda de alguns substituintes da
cadeia, as hemiceluloses podem sofrer cristalizao induzida pela formao de ligaes
de hidrognio, a partir de hidroxilas de cadeias adjacentes.
O principal acar encontrado nas hemiceluloses do bagao a xilose, que se
une por ligaes glicosdicas nas posies 1 e 4 (Silva et al., 2009). A hemicelulose
bastante hidroflica, contm considervel grau de ramificao entre suas cadeias, com
natureza altamente amorfa e grau de polimerizao (GP) variando entre 100 a 200
(Yang et al., 2008). O teor de hemicelulose pode variar de 20 a 35% dependendo do
tipo de tecido vegetal e espcie a que pertence.
A reao de auto-hidrlise envolve a formao de cidos a partir dos
componentes da hemicelulose, tais como o cido actico, cido frmico e o cido
glucurnico (McGnnis et al., 1983; Timell, 1967). Estes cidos gerados catalisam a
hidrlise da hemicelulose (Lora e Wayman, 1978), no entanto os cidos formados na
auto-hidrlise so cidos fracos, por isso, estes no conseguem hidrolisar a celulose.
17
2.5.4 Lignina
A lignina uma das macromolculas mais abundantes na natureza depois da

celulose, sendo incorporada durante o crescimento celular do vegetal. A lignina um
material hidrofbico com estrutura tridimensional e amorfa, altamente ramificada,
podendo ser classificada como um polifenol, o qual constitudo por um arranjo
irregular de vrias unidades de fenilpropano que pode conter grupos hidroxila e
metoxila como substituintes no grupo fenil (Silva et al., 2009). A Figura 8 ilustra
genericamente a molcula de lignina da Eucalyptus grandis.
Enquanto livros textos (como por exemplo, Fengel e Wegener, 1989)
apresentam o teor de lignina presente nos materiais lignocelulsicos como sendo da
ordem de 20 a 30%, outros autores relatam valores entre 10-25% (Knauf et al., 2004). A
lignina atua como material adesivo, como agente de enrijecimento no interior das fibras
e como barreira contra degradao enzimtica e microbiana da parede celular.
O teor de aromticos na lignina elevado, isto resultante da polimerizao
enzimtica catalisada pelos seus precursores (Ruffell et al., 2008). O mecanismo de
biossntese da lignina se processa a partir de trs alcois monomricos, o lcool
coniferlico, o lcool sinaplico e o lcool p-cumarlico (Figura 9).
A fora de adeso entre as fibras de celulose e a lignina ampliada pela
existncia de ligaes covalentes entre as cadeias de lignina e os constituintes da
celulose e da hemicelulose (Silva et al., 2009). Existe uma grande dificuldade na
elucidao qumica da estrutura da lignina devido ao fato de no haver um mtodo bem
estabelecido para isolar a lignina em sua forma nativa (John et al., 2008).
A lignina por ser o segundo composto orgnico mais abundante na Terra depois
da celulose, desempenha um papel fundamental em qualquer processo que utilize fibras
celulsicas. Na indstria a lignina queimada para gerar vapor nas caldeiras ou pode ser
utilizada como fonte de produtos qumicos, como para a produo de detergentes
(Ruffell et al.,2008).
18
Figura 8. Estrutura proposta para a macromlecula de lignina de Fagus sp (Fengel e

Wegener, 1989).
Figura 9. Estrutura qumica dos precursores da lignina.
19
2.5.5 Extrativos
Uma pequena poro da biomassa vegetal constituda por compostos

hidrofbicos ou hidroflicos que no so parte integrante da estutura celular, estes so
chamados de extrativos (Forestry Commission, 2008). possvel extrair estes
compostos utilizando solventes polares e no polares, sem degradar a estrutura da
biomassa. Alguns exemplos de extrativos: cidos graxos, ceras, alcalides, protenas,
fenlicos, acares simples, pectinas, mucilagens, gomas, resinas, terpenos, amido,
glicosdeos, saponinas e leos essenciais (Silva, 2009). Os extrativos normalmente
constituem de 4 a 10% da massa total seco do material celulsico.
2.6 Pr-Tratamento
Os materiais lignocelulsicos so resistentes a bioconverso, sendo necessrio

um pr-tratamento para garantir a acessibilidade dos agentes hidrolticos celulose. O
processo de produo de etanol a partir da biomassa lignocelulsica demanda a
transformao da celulose e hemicelulose em seus respectivos monmeros (glicose e
xilose) e posterior converso dos mesmos a etanol celulsico.
O pr-tratamento do bagao consiste em uma das etapas mais importantes em
termos de custo, alm de influenciar nas etapas anteriores e subsequentes do processo.
O pr-tratamento relaciona-se s operaes de preparao de matria-prima (moagem,
impregnao), bem como hidrlise (cida ou enzimtica) da celulose (carga e
consumo de enzimas ou cidos, taxa de reao), gerao de produtos inibidores
hidrolise enzimtica e fermentao alcolica, concentrao sacardicas dos hidrolisados
produzidos, purificao de produtos intermedirios, tratamento de resduos, agitao
mecnica e gerao de energia (Baudel, 2006).
Um pr-tratamento eficiente consiste em reduzir custos e aumentar a
produtividade de bioetanol, por isso, h a necessidade de aumentar a digestibilidade do
bagao e fazer com que a celulose torne-se mais acessvel s enzimas que convertem os
carboidratos em acares fermentescveis.
Vrios mtodos de pr-tratamento tm sido sugeridos na literatura. Estes podem
ser divididos: em mtodos biolgicos, fsicos, qumicos ou uma combinao de todos
esses. Os mtodos fsicos convertem a biomassa em ps finos, incrementando a
20
superfcie especfica da celulose, de modo que a hidrlise da mesma ocorra com relativa
facilidade (Baudel, 2006). Os mtodos qumicos objetivam remover a lignina sem
degradar a cadeia celulsica que deve apresentar propriedades adequadas sua posterior
utilizao. Como a lignina est ligada s hemiceluloses, uma degradao parcial das
hemiceluloses ocorre durante o processo de pr-tratamento, e dependendo das condies
empregadas, a celulose pode ser degradada (Sarita, 2007).
Ao longo dos anos vrios pr-tratamentos tm sido experimentados com o
objetivo de desenvolver tecnologias mais eficientes em termos de custo e
competitividade. Alguns pr-tratamentos utilizando vapor de gua, cido sulfrico,
amnia e hidrxido de clcio tm emergido dentre as opes mais promissoras (Baudel,
2006).
O pr-tratamento com gua quente, tambm conhecido com hidrotermlise
(Hot water) ou solvlise, utiliza gua comprimida em contato com a biomassa durante
intervalos de tempo de 1 a 15 minutos sob temperaturas entre 170 a 230C. Neste
processo, as partculas da biomassa tendem a se romper em contato com a gua quente
(coao), no havendo necessidade de reduzir o tamanho das mesmas. Em mdia, 40 a
60% da biomassa dissolvida no processo, com remoo de celulose variando entre 4 a
22% e uma grande parte da hemicelulose recuperada quando se usa cido como
catalisador da hidrlise do lquido produzido. Neste processo uma grande quantidade de
lignina removida entre 35 a 60%. A desvantagem da solvlise est relacionada com a
grande quantidade de gua consumida, que produz hidrolisados muitos diludos,
ocasionado problemas operacionais nas etapas subsequentes da bioconverso (Baudel,
2006).
Algumas
bases
podem
ser
usadas
no
pr-tratamento
de
materiais
lignocelulsicos e o efeito alcalino no pr-tratamento depende da quantidade de lignina

presente no material (Fan et al., 1987; McMillan, 1994). Os processos alcalinos de prtratamento utilizam condies moderadas de operaes, em termos de temperaturas e
presses, em comparao com sistemas cidos. O principal efeito consiste na remoo
da lignina da biomassa, promovendo maior reatividade da fibra. O lcali, geralmente cal
ou soda, tende a causar um inchamento da biomassa, de modo que a cristalinidade da
celulose decresce, enquanto ocorre um incremento da superfcie especfica de contato e
da porosidade da mesma. O pr-tratamento utilizando hidrxido de clcio (lime)
apresenta vantagens em termos de custo do reagente, segurana do processo e
21
possibilidade de recuperar o lcali sob a forma de carbonato de clcio mediante reao

com dixido de carbono produzido na etapa de fermentao alcolica (Baudel, 2006).
Os cidos concentrados como o cido sulfrico e o cido clordrico tm sido
utilizados no pr-tratamento de materiais lignocelulsicos. Embora, sejam agentes
poderosos para a hidrlise, os cidos concentrados so corrosivos, txicos e perigosos,
porm so recuperados no final do processo (Sivers e Zacchi, 1995).
Os processos de pr-tratamento com cido diludo conseguem altas taxas de
reao e melhora significativa na hidrlise da celulose (Esteghlalian et al., 1997). So
utilizadas temperaturas entre 140 a 200C, onde cerca de 80 a 90% das hemiceluloses
so recuperadas e 30 a 50% da lignina passvel de extrao alcalina. A hidrlise com
cido diludo demanda matria-prima com reduzido teor de cinzas e outras impurezas,
em virtude do efeito tamponante da mesma, resultando em um elevado consumo de
cido (Baudel, 2006).
O mtodo de pr-tratamento com exploso a vapor tem sido muito utilizado em
materiais lignocelulsicos (McMillan, 1994). Neste processo o material submetido a
uma alta presso saturada 6 a 34bar e uma temperatura entre 160 a 240C durante um
tempo de reao de 1 a 15 min. Aps a reao, o material submetido a uma rpida
descompresso do equipamento e coletado em um tanque de expanso. Durante o prtratamento, ocorre hidrlise das hemiceluloses que liberam os carboidratos que podem
sofrer degradao trmica e a lignina parcialmente fragmentada, tornando a estrutura
da biomassa mais susceptvel penetrao de gua, cidos e enzimas, de modo que o
potencial hidroltico da celulose incrementado (Sun e Cheng, 2002; Baudel, 2006). O
pr-tratamento com exploso a vapor atua qumica e fisicamente na biomassa.
Outro tipo de pr-tratamento fsico-qumico o AFEX (Ammonia Fibre
explosion), que consiste na verso alcalina do processo de exploso de vapor. Neste
caso, os materiais lignocelulsicos so submetidos ao da amnia lquida (2kg/kg
biomassa seca) em altas temperaturas 160 a 180C, sob uma presso de 9 a 17bar por
um perodo de tempo 10 a 20 min. Em seguida, a presso rapidamente reduzida (Sun e
Cheng, 2002). A vantagem deste processo est na elevada reatividade da fibra, mnima
gerao de compostos inibidores de fermentao, alm da recuperao da amnia.
Entretanto, o AFEX no promove uma elevada solubilizao das hemiceluloses, como
nos processos cidos, o que torna difcil a recuperao da mesma no hidrolisado
(Holtzapple et al., 1992).
22
Outro pr-tratamento que tem sido muito relatado emprega amnia aquosa
(soluo de NH4OH). O pr-tratamento com amnia aquosa pode ser utilizado em
vrios tipos de matrias-primas utilizando diferentes processos. A amnia utilizada
como um reagente para remover a lignina. Em altas temperaturas, o pr-tratamento com
amnia aquosa resulta em alta deslignificao. No entanto, a sua desvantagem est no
alto consumo de energia, formao de compostos txicos e perda de acares (Kim et
al., 2009). Entretanto estudos tm comprovado que em baixas temperaturas de reao a
amnia no poluente, no corrosiva e de fcil manuseio, diminuindo as
desvantagens observadas em altas temperaturas. O uso da amnia a temperatura
ambiente minimiza a sua interao com a hemicelulose e a formao de componentes
txicos, aumentando os rendimentos de bioconverso e fermentao (Kim et al., 2009).
A amnia consegue clivar as ligaes C-O-C na lignina e as ligaes de ster e ter
entre a lignina e a hemicelulose, permitindo que a gua penetre nas camadas internas da
celulose aumentando a rea superficial do material lignocelulsico (Balat et al., 2008).
2.6.1. Amnia aquosa
Os pr-tratamentos alcalinos quebram as ligaes entre a lignina e a

hemicelulose, permitindo assim a penetrao da gua nas camadas internas da celulose
aumentando a rea superficial do material lignocelulsico (Balat et al., 2008). O prtratamento com amnia aquosa tem sido estudado em vrios materiais lignocelulsicos
utilizando diversos processos (Kim et al., 2009).
Kim et al., em 2009 realizaram um pr-tratamento do bagao de cana de acar
com amnia aquosa em baixas concentraes a temperatura ambiente (30C), visando
observar mudanas microbiais e composicionais do bagao de cana armazenadas em
amnia diluda por um longo perodo (40 dias). Os resultados mostraram que o bagao
tratado com 0,3% de soluo de amnia aquosa diminui o nmero de bactrias
linearmente com passar do tempo e o nmero de fungos manteve-se constante ao longo
dos 40 dias. O longo tempo de estocagem resultou em uma maior deslignificao do
bagao e remoo de hemicelulose a partir de 10 dias. O teor de celulose (em massa) no
bagao manteve-se estvel durante todo o tempo de armazenamento.
23
Outros pr-tratamentos foram estudados por Kurakake et al., 2001 utilizando o

bagao de cana, sabugo de milho e gramneas. O efeito do pr-tratamento foi baseado na
remoo de lignina, liberao de acares e recuperao dos acares perdidos no prtratamento. O material lignocelulsico foi aquecido com soluo de hidrxido de
amnio e ento a amnia foi removida rapidamente por vcuo. A amostra
imediatamente foi hidrolisada enzimaticamente sem lav-la com gua. No bagao de
cana o efeito foi quase inalterado para mais de 1 mL de amnia aquosa/ g de bagao. Os
principais produtos foram glicose a partir de celulose e xilose e xilotriose a partir da
xilana. No sabugo de milho a formao de glicose a partir de celulose necessitou de
apenas 0,5 mL de amnia aquosa/ g de bagao, porm a liberao de acares da
arabinolixana no foi melhorada pelo pr-tratamento. Nas gramneas a produo de
acares primrios foi similar ao do bagao de cana. Os rendimentos de acares totais
a partir da celulose e arabinoxilana foram de 55% e 67% para a espcie Miscanthus e
44% e 54% para a espcie Solidago, respectivamente.
No ano de 1995, Yoon desenvolveu um novo mtodo de pr-tratamento
utilizando amnia aquosa. Esse mtodo foi denominado como percolao e reciclagem
da amnia (do ingls, Aqueous Ammonia Percolation, ARP). O autor relatou que a
biomassa quando aquecida a altas temperaturas (acima de 150C) com gua
pressurizada cidos so formados pela solubilizao de componentes cidos e da
desesterificao do grupo ster (ex. grupos acetatos) na hemicelulose. Esses cidos
catalisam a hidrlise da hemicelulose (Lora e Wayman, 1978) assim o pr-tratamento da
biomassa com gua quente denominado de auto-hidrlise. Os cidos formados na
hidrlise so cidos fracos, como o cido actico, cido frmico e o cido glucurnico
(McGinnis et al., 1983) e no so fortes o suficiente para hidrolisar a celulose, no
entanto, a auto-hidrlise pode seletivamente extrair a hemicelulose do material
lignocelulsico (Mok e Antal, 1992; Walch et al., 1992). A hemicelulose na biomassa
pode ser uma importante barreira para a hidrlise enzimtica da celulose (Yoon em
1998).
Yoon avaliou em 1998, a combinao do processo ARP e auto-hidrlise da
biomassa lignocelulsica. E tambm investigou o efeito da hemicelulose na
digestibilidade enzimtica. Os resultados indicaram que a temperatura da reao uma
varivel operacional importante na auto-hidrlise. Quando a temperatura de reao
aumenta a hemicelulose presente no tratado slido diminui, ou seja, a quantidade de
hemicelulose solubilizada aumenta. Na hidrlise enzimtica a enzima celulase, mais
24
provvel a endoglucanase, possui stios ativos para a hemicelulose. A hemicelulose

adsorve a enzima celulase deixando esta indisponvel para a hidrlise enzimtica da
celulose.
Uma importante observao neste estudo foram os resultados obtidos quando a
temperatura do pr-tratado foi acima de 190C (em processo de batelada). Nesta
condio quase nenhuma lignina foi removida, porm o substrato tratado apresentou alta
digestibilidade prxima do papel de filtro (substrato de referncia). Este resultado
indicou que a possvel deformao trmica da lignina ou sua despolimerizao, e no
necessariamente sua remoo, pode ser um fator importante para a digesto enzimtica
da biomassa.
Yoon concluiu que a combinao da auto-hidrlise e o ARP mostraram ser um
pr-tratamento satisfatrio, assegurando a separao seletiva da hemicelulose a partir da
biomassa assim como a deslignificao do material para dar acessibilidade a
digestibilidade enzimtica. E que a hemicelulose inibe a celulose na hidrlise
enzimtica. E o fracionamento da hemicelulose na biomassa , portanto, um prrequisito para melhorar a digestibilidade enzimtica do material lignocelulsico e
recuperar a hemicelulose.
Han et al., estudaram em 2009 ARP utilizando palha de trigo como biomassa
lignocelulsica. O pesquisador variou a temperatura de pr-tratamento de 50-170C e o
tempo de reao de 10-150 minutos. Os resultados mostraram que o slido
remanescente variou de 81% (10 min, 50C) a 58,51% (150 min, 170C). Os teores de
celulose e hemicelulose variaram na frao slido de 34,94% a 36,49% e de 10,14% a
12,69%, respectivamente. Na deslignificao a variao foi de 21,65% a 67,39%. O
aumento da temperatura no pr-tratamento teve um efeito mais pronunciado na
deslignificao. Embora a deslignificao aumente com o aumento do tempo de reao
em baixas temperaturas. No entanto, a remoo de lignina em altas temperaturas o
efeito foi pequeno com o aumento do tempo de reao. Isto sugere que a temperatura foi
um fator mais importante na remoo de lignina que o tempo de reao.
Na hidrlise enzimtica a converso foi de 90% em 36h para o tratado por 30
min a 170C (carga de 30 FPU de celulase/ g de celulose). No entanto, houve um
pequeno aumento quando a carga foi para 40 FPU de celulase/ g de celulose (>95%),
enquanto a biomassa no tratada foi menor que 35%. Considerando o custo energtico
Han trabalhou com o pr-tratado a 140C devido pequena diferena na digestibilidade
25
enzimtica.
Han et al., analisaram na fermentao a ocorrncia da formao de
inibidores (furfurais) no pr-tratamento. Na fermentao foi utilizado um controle

(glicose pura) e a palha de trigo hidrolisada com concentraes de acares similares e
os resultados obtidos das eficincias em etanol foram de 91,57% e 90,66%,
respectivamente. Isto significa que os inibidores no foram gerados pelo pr-tratamento
ARP.
Outro processo muito utilizado embebimento em amnia aquosa (termo em
ingls, Soaking in Aqueous Ammonia, SAA). Este processo tem se mostrado muito
eficaz no pr-tratamento da biomassa lignocelulsica. O mtodo SAA utiliza baixas
temperaturas para diminuir a degradao dos acares fermentescveis, formao de
compostos inibidores e solubilizao da hemicelulose. O SAA um dos poucos
processos de pr-tratamento do material lignocelulsico em que quase 100% do glucano
e mais de 80% da xilana so mantidos na biomassa considerando que uma porcentagem
significante de lignina removida. Apesar da alta eficincia na preservao dos
carboidratos ainda cerca de 20% de xilana solubilizada junto com a lignina, portanto,
esta no estar disponvel para a converso em etanol na etapa de fermentao (Tae Hyn
Kim et al., 2009).
Tae Hyn Kim et al., em 2009 realizaram um aprimoramento no processo SAA,
que foi denominado de Embebimento em Etanol e Amnia Aquosa (em ingls, Soaking
in Ethanol and Aqueous Ammonia, SEAA). Neste mtodo a biomassa pr-tratada com
soluo de etanol e amnia aquosa. Aps o pr-tratamento faz-se a operao de
separao do slido/lquido. A frao lquida entra em um evaporador onde a amnia
evaporada e recuperada por reciclo. Os slidos residuais desta frao que so
constitudos principalmente de lignina so recuperados e queimados como combustvel
em caldeiras. Os slidos obtidos a partir da mistura slido/lquido so lavados com gua
para remover amnia residual. Os slidos lavados so hidrolisados com celulases e
hemicelulases para a produo de acares fermentescveis que so fermentados a
etanol. Tae Hyn Kim et al., relatam que o objetivo do mtodo reduzir a perda de
xilana por solubilizao. No processo SEAA, o etanol adicionado na soluo de
hidrxido de amnio. A precipitao da hemicelulose com etanol tem sido utilizada na
separao e purificao de polissacardeos na biomassa lignocelulsica (Whistler et al.,
1970; Sun et al., 2001; Anderson et al., 2938). Assim, mais xilana estaria disponvel
para a hidrlise aumentando a produo de acares fermentescveis para a etapa de
26
fermentao. O etanol utilizado no processo de pr-tratamento pode ser recuperado e

reciclado (Tae Hyn Kim et al., 2009).
2.7 Hidrlise
As tecnologias para obteno de bioetanol com base em materiais

lignocelulsicos envolvem a hidrlise dos polissacardeos da biomassa em acares
fermentescveis e sua posterior fermentao para a produo do etanol (Bioetanol,
2008). Existem basicamente trs tcnicas para a obteno dos acares fermentescveis:
hidrlise com cido concentrado, hidrlise com cido diludo e a hidrlise enzimtica. A
Tabela 3 apresenta uma comparao entre os diferentes processos de hidrlise.
Tabela 3. Comparaes das condies e desempenho das hidrlises (Hamelinck et al.,

2005).
Processo
cido Diludo
cido
Insumo
Temperatura
Tempo
Sacarificao
< 1% H2SO4
215C
3 min
50-70%
30-70% H2SO4
40C
2-6 h
90%
Celulase
70C
1,5 dias
75-95%
Concentrado
Enzimtico
No processo com cido concentrado a celulose e hemicelulose so quebradas

utilizando cidos minerais fortes, tais como o cido sulfrico, o cido clordrico e o
cido fosfrico, em baixas temperaturas e com tempo de reaes longos (horas). A
desvantagem desta tcnica que requer equipamentos altamente resistentes corroso,
elevando o custo final da produo do bioetanol, portanto, a recuperao do cido
fundamental por questes econmicas e ambientais (Bioetanol, 2008).
O processo com cido diludo utiliza altas temperaturas e presses, com tempo
de reao de segundos a alguns minutos, o que facilita o uso de processo contnuo
27
(Bioetanol, 2008). Neste caso, parte da hemicelulose e da celulose so hidrolisadas

separadamente, podendo assim, a hemicelulose ser removida aps o primeiro estgio.
Devido s altas temperaturas no segundo estgio, uma quantidade considervel de
lignina e acares solveis degradada levando a uma inibio do processo de
fermentao.
A hidrlise enzimtica da celulose realizada por enzimas chamadas de
celulases que so altamente especficas (Beguin e Aubert, 1994). Na verdade, a celulase
um complexo enzimtico composto por endoglucanases (que atacam as cadeias de
celulose para produzir polissacardeos de menor comprimento), exoglucanases (que
atacam os terminais no redutores da cadeia e removem a celobiose) e -glucosidades
(que hidrolisam a celobiose e outros oligmeros glicose) (Philippidis e Smith, 1995).
A hidrlise enzimtica um processo realizado em condies mais amenas que
as hidrlises cida ou alcalina. Isto porque, a hidrlise enzimtica conduzida
usualmente em condies suaves (pH 4,8 da soluo e temperaturas entre 45 a 50C),
no apresentando problemas de corroso de equipamentos. Bactrias e fungos produzem
celulases. Esses microorganismos podem ser aerbicos ou anaerbicos, mesoflicos ou
termoflicos (Sun e Cheng, 2002).
As enzimas celulases hidrolisam a celulose a acares redutores, que podem ser
fermentados por microorganismos a bioetanol. Porm as celulases so protenas, e estas
no conseguem penetrar com facilidade a barreira da lignina, o que torna difcil o acesso
destas enzimas s fibras de celulose, por isso, de extrema importncia um prtratamento antes da hidrlise.
A celulose apresenta regies que so altamente ordenadas que tem grandes
quantidades de ligaes de hidrognio e regies menos ordenadas (amorfas), onde as
cadeias apresentam uma orientao randomizada (Figura 10) (Fan et al., 1987).
Figura 10. Regies especficas da celulose (Sarita, 2007).
28
O complexo celulsico constitudo por trs enzimas, as endoglucanases, as

celobiohidrolases ou exoglucanases e as -glucosidades ou celobiases. E cada tipo de
celulase ataca uma regio da celulose preferencialmente, como ilustra a Figura 11.
As endoglucanases atacam regies menos cristalinizadas na fibra da celulose
(ligaes internas do polmero), produzindo oligossacardeos e celobiose (Sun e Cheng,
2002). Estas enzimas atacam de forma mais ou menos aleatria as ligaes -(1-4)glicosdicas nas regies amorfas da celulose ou na superfcie das microfibrilas.
Figura 11. Modo de ao do complexo celulsico de T. reesei. (Pitarelo, 2007)
29
As celobiohidrolases ou exoglucosidases atuam nas regies terminais do

polmero da celulose, promovendo a sua despolimerizao gradativa atravs da remoo
de unidades de celobiose terminais. Estas enzimas no produzem uma quantidade
significativa de novas cadeias terminais na superfcie da celulose. A CBH I quebra as
unidades de celobiose das extremidades redutoras, enquanto a CBH II quebra as
extremidades no redutoras da cadeia (Heikinheimo, 2002).
As celobiases ou -glucosidases hidrolisam celobiose a glicose, reduzindo o
efeito inibidor da celobiose sobre as endo e exoglucanases.
O efeito do complexo da enzima celulase expresso pela ao sinrgica destas
trs enzimas diferentes na celulase e este sistema complexo de enzimas necessita ser
mantido estvel para a atividade celuloltica elevada. Em consequncia da ao das
enzimas endo e exoglucanases na celulose, a celobiose e a glicose so obtidas, e
enquanto sua concentrao no meio reacional aumenta gradualmente, as atividades das
celulases respectivas so inibidas por estes produtos, tendo por resultado uma
diminuio final na taxa e no rendimento do processo da sacarificao. A celobiose
apresenta um poder de inibio maior no complexo celuloltico do que a glicose (Sarita,
2007).
Desta forma, o desenvolvimento de novas tecnologias para o melhoramento da
hidrlise enzimtica necessrio com o intuito de se obter maiores rendimento com
menores custos. Uma opo seria incluir tentativas de recuperar as enzimas
(imobilizao) ou utilizar mtodos mais eficazes no cultivo dos microorganismos para
sintetizar estas enzimas.
30
3. MATERIAIS E MTODOS
Neste trabalho foram avaliadas diferentes condies operacionais de prtratamento utilizando como material lignocelulsico o bagao de cana de acar (in
natura e explodido a vapor no lavado). A Figura 12 apresenta o fluxograma das etapas
empregadas neste trabalho.
Figura 12. Fluxograma das etapas envolvidas no estudo do pr-tratamento das amostras
de bagao de cana de acar in natura e explodido no lavado.
31
3.1 Bagao de cana de acar
O bagao de cana de acar utilizado neste projeto foi cedido pelo CTC (Centro
de Tecnologia Canavieira, Piracicaba, SP). Empregaram-se amostras de bagao in
natura e explodido no lavado (Figuras 13 e 14). Neste trabalho no se alterou a
granulometria das amostras de bagao.
A umidade das amostras de bagao in natura e explodido no lavado foi
determinada com auxlio de um determinador de umidade (Marte, modelo ID50).
Obteve-se o valor de 51% e 55% para o bagao in natura e explodido no lavado,
respectivamente.
Figura 13. Fotografia ilustrando amostra de bagao in natura (matria-prima

proveniente da Usina Iracema, gentilmente cedida pelo CTC, Piracicaba, SP).
Figura 14. Fotografia ilustrando amostra de bagao explodido no lavado. Condies de

pr-tratamento: exploso a vapor a 17 kgf, 205C, tempo de reao 20 minutos
(matria-prima gentilmente cedida pelo CTC, Piracicaba, SP).
32
3.2 Enzimas
Neste trabalho foram utilizados dois complexos enzimticos comerciais:

complexo celulsico (Accellerase 1500), cedida pela empresa Genencor
(A Danisco Division, USA) e;
complexo enzimtico -glucosidase (BG), cedida pela empresa Genencor
(A Danisco Division, USA).
As atividades dos extratos enzimticos foram determinadas experimentalmente pelo

mtodo de Ghose (1987) modificado obtendo-se os valores de 66 FPU/mL (substrato
papel de filtro qualitativo Satlite) e 108 FPU/mL (substrato papel de filtro Whatman
no 1) para a Accellerase 1500. Para o complexo enzimtico -glucosidase (BG)
obteve-se o valor de 1.146 CBU/mL empregando substrato D-(+)-celobiose (SigmaAldrich).
3.3 Microorganismo
O microorganismo utilizado nos experimentos de fermentao alcolica foi a

levedura Saccharomyces cerevisiae. Empregou-se linhagem comercial (marca
Fleischmann) e duas linhagens industriais: uma na forma de creme de levedura (doada
pela Usina Ipiranga) e outra na forma liofilizada (cedida pelo CTC, Piracicaba,SP).
3.4 Pr-tratamento do bagao de cana
O pr-tratamento das amostras de bagao de cana de acar foi realizado em

escala de bancada nas seguintes condies:
1) Em frascos Erlenmeyer a temperatura ambiente 24 3 C, empregando soluo

de hidrxido de amnio (NH4OH) 28% (m/m) na proporo 1:5 (massa de
amostra seca por massa de soluo) e;
33
2) Em reator de ao inoxidvel (tambm denominado autoclave, volume til

aproximado de 200 mL) nas temperaturas de 50C e 100C (Figura 15),
utilizando solues de hidrxido de amnio a diferentes concentraes na
proporo 1:5 (massa de amostra seca por massa de soluo).
Figura 15. Fotografia ilustrando reator de ao inoxidvel (autoclave) utilizado nos

experimentos de pr-tratamento do bagao de cana de acar.
A Tabela 4 apresenta um resumo das condies experimentais utilizadas neste

trabalho.
Tabela 4. Condies de pr-tratamentos estudados neste trabalho.

Amostra de
Temperatura da
Concentrao de
Tempo de reao
bagao
reao (oC)
NH4OH (%)
In natura
24 3
28
7 / 15 / 30 dias
In natura
100
4 / 10 / 15
1 hora
Explodido
24 3
28
7 / 15 / 30 dias
Explodido
50
15
30 / 60 / 90 minutos
Explodido
100
5 / 10 / 15
1 hora
34
3.4.1 Pr-tratamento com amnia aquosa a temperatura ambiente
Amostras de bagao in natura e explodido no lavado foram pr-tratadas na

proporo de 1 g bagao: 5 g amnia aquosa (m/m) com concentrao de 28% de
soluo de NH4OH a temperatura ambiente 24 3 C por 7, 15 e 30 dias. Pesou-se
10,0g de bagao massa seca (in natura/explodido no lavado) e colocou-se em um
Erlenmeyer de 300 mL. Adicionou-se 185 mL de NH4OH 28% em cada Erlenmeyer e
fechou-se o recipiente com uma rolha. Aps o trmino da reao, os bagaos foram
lavados e filtrados com gua destilada a temperatura ambiente. Em seguida, foram
colocados na capela por uma noite. No dia seguinte foram caracterizados quimicamente
para determinar composio de celulose, hemicelulose e lignina.
O bagao explodido no lavado foi tratado na proporo 1:5 (m/m) com

concentrao de amnia aquosa 15% a 50C em um reator de ao em banho-maria por
30, 60 e 90 minutos. Pesou-se 4,0g de bagao explodido (base seca) e adicionou-se na
autoclave juntamente com 22,2 mL de soluo de NH4OH 15%. Aps o trmino da
reao, a autoclave foi retirada do banho e deixou-se resfriar. Abriu-se a autoclave,
retirou-se a amostra e, em seguida procedeu-se a lavagem com 500 mL de gua
destilada a temperatura ambiente. A amostra foi deixada na capela por uma noite. Em
seguida realizou-se a caracterizao qumica da amostra para determinar composio de
celulose, hemicelulose e lignina.
3.4.3 Pr-tratamento do bagao in natura com amnia aquosa a 100C
O bagao de cana foi tratado na proporo 1:5 (m/m) nas concentraes 4, 10 e

15% de amnia aquosa por 1 h a 100C. Pesou-se 15,0g de bagao in natura (base seca)
e colocou-se no reator e adicionou-se 74,3 mL de soluo de NH4OH. Em seguida, o
reator foi colocado em um banho de areia a 100C por 1 hora. Aps o trmino da
35
reao, esperou-se esfriar o reator. A amostra foi filtrada e lavada com 500 mL de gua
a temperatura ambiente e 1.500 mL de gua destilada fervente. Deixou-se a amostra na
capela durante uma noite. No dia seguinte a amostra foi caracterizada para determinar o
teor de celulose, hemicelulose e lignina. Os experimentos realizados com concentraes
de 4 e 15% de soluo de NH4OH foram realizados em duplicata e o experimento com
10% de soluo de NH4OH foi realizado em triplicata.
O bagao de cana foi tratado na proporo 1:5 (m/m) nas concentraes 5, 10 e

15% de amnia aquosa por 1h a 100C. Pesou-se 18,0g de bagao explodido (base seca)
e colocou-se no reator e adicionou-se 100 mL de soluo de NH4OH. Em seguida, o
reator foi colocado em um banho de areia a 100C por 1 hora. Aps o trmino da
reao, esperou-se esfriar o reator. A amostra foi filtrada e lavada com 2.000 mL de
gua destilada fervente. O material foi deixado na capela durante a noite e no dia
seguinte caracterizado para determinar o teor de celulose, hemicelulose e lignina. Os
experimentos realizados com concentraes de 5 e 10% de soluo de NH4OH foram
pr-tratados em duplicata e o experimento com 15% de soluo de NH4OH foi prtratado em triplicata.
36
3.5 Caracterizao qumica dos bagaos de cana de acar
As amostras dos bagaos in natura e explodido no lavado foram caracterizadas

de acordo com procedimento descrito por Gouveia et al., 2009. O material foi
cominudo em moinho de facas para obter-se uma granulometria de 20 mesh. Para as
amostras de bagao in natura e explodido no lavado (sem tratamento com amnia
aquosa) determinou-se a quantidade de extrativos.
Extrativos: adicionou-se 4,0g (massa seca) de bagao (in natura e explodido

no lavado) em um cartucho e colocou-se em um sistema de extrao (Soxhlet Diogolab). Adicionou-se em um balo de fundo redondo 190 mL de etanol 95%.
Ajustou-se a manta para fornecer um ciclo mnimo de 6 sifes por hora. Refluxou-se
por 12 horas. O lquido contendo os extrativos foi colocado em rotaevaporizador at se
obter um lquido viscoso. Retirou-se este lquido utilizando um pouco de etanol.
Colocou-se em uma plaquinha de Petri, previamente, tarada e deixou-se na capela ligada
at se obter massa constante. Calculou-se a massa de extrativo do bagao in natura e do
bagao explodido no lavado.
Caracterizaram-se todas as amostras pr-tratadas e no tratadas realizando-se
uma hidrlise cida.
3.5.1 Hidrlise cida
Em um tubo de ensaio adicionou-se 10 mL de soluo de cido sulfrico 72% e

colocou-se em banho-maria a 45C (tampou-se o tubo de ensaio com papel alumnio).
Em um bquer de 100 mL adicionou-se 1,0 g de bagao com 10% de umidade e
colocou-se o bquer em banho-maria a 45C. Adicionou-se o cido sulfrico no bquer
e mexeu-se com um basto de vidro por 10 minutos. A reao foi finalizada
adicionando-se 50 mL de gua destilada ao bquer. O contedo foi transferido
quantitativamente para um Erlenmeyer de 500 mL e adicionou-se 225 mL de gua
destilada. O Erlenmeyer foi fechado com papel alumnio e autoclavado por 30 minutos a
1 bar a 120C. Filtrou-se o contedo do Erlenmeyer em papel de filtro qualitativo
(previamente, pesado e seco em estufa a 100C) diretamente em um balo volumtrico
37
de 500 ml. O filtrado foi analisado por CLAE (cromatografia lquida de alta eficincia).
A frao slida retida no papel de filtro foi lavada com 1.500 mL de gua destilada,
tomando-se o cuidado de lavar bem as bordas do papel. Em seguida, foi deixada na
capela por uma noite.
3.5.2 Determinao da lignina solvel
Em um balo volumtrico de 100 ml transferiu-se 5,0 mL do hidrolisado e

adicionou-se 40 gotas de hidrxido de sdio 6,5 mol/L, completando o volume com
gua destilada. Tomou-se uma alquota desta soluo e mediu-se a absorbncia a 280
nm empregando cubeta de quartzo (espectrofotmetro Pharmacia Biotech- Ultrospec
2000). Como branco foi empregado gua destilada. A lignina solvel foi determinada
pela Equao 1 (Rocha et al., 1997).
Clig 4,187 10 2 A T A pd 3,279 10 4
(Equao 1)
onde:
Clig, concentrao de lignina solvel em (g/L);
AT, absorvncia da soluo de lignina com os produtos de degradao;
Apd = c1.1 + c2.2
c1 e c2, so as concentraes de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) respectivamente,
determinadas por CLAE.
1 = 146,85 L . g-1. cm-1 (furfural)
2 = 114,00 L . g-1. cm-1 (HMF)
3.5.3 Determinao da lignina insolvel
A lignina insolvel foi determinada de acordo com o mtodo Klason,

modificado por Rocha et al., 1997. O papel de filtro contendo a frao slida (aps ter
ficado uma noite na capela) foi transferido para um pesa-filtro (previamente, pesado) e
38
colocado em estufa a 100C at obter massa constante. A porcentagem de lignina na

amostra foi calculada pela Equao 2.
M Mc
% L k
MA
100
(Equao 2)
onde:
L, lignina Klason insolvel;
MK, massa de lignina insolvel;
Mc, massa de cinzas da lignina;
MA, massa da amostra seca.
3.5.4 Determinao de cinzas da lignina e do bagao
Aps se ter obtido massa constante do papel de filtro este foi transferido para um
cadinho de porcelana, previamente pesado e colocado em uma mufla a 150C por 30
minutos. Em seguida aumentou-se a temperatura para 250C, e deixou-se por 20
minutos. Por fim, incinerou-se o papel de filtro a 800C por 2 horas. Para determinar as
cinzas do bagao pesou-se 1,0g de bagao (base seca) e colocou-se em um cadinho,
previamente tarado e procedeu-se da mesma forma utilizada para o papel de filtro
(modificado de Rocha et al., 1997). Calculou-se a quantidade de cinzas contida na
lignina e do bagao de acordo com a Equao 3.
M
% cinzas c 100
Ma
(Equao 3)
onde:
% cinzas, porcentagem de cinzas;
Mc, massa de cinzas (massa do cadinho com cinzas massa do cadinho vazio);
MA, massa da amostra seca.
39
3.5.5 Determinao de carboidratos e cidos orgnicos
As concentraes de acares e cidos orgnicos foram determinadas por CLAE.

Foram construdas curvas de calibrao dos cidos orgnicos (a partir de solues
padro de cido actico, cido frmico e cido glucurnico), e dos carboidratos (a partir
de solues padro de glicose, xilose, celobiose e arabinose). As amostras dos
hidrolisados foram filtradas em membrana de 0,45 m e analisadas por CLAE (Gouveia
et al., 2009). Condies experimentais: coluna HPX-87H Aminex ( Bio-Rad, Organic
Acid Analysis column, 300 x 7,8 mm) fase mvel soluo de H2SO4 (cido sulfrico)
0,005 mol.L-1 , vazo de 0,6 mL/min, temperatura do forno (CTO-10A) 45C e detector
de ndice de refrao RID-10A, em cromatgrafo Shimadzu.
3.5.6 Determinao de hidroximetilfurfural e de furfural
Para determinar as concentraes de hidroximetilfurfural (HMF) e furfural

foram realizadas anlises cromatogrficas (CLAE). Construram-se curvas de calibrao
de furfural e hidroximetilfurfural injetando solues padres destes dois compostos. As
amostras dos hidrolisados foram filtradas em membrana de 0,45 m e analisadas
(Gouveia et al., 2009). Condies experimentais: coluna C-18 (Waters, 3,9 x 300 mm),
fase mvel soluo de acetonitrila/gua 1:8 com 1% de soluo de cido actico, vazo
de 0,8 mL/min, temperatura do forno 25C e detector UV/VIS (SPD-10A) a 274 nm, em
cromatgrafo Shimadzu.
40
3.6 Hidrlise enzimtica
A Tabela 5 apresenta as condies experimentais utilizadas nos experimentos de

hidrlise enzimtica (sacarificao) das amostras de bagao in natura e explodido.
Tabela 5. Condies experimentais empregadas nos experimentos de hidrlise

enzimtica (sacarificao).
Amostra de
Condio do pr-
Accellerase 1500
-glucosidase
bagao
tratamento
(FPU / g de celulose)
(CBU / g de celulose)
In natura
Uma hora a 100 C com
30
30
30
30
30
30
solues de NH4OH
(4, 10 e 15% m/m)
In natura

solues de NH4OH
(10% m/m)
Explodido
30, 60 e 90 min. a 50 C
com soluo de NH4OH
(15% m/m)
Explodido

solues de NH4OH
(5, 10 e 15% m/m)
Explodido

solues de NH4OH
(15% m/m)
3.6.1 Determinao da concentrao de glicose
A concentrao de etanol foi determinada por CLAE (coluna HPX-87H, BioRad), fase mvel cido sulfrico 0,005 mol.L-1, vazo de 0,6 mL/min, temperatura do
forno a 45C e detector de ndice de refrao RID-10A, em cromatgrafo Shimadzu).
Aps a hidrlise enzimtica filtraram-se os materiais hidrolisados e os filtrados foram
armazenados para serem utilizados nos experimentos de fermentaes alcolicas.
41
As amostras provenientes deste pr-tratamento (condies descritas na Tabela 5)

foram submetidas hidrlise enzimtica utilizando 1% de carga de slidos (1g bagao:
100 mL de soluo), utilizando amostras de bagao explodido no lavado a 20 mesh e
amostras pr-tratadas sem ajuste de granulometria.
A soluo para a hidrlise continha 60 mL de tampo citrato pH 4,8 (50mM),
40 mL de gua destilada, 30 FPU de celulase/g de bagao e 30 CBU de -glucosidade/g
de bagao.
Os experimentos foram realizados em frascos de Erlenmeyer em shaker a 50C
com agitao de 150 rpm por 72 horas. As amostras foram analisadas por CLAE.

foram submetidas hidrlise enzimtica utilizando carga de slidos de 3%, utilizando
amostras de bagao in natura no tratado e amostras pr-tratadas (ambas sem ajuste de
granulometria).
30 mL de gua destilada, 30 FPU de celulase/ g de celulose e 5 CBU de -glucosidade/g
de celulose.

foram submetidas hidrlise enzimtica utilizando carga de slidos de 7%, utilizando
bagao explodido no lavado e pr-tratados sem ajuste de granulometria.
30 FPU de celulase/g de celulose e 5 CBU de -glucosidade/g de celulose.
42

As amostras provenientes desse pr-tratamento (condies descritas na Tabela 5)

foram submetidas hidrlise enzimtica utilizando carga de slidos de 5% para o
bagao in natura e 10% para o bagao explodido. No se modificou a granulometria
original das amostras de bagao.
30 FPU de celulase/g de celulose.
43
3.7 Fermentao alcolica
3.7.1 Determinao da concentrao de etanol
A concentrao de etanol foi quantificada por CLAE (coluna HPX-87H, BioRad), fase mvel cido sulfrico 0,005 mol.L-1, vazo de 0,6 mL/min, temperatura do
forno a 45C e detector de ndice de refrao RID-10A, em cromatgrafo Shimadzu).
3.7.2 Preparo do inculo e do meio de fermentao alcolica
O meio de fermentao foi preparado empregando os hidrolisados. O inculo foi

preparado em frascos de Erlenmeyers de 300 mL, nas seguintes condies: em shaker a
30C com agitao de 200 rpm por 16 horas.
Os experimentos de fermentao foram realizados em shaker nas seguintes
condies:
Bagao de cana explodido no lavado tratado por 30, 60 e 90 min a 50C
fermentao alcolica realizada em shaker a 30oC com agitao de 200 rpm por
4 horas;
Bagao de cana in natura tratado com 4, 10 e 15% de soluo de hidrxido de
amnio a 100C fermentao alcolica realizada em shaker a 30oC com
agitao de 250 rpm por 4 horas;
Bagao de cana explodido no lavado tratado com 5, 10 e 15% de soluo de
hidrxido de amnio a 100C fermentao alcolica realizada em shaker a 30oC
com agitao de 250 rpm por 4 horas;
Durante os experimentos amostras foram retiradas em intervalos de tempo para a

quantificao da concentrao de etanol (CLAE).
44
A Tabela 6 mostra a composio dos meios de inoculao.
Tabela 6. Composio dos meios de inoculao.

Reagentes
Explodido no
In natura
Explodido no
lavado tratado a
tratado a
lavado tratado a
50C
100C
100C
Glicose
20,0 g/L
20,0 g/L
20,0 g/L
Extrato de levedura
5,0 g/L
5,0 g/L
5,0 g/L
Peptona
3,0 g/L
3,0 g/L
Sulfato de magnsio
2,5 g/L
2,5 g/L
2,5 g/L
1,0 g/L
1,0 g/L
1,0 g/L
5,0 g/L
5,0 g/L
5,0 g/L
1,0 g/L
5,0 g/L
10,0 g/L
0,5 g/L
3,0 g/L
MgSO4. 7H2O
Fosfato de dipotssio
K2HPO4
Sulfato de amnio
(NH4)2SO4
Levedura
Cloreto de clcio
CaCl2
Uria
Modificado de Santos e Gouveia (2009).
A Tabela 7 apresenta a composio dos meios de cultivo empregado nas

fermentaes.
45
Tabela 7. Composio dos meios de fermentao.

Reagentes
Explodido no
In natura
Explodido no
lavado tratado a
tratado a
lavado tratado a
50C
100C
100C
Extrato de levedura
2,0 g/L
2,0 g/L
2,0 g/L
Peptona
1,0 g/L
1,0 g/L
0,25 g/L
0,25 g/L
0,25 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
0,5 g/L
1,0 g/L
1,0 g/L
1,0 g/L
1,0 g/L
4 ppm
4 ppm
4 ppm
Sulfato de magnsio
MgSO4. 7H2O
K2HPO4
Sulfato de amnio
(NH4)2SO4
Uria
Antibitico
(Kamoran)
Modificado de Santos e Gouveia 2009.
46
As fermentaes foram realizadas seguindo os planejamentos ilustrados nas

Figuras 16 e 17.
Bagao in natura tratado com 10% de amnia aquosa (Figura 16).

provenientes do bagao in natura.
Bagao explodido no lavado tratado com 15% de amnia aquosa (Figura17).

provenientes do bagao explodido.
47
Os inculos denominados de rico e pobre foram preparados em frascos de

Erlenmeyers de 300 mL com composio descrita na Tabela 8.
Tabela 8. Composio dos meios de inoculao (inculos denominados de rico e

pobre).
Inculo rico
Inculo pobre
Glicose
20,0 g/L
20,0 g/L
Extrato de levedura
5,0 g/L
Peptona
3,0 g/L
Sulfato de magnsio
2,5 g/L
2,5 g/L
1,0 g/L
5,0 g/L
3,0 g/L
10,0 g/L
10,0 g/L
Reagentes
MgSO4. 7H2O
K2HPO4
Sulfato de amnio
(NH4)2SO4
Uria
Levedura
Os inculos foram preparados em frascos de Erlenmeyer em shaker a 30C por

16 horas com agitao de 250 rpm. Terminado o tempo de reao, o meio foi filtrado a
vcuo e a frao slida foi empregada nas fermentaes alcolicas.
Os meios de fermentaes foram preparados nos prprios hidrolisados, sendo
um meio denominado de rico e outro meio denominado de pobre como mostra a
Tabela 9.
Os experimentos de fermentao alcolica foram realizados em shaker a 30C
por 5h com agitao de 250 rpm. Alquotas foram retiradas em intervalos regulares de
tempo para quantificao da concentrao de etanol. Estas amostras foram analisadas
por CLAE.
48
Tabela 9. Composio dos meios de fermentaes rico e pobre.

Meio rico
Meio pobre
Extrato de levedura
2,0 g/L
Peptona
1,0 g/L
Sulfato de magnsio
0,25 g/L
0,25 g/L
0,5 g/L
1,0 g/L
1,0 g/L
4 ppm
4 ppm
Reagentes
MgSO4. 7H2O
K2HPO4
Sulfato de amnio
(NH4)2SO4
Uria
Antibitico
(Kamoran)
3.8 Anlises por microscopia eletrnica de varredura (MEV)

Amostras dos bagaos no tratados e pr-tratados com granulometria menor que
100 mesh foram secas em estufa a 60C. Fixaram-se as amostras em suporte de
alumnio com cola. As mesmas foram submetidas ao recobrimento com tinta de prata e
em seguida a um recobrimento de 10 nm de ouro e mantidas em um dessecador at o
momento da anlise.
49
4. RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Caracterizao dos bagaos in natura e explodido
Os bagaos de cana de acar in natura e explodido no lavado foram

caracterizados utilizando a metodologia descrita por Gouveia et al., 2009. A Tabela 10
apresenta a composio percentual dos constituintes do bagao in natura e explodido
no lavado.
Tabela 10. Composio qumica das amostras de bagao in natura e explodido no

lavado.
Componentes (%)
In natura
Explodido
no lavado
Celobiose
0,7
1,8
Glicose
45,8
54,0
Xilose
22,2
16,7
Arabinose
3,3
2,2
HMF
0,4
0,2
Furfural
0,8
0,3
Lignina Klason
18,2
17,0
Lignina solvel
6,8
13,3
Cinzas
2,1
1,7
Extrativos
5,5
3,4
cido actico
cido frmico
0,9
106,7
110,6
cido glucurnico
Total
Para determinar os teores de celulose, hemicelulose e lignina total das amostras

de bagao de cana in natura e explodido utilizaram-se os fatores de converso
apresentados nas Tabelas 11 e 12.
50
Tabela 11. Fatores de converso para a celulose.

0,90 x massa de glicose
0,95 x massa de celobiose
1,20 x massa de HMF
3,09 x massa de cido frmico
Tabela 12. Fatores de converso para a hemicelulose.

0,88 x massa de xilose
0,95 x massa de arabinose
0,72 x massa de cido actico
1,37 x massa de cido glucurnico
As Tabelas 13 e 14 apresentam os valores convertidos em termos de celulose,

hemicelulose e lignina total dos bagaos de cana de acar in natura e explodido no
lavado.
Tabela 13. Composio qumica do bagao de cana in natura.

In natura
Porcentagem %
Celulose
42,4 0,3
Hemicelulose
24,4 0,4
Lignina total
24,9 0,2
Cinzas
2,1 0,4
Extrativos
5,5 0,1
Total
99,3
* As anlises da caracterizao qumica foram realizadas em triplicatas.
51
Tabela 14. Composio qumica do bagao de cana explodido no lavado.

Explodido no lavado
Porcentagem %
Celulose
50,6 0,2
Hemicelulose
16,9 0,1
Lignina total
30,4 0,1
Cinzas
1,7 0,1
Extrativos
3,4 0,7
103,0
Total
As anlises da caracterizao qumica foram realizadas em triplicatas
Na Tabela 15 apresentam-se os valores da composio de amostras de bagao

(in natura e explodido) descrito na literatura.
Tabela 15. Composio do bagao in natura e explodido (Gouveia et al., 2009).

Componentes (%)
In natura
Explodido
Celulose
42,8
47,7
Hemicelulose
25,8
8,9
Lignina total
22,4
34,3
Cinzas
1,4
n.a.
Extrativos
6,1
Observaes: O bagao explodido utilizado por Gouveia et al., foi lavado exaustivamente; n.a. significa
valor no apresentado.
A partir dos dados apresentados nas Tabelas 14 e 15, observa-se que o teor de
hemicelulose menor no bagao explodido no lavado quando comparado com o
bagao in natura. Este fato resultado do pr-tratamento a que foi submetido o bagao
de cana (exploso a vapor), que remove boa parte da hemicelulose. O maior teor de
hemicelulose na amostra de bagao explodido analisada neste trabalho (Tabela 14)
provavelmente devido ao fato de a amostra no ter sido lavada.
52
A Figura 18 ilustra fotografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura

das amostras de bagao in natura e explodido no lavado.
Figura 18. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) dos bagaos: (A) in natura, e;
(B) explodido no lavado.
A partir das fotografias ilustradas na Figura 18 possvel observar que enquanto

as fibras do bagao in-natura encontram-se inteiras (Figura 18.A), as do bagao
explodido no lavado esto rompidas (Figura 18.B), conseqncia do pr-tratamento a
que a matria-prima foi submetida. A exploso a vapor provoca um rompimento das
fibras, o que provoca um aumento considervel da rea superficial (Ohgren et al., 2007).
53
4.1.1 Caracterizao dos bagaos pr-tratados a temperatura ambiente 243 C

Bagao in natura
A Tabela 16 apresenta os valores dos principais constituintes das amostras de

bagao in natura pr-tratadas por 7 dias, 15 dias e 30 dias, respectivamente, com
soluo de hidrxido de amnio 28% (m/m).
Tabela 16. Composio qumica das amostras de bagao in natura tratadas por 7, 15 e
30 dias a temperatura ambiente 243 C.
Componentes
In natura
In natura
In natura
(%)
tratado por
tratado por
tratado por
7 dias
15 dias
30 dias
Celulose
48,0 0,3
49,5 0,4
53,0 0,1
Hemicelulose
23,7 0,8
22,9 0,5
21,7 0,5
Lignina total
21,1 0,2
19,7 0,1
17,7 0,1
Cinzas
4,6 0,1
4,5 0,6
4,1 0,6
97,4
96,6
96,5
Total
* As anlises da caracterizao qumica foram realizadas em triplicatas
A partir dos dados apresentados na Tabela 16 observa-se um aumento na

composio percentual de celulose e reduo nas composies percentuais de lignina e
hemicelulose nas amostras aps o pr-tratamento medida que o tempo de reao
aumenta.
Aps a etapa de pr-tratamento as amostras foram submetidas anlise por
microscopia eletrnica de varredura (Figura 19).
54
Figura 19. Microscopia eletrnica de varredura do bagao in natura (A) no tratado com
amnia aquosa, (B) in natura tratado por 7 dias, (C) in natura tratado por 15 dias e (D)
in natura tratado por 30 dias.
A microscopia eletrnica de varredura do bagao in natura tratado com soluo

de 28% de NH4OH apresenta uma maior deformidade das fibras com o aumento no
tempo de reao, sendo a maior deformao do bagao tratado por 30 dias.
Para ilustrar a eficincia do pr-tratamento correlacionaram-se as razes das
principais
fraes
do
bagao
(celulose/hemicelulose,
celulose/lignina
hemicelulose/lignina) em funo do tempo de reao. A Tabela 17 apresenta estes

valores.
55
Tabela 17. Razes das principais fraes do bagao em funo do tempo de reao para
os experimentos realizados com amostras de bagao in natura tratadas com soluo de
hidrxido de amnio (28% m/m) a 243C.
Tempo
In natura
In natura
In natura
In natura
tratado por 7
tratado por 15
tratado por 30
dias
dias
dias
1,739
2,022
2,158
2,445
1,701
2,271
2,515
3,003
0,978
1,123
1,165
1,228
Razo
Celulose/
Hemicelulose
Celulose/
Lignina
Hemicelulose/
Lignina
A partir dos dados apresentados na Tabela 17 construram-se grficos das razes

celulose/hemicelulose, celulose/lignina e hemicelulose/lignina em funo do tempo
(Figuras de 20 a 22).
2,5
Celulose / Hemicelulose
2,4
2,3
2,2
2,1
2,0
5
10
15
Equation
Adj. R-Square
y = a + b*x
0,99842
Celulose / Hemi
celulose
Intercept
Celulose / Hemi
celulose
Slope
20
Value
1,88803
Standard Error
0,01027
0,01848
5,1905E-4
25
30
Tempo (dias)
Figura 20. Razo celulose/hemicelulose em funo do tempo de pr-tratamento

(amostra de bagao in natura tratado temperatura ambiente).
56
3,1
3,0
Celulose / Lignina
2,9
2,8
2,7
2,6
2,5
Equation
y = a + b*x
Adj. R-Square
2,4
0,99951
Value
2,3
Standard Error
Celulose / Lignina
Intercept
2,04277
0,0099
Celulose / Lignina
Slope
0,03193
5,00485E-4
2,2
5
10
15
20
25
30
Tempo (dias)
Figura 21. Razo celulose/lignina em funo do tempo de pr-tratamento (amostra de

bagao in natura tratado temperatura ambiente).
1,24
Hemicelulose / Lignina
1,22
1,20
1,18
1,16
Equation
y = a + b*x
Adj. R-Square
1,14
0,99266
Value
1,12
5
10
Standard Error
Hemicelulose / L Intercept
ignina
1,09369
0,00544
Hemicelulose / L Slope
ignina
0,00453
2,74767E-4
15
20
25
30
Tempo (dias)
Figura 22. Razo hemicelulose/lignina em funo do tempo de pr-tratamento (amostra

de bagao in natura tratado temperatura ambiente).
Nas Figuras 20 a 22 observa-se que o valor das razes calculadas

(celulose/hemicelulose, celulose/lignina e hemicelulose/lignina) aumentou com o tempo
de reao, obtendo-se, em todos os casos, um bom ajuste linear (R2 > 0,99). Embora no
57
se tenha quantificado o rendimento da etapa de pr-tratamento (razo entre a massa

inicial da amostra e a massa final da amostra pr-tratada) verificou-se que este foi
seletivo na remoo da lignina e da hemicelulose.
Bagao explodido
A Tabela 18 apresenta a composio dos constituintes das amostras de bagao

explodido tratados por 7 dias, 15 dias e 30 dias, respectivamente, com soluo de
hidrxido de amnio 28% (m/m) a temperatura ambiente, 243 C.
Tabela 18. Composio qumica do bagao explodido no lavado tratado por 7, 15 e 30

dias a temperatura ambiente, 243 C.
Componentes
Explodido
Explodido
Explodido
(%)
tratado por
tratado por
tratado por
7 dias
15 dias
30 dias
Celulose
67,1 0,1
72,4 0,1
74,2 0,1
Hemicelulose
7,5 0,1
6,6 0,1
5,6 0,1
Lignina total
18,8 0,2
17,6 0,1
15,9 0,1
Cinzas
3,7 0,3
2,6 0,2
2,3 0,2
97,1
99,2
98,0
Total
As anlises da caracterizao qumica foram realizadas em triplicatas.
Nestes experimentos observou-se um decrscimo mais significativo na

composio percentual de hemicelulose quando comparado com o tratamento
empregando amostra de bagao in natura. Este resultado atribudo ao fato da amostra
de bagao no ter sido previamente lavada antes de ser submetida ao pr-tratamento
empregando amnia aquosa. Houve neste caso, a combinao de dois efeitos na
remoo da hemicelulose. O primeiro devido reao de despolimerizao durante a
etapa de exploso a vapor e o segundo devido ao pr-tratamento alcalino aquoso.
Caracterizou-se morfologicamente o bagao explodido pr-tratado a temperatura
ambiente 24 3 C, atravs de microscopia eletrnica de varredura (Figura 23).
58
Figura 23. Microscopia eletrnica de varredura do bagao explodido no lavado: (A)

no tratado, (B) explodido tratado por 7 dias, (C) explodido tratado por 15 dias e (D)
explodido tratado por 30 dias.
A microscopia eletrnica de varredura das amostras de bagao tratadas ao longo

de 7, 15 e 30 dias mostrou que a partir de 15 dias de tratamento o bagao explodido
apresenta uma maior desestruturao das fibras.
Correlacionaram-se as razes entre as principais fraes do bagao de cana de
acar explodido (celulose, hemicelulose e lignina) em funo do tempo de prtratamento (Tabela 19).
59
Tabela 19. Razes das principais fraes do bagao em funo do tempo de reao para
os experimentos realizados com amostras de bagao explodido no lavado tratadas com
soluo de hidrxido de amnio (28% m/m) a 243 C.
Tempo
Explodido
Explodido
Explodido
Explodido
no lavado
tratado por 7
tratado por 15
tratado por 30
dias
dias
dias
2,988
8,969
10,926
13,336
1,667
3,574
4,116
4,661
0,558
0,399
0,377
0,349
Razo
Celulose/
Hemicelulose
Celulose/
Lignina
Hemicelulose/
Lignina
A partir dos dados apresentados na Tabela 19 construram grficos das razes

14
13
12
11
Equation
10
y = a + b*x
Adj. R-Square
0,97409
Value
9
5
10
15
Standard Error
Celulose / Hemi
celulose
Intercept
7,85104
0,42183
Celulose / Hemi
celulose
Slope
0,18613
0,02132
20
25
30
Tempo (dias)

(amostra de bagao explodido no lavado tratado temperatura ambiente).
60
4,8
Celulose / Lignina
4,6
4,4
4,2
4,0
Equation
3,8
y = a + b*x
Adj. R-Square
0,94121
Value
3,6
Standard Error
Celulose / Lignina Intercept
3,32259
0,15776
Celulose / Lignina Slope
0,04583
0,00797
3,4
5
10
15
20
25
30
Tempo (dias)

bagao explodido no lavado tratado temperatura ambiente).
Equation
0,40
y = a + b*x
Adj. R-Square
0,97588
Value
0,39
Hemicelulose /
Lignina
Intercept
Hemicelulose /
Lignina
Slope
Standard Error
0,41115
0,00457
-0,00209
2,31107E-4
0,38
0,37
0,36
0,35
5
10
15
20
25
30
Tempo (dias)

de bagao explodido no lavado tratado temperatura ambiente).
61
Nas Figuras 24 e 25 observa-se que o valor das razes calculadas aumentou com
o tempo de reao, obtendo-se, em todos os casos, um satisfatrio ajuste linear (R2 >
0,97 para a razo celulose/hemicelulose e 0,94 para a razo celulose/lignina). Para a
razo hemicelulose/lignina (Figura 26) a variao do valor ao longo do tempo foi
pequena (de 0,399 a 0,349) indicando que a proporo entre estas duas fraes mantevese quase que inalterada.
62
4.1.2 Caracterizao do bagao explodido pr-tratado a 50C
A Tabela 20 apresenta a composio das amostras de bagao explodido no

lavado pr-tratadas por 30, 60 e 90 minutos com soluo de NH4OH 15% (m/m),
respectivamente.
Tabela 20. Composio qumica do bagao explodido tratado por 30, 60 e 90 minutos.
Componentes
Explodido
Explodido
Explodido
(%)
tratado por
tratado por
tratado por
30 min
60 min
90 min
Celulose
74,3 0,2
75,3 0,2
76,3 0,2
Hemicelulose
7,0 0,2
6,8 0,1
6,7 0,1
Lignina total
17,9 0,2
16,5 0,2
15,5 0,1
Cinzas
1,0 0,1
1,0 0,1
1,2 0,2
100,2
99,6
99,7
Total
As amostras de bagao tratadas com soluo de hidrxido de amnio (15% m/m)

a 50C apresentaram composio percentual acima de 70% em todos os tempos de
reao.
Estas amostras pr-tratadas foram caracterizadas morfologicamente, atravs de
microscopia eletrnica de varredura, como ilustra a Figura 27.
63
Figura 27. Microscopia eletrnica de varredura do bagao explodido no lavado

(A) no tratado, (B) tratado com soluo de NH4OH por 30 min, (C) tratado com
soluo de NH4OH por 60 min e (D) tratado com soluo de NH4OH por 90 min.
O pr-tratamento foi realizado de forma branda (temperatura de 50C com

soluo de 15% de NH4OH), com um satisfatrio resultado. A microscopia eletrnica
mostra uma maior desestruturao das fibras aps o pr-tratamento do bagao com
amnia aquosa.
Correlacionaram-se as razes entre as principais fraes do bagao de cana de
acar explodido (celulose, hemicelulose e lignina) em funo do tempo de prtratamento (Tabela 21).
64
Tabela 21. Resumo das correlaes de todos os experimentos utilizando bagao

explodido tratado com 15% de soluo de amnia aquosa a 50C.
Tempo
Explodido
Explodido
Explodido
Explodido
no lavado
tratado por
tratado por
tratado por
30 min
60 min
90 min
3,035
10,611
11,103
11,399
1,694
4,140
4,551
4,930
0,558
0,390
0,410
0,432
Razo
Celulose/
Hemicelulose
Celulose/
Lignina
Hemicelulose/
Lignina
A partir dos dados apresentados na Tabela 21 construram grficos das razes

11,4
11,2
11,0
10,8
Equation
y = a + b*x
Adj. R-Square
0,95957
Value
Celulose / Hemic Intercept

elulose
10,6
Celulose / Hemic Slope

elulose
30
40
50
60
70
Standard Error
10,25025
0,1222
0,01313
0,00189
80
90
Tempo (min)

(amostra de bagao explodido no lavado tratado temperatura de 50C).
65
5,0
Celulose / Lignina
4,8
4,6
4,4
Equation
y = a + b*x
Adj. R-Square
4,2
0,99885
Value
Standard Error
Celulose / Lignina
Intercept
3,75139
0,02044
Celulose / Lignina
Slope
0,01315
3,15347E-4
4,0
30
40
50
60
70
80
90
Tempo (min)

bagao explodido no lavado tratado temperatura de 50C).
0,44
0,43
0,42
0,41
Equation
0,40
Adj. R-Square
y = a + b*x
0,99706
Value
Hemicelulose / Intercept
Lignina
Hemicelulose / Slope
Lignina
0,39
30
40
50
60
70
Standard Error
0,36859
0,00175
7,0434E-4
2,70268E-5
80
90
Tempo (min)

de bagao explodido no lavado tratado temperatura de 50C).
66
Nas Figuras 28 a 30 observa-se que o valor das razes calculadas

(celulose/hemicelulose, celulose/lignina e hemicelulose/lignina) aumentou com o tempo
de reao, obtendo-se, em todos os casos, um ajuste linear satisfatrio (R2 > 0,96).
Nesta condio verificou-se que o pr-tratamento foi seletivo na remoo da lignina e
da hemicelulose.
67
4.1.3 Caracterizao do bagao in natura pr-tratado a 100C
As Tabelas 22 e 23 apresentam as composies das amostras do bagao in

natura pr-tratadas com soluo de NH4OH 4, 10 e 15% (m/m), respectivamente.
Tabela 22. Composio qumica do bagao in natura tratado com soluo de NH4OH 4,
10 e 15%.
Componentes
In natura
In natura
In natura
(%)
tratado com
tratado com
tratado com
4% NH4OH
10% NH4OH
15% NH4OH
Celulose
46,8 0,2
72,0 0,3
59,5 0,1
Hemicelulose
22,6 0,1
15,0 0,1
16,6 0,2
Lignina total
22,0 0,2
10,5 0,2
17,7 0,2
Cinzas
4,0 0,8
2,4 0,2
3,1 0,1
95,4
99,9
96,9
Total
Nestes experimentos os rendimentos obtidos na etapa de pr-tratamento foram

calculados (Equao 4) obtendo-se os valores de: 84,1 2,6 % para o pr-tratado com
4% de NH4OH, 59,7 2,2 % para o pr-tratado com 10% de NH4OH e 55,7 3,2 %
para o pr-tratado com 15 % de NH4OH. A Tabela 23 apresenta os valores das fraes
das amostras corrigidas em funo do rendimento do pr-tratamento.
massa final amostra pr - tratada

R
100
massa inicial amostra
(Equao 4)
68
Tabela 23. Valores corrigidos da caracterizao qumica das amostras de bagao in

natura tratadas com 4, 10 e 15% de soluo de NH4OH.
Componentes
In natura
(%)
In natura
In natura
In natura
tratado com
tratado com
tratado com
4% NH4OH
10% NH4OH
15% NH4OH
Celulose
42,4 0,3
39,4 0,2
42,9 0,3
33,1 0,1
Hemicelulose
24,4 0,4
19,0 0,1
9,0 0,1
9,3 0,2
Lignina total
24,9 0,2
18,5 0,2
6,3 0,2
9,8 0,2
Cinzas
2,1 0,4
3,4 0,8
1,4 0,2
1,7 0,1
Extrativos
5,5 0,1
99,3
Total
A amostra de bagao pr-tratada com 10% (m/m) de soluo de NH4OH foi a

que manteve o teor de celulose no bagao pr-tratado, removendo lignina e
hemicelulose. O bagao tratado com 15% de soluo de amnia aquosa (pr-tratado em
duplicata) teve a maior perda de celulose. Uma das possveis causas seria a degradao
de acares em condies mais severas de pr-tratamento, como relatado por Kim et al.,
em 2004.
Caracterizou-se morfologicamente o bagao in natura pr-tratado a 100C,
atravs de microscopia eletrnica de varredura, como ilustra a Figura 31.
69
Figura 31. Microscopia eletrnica de varredura das amostras de bagao in natura: (A)
no tratado, (B) tratada com soluo 4% (m/m) de NH4OH, (C) tratada com soluo
10% (m/m) de NH4OH e (D) tratada com soluo 15% (m/m) de NH4OH.
Nas fotografias obtidas (MEV) observa-se que medida que se aumenta a

concentrao da soluo de hidrxido de amnio as fibras das amostras tornam-se mais
abertas. A amostra pr-tratada com 15 % de NH4OH foi a que apresentou uma maior
desestruturao das fibras.
70
4.1.4 Caracterizao do bagao explodido pr-tratados a 100C
As Tabelas 24 e 25 apresentam as caracterizaes das amostras de bagao

explodido pr-tratadas com soluo 5, 10 e 15% (m/m) de NH4OH, respectivamente.
Tabela 24. Composio qumica das amostras de bagao explodido tratadas com
soluo de NH4OH 5, 10 e 15%.
Componentes
Explodido
Explodido
Explodido
(%)
tratado com
tratado com
tratado com
5% NH4OH
10% NH4OH
15% NH4OH
Celulose
66,7 0,2
71,3 0,1
79,2 0,1
Hemicelulose
7,3 0,2
5,4 0,1
3,4 0,1
Lignina total
24,8 0,2
22,1 0,2
15,5 0,2
Cinzas
2,1 0,2
2,1 0,2
2,1 0,3
100,9
100,9
100,2
Total
Os rendimentos dos pr-tratamentos foram: 74,9 2,2 % para o pr-tratado com

5% de NH4OH, 68,8 1,8 % para o pr-tratado com 10% de NH4OH e 62,9 2,4 %
para o pr-tratado com 15% de NH4OH. A Tabela 25 apresenta os valores das fraes
das amostras corrigidas em funo do rendimento do pr-tratamento.
71
Tabela 25. Valores corrigidos da composio das amostras de bagao explodido tratadas
com 5, 10 e 15% de soluo de NH4OH.
Componentes
Explodido
Explodido
Explodido
Explodido
(%)
no lavado
tratado com
tratado com
tratado com
5% NH4OH
10% NH4OH
15% NH4OH
Celulose
50,6 0,2
50,0 0,2
49,0 0,1
49,8 0,1
Hemicelulose
16,9 0,1
5,5 0,2
3,7 0,1
2,1 0,1
Lignina total
30,4 0,1
18,6 0,2
15,2 0,2
9,8 0,2
Cinzas
1,7 0,1
1,6 0,2
1,5 0,2
1,3 0,3
Extrativos
3,4 0,7
103,0
Total
As anlises de caracterizao qumica foram realizadas em triplicatas.
A amostra de bagao explodido tratada com 15% NH4OH foi a que apresentou
melhor remoo de lignina e hemicelulose. O teor de celulose permaneceu praticamente
inalterado nestas amostras. As demais amostras apresentaram satisfatria remoo de
lignina e hemicelulose.
Caracterizaram-se morfologicamente estas amostras de bagao, por meio de
microscopia eletrnica de varredura. As fotografias so ilustradas na Figura 32.
72
Figura 32. Microscopia eletrnica de varredura do bagao explodido no lavado (A) no

tratado com soluo de NH4OH, (B) explodido tratado com 5% NH4OH, (C) explodido
tratado com 10% NH4OH e (D) explodido tratado com 15% NH4OH.
A anlise da microscopia eletrnica do bagao explodido tratado a 100C mostra

uma desorganizao das fibras dos pr-tratados, sendo o de maior teor de celulose o
tratado com 15% de soluo de NH4OH.
A Tabela 26 apresenta as perdas percentuais dos trs principais componentes das
amostras de bagao in natura e explodido (em relao amostra no tratada) aps a
etapa de pr-tratamento alcalino com soluo de NH4OH.
73
Tabela 26. Resultados obtidos nos pr-tratamentos realizados a temperatura de 100C

para os bagaos in natura e explodido.
Amostra de
Condio do pr-
Perda de celulose
Reduo do teor
Reduo no
bagao
tratamento
(%)
de hemicelulose
teor de lignina
(%)
(%)
7,1
22,1
25,7
63,1
74,7
21,9
61,9
60,6
1,2
67,4
38,8
3,2
78,1
50,0
1,6
87,6
67,8
In natura
Sol. NH4OH 4%,

100oC, 1 hora.
In natura
Sol. NH4OH 10%,

100oC, 1 hora
In natura
Sol. NH4OH 15%,

100oC, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 5%,

100oC, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 10%,

100oC, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 15%,

100oC, 1 hora
A partir da anlise dos dados apresentados na Tabela 26 observa-se para as

amostras de bagao in natura a melhor condio de pr-tratamento foi a que empregou
soluo de NH4OH 10%. Neste caso, o teor de celulose manteve-se praticamente
inalterado, com maior remoo de lignina e hemicelulose em relao aos demais. J
para a amostra pr-tratada com soluo a 15%, foi condio menos favorvel
apresentando a maior reduo no teor de celulose. Contudo, a remoo de lignina e
hemicelulose foram satisfatrias. Nestes experimentos a elevao da temperatura
promoveu um aumento na velocidade de reao.
Para o bagao explodido a perda no teor de celulose foi menor que 3%, sendo a
melhor condio obtida com soluo de NH4OH 15%. Nas condies avaliadas, quanto
maior a concentrao da soluo de NH4OH, melhor a remoo de lignina e
hemicelulose.
As melhores condies de pr-tratamento encontradas foram:
para o bagao in natura: soluo de NH4OH 10% (m/m), tempo de reao de 60
minutos a 100 oC;
para o bagao explodido: soluo de NH4OH 15% (m/m), tempo de reao de 60
minutos a 100 oC.
74
4.2 Hidrlise enzimtica e fermentao alcolica
A hidrlise enzimtica foi realizada em shaker a 50C com agitao de 150 rpm,
utilizando 1% de carga de slidos. A fermentao foi realizada em shaker a 30C com
agitao de 200 rpm por 4 horas. O cromatograma do hidrolisado obtido da amostra de
bagao explodido tratado por 30 minutos encontra-se no Apndice A.
A Figura 33 apresenta a concentrao de glicose ao longo do experimento de

hidrlise. O valor da concentrao de glicose atingiu 3,0 g/L em 72 horas.
3,5
Concentrao de glicose (g/L)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Figura 33. Concentrao de glicose durante o experimento de hidrlise do bagao

explodido pr-tratado com soluo de NH4OH (15% m/m) a 50C por 30 minutos.
75
Na Figura 34 visualiza-se a converso em glicose (converso da celulose em

glicose) ao longo do experimento. A converso mxima alcanada foi da ordem de
35,0% em 72 horas.
40
Convrerso em glicose (%)
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Figura 34. Converso em glicose do bagao explodido tratado por 30 minutos.
76
A Figura 35 ilustra o experimento de hidrlise realizado com o bagao

explodido tratado por um perodo de 60 minutos. Neste ensaio a concentrao mxima
de glicose alcanada foi de 3,8 g/L. No Apndice A cromatograma do hidrolisado
obtido do experimento tratado por 60 min.
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)

A converso da hidrlise enzimtica ao longo deste experimento apresentada

na Figura 36. Neste ensaio a converso mxima foi de 46,1% em 72 horas de hidrlise.
50
Converso em glicose (%)
40
30
20
10
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Figura 36. Converso em glicose do bagao explodido tratado por 60 minutos.
77
A Figura 37 mostra a concentrao de glicose ao longo do experimento de

hidrlise do bagao explodido tratado por perodo de 90 minutos. A concentrao
mxima de glicose obtido neste ensaio foi de 3,2 g/L. Cromatograma do hidrolisado
pr-tratado por 90 min no Apndice A.
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)

Na Figura 38 apresenta-se o grfico do rendimento da hidrlise ao longo do

experimento. Neste ensaio a converso mxima obtida foi de 38,1%.
40
30
20
10
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Figura 38. Converso em glicose do bagao explodido tratado 90 minutos.
78
Realizou-se tambm experimento de hidrlise enzimtica utilizando bagao

explodido no lavado a 20 mesh (com a mesma carga de slidos e de enzimas). A
concentrao de glicose ao longo deste ensaio apresentada na Figura 39. O valor
mximo da concentrao de glicose alcanada foi de 3,0 g/L, em 72 horas.
Cromatograma do hidrolisado do bagao no lavado a 20 mesh no Apndice A.
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Figura 39. Concentrao de glicose ao longo de experimento de hidrlise enzimtica do

bagao explodido (cominudo a 20 mesh).
A Figura 40 apresenta o grfico do rendimento da hidrlise enzimtica do

bagao explodido no lavado a 20 mesh. O rendimento mximo foi de 48,6%.
60
50
40
30
20
10
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (h)
Figura 40. Converso em glicose do bagao explodido (cominudo a 20 mesh).
79
Os hidrolisados oriundos da hidrlise enzimtica foram submetidos

fermentao alcolica. A Tabela 27 apresenta os resultados obtidos nestes experimentos
de hidrlise enzimtica e fermentao alcolica.

das amostras de bagao explodido no tratado e pr-tratados com soluo de NH4OH
15% (m/m).
Bagao
Converso em
Cetanol
Eficincia
Yp/s
Explodido
glicose (%)
(g/L)
(%)
30 minutos
35,0
1,0
68,6
0,35
60 minutos
46,1
1,5
75,4
0,39
90 minutos
38,1
1,2
75,2
0,39
No lavado (20 mesh)
48,6
1,3
83,0
0,43
80
Estes experimentos empregaram uma carga de slidos de 3%. A Figura 41

apresenta o grfico da concentrao de glicose ao longo do tempo nos experimentos
realizados. A maior concentrao de glicose foi de 13,4 g/L (bagao tratado com 10%
de NH4OH) alcanando converso mxima de 64,2%. O valor da menor converso foi
para o bagao no tratado com NH4OH cerca de 37,7 %.
NH4OH 4%
14
NH4OH 10%
12
NH4OH 15%
No tratado
10
8
6
4
2
0
0
10
15
20
25
30
35
Tempo (h)
Figura 41. Concentrao de glicose ao longo dos experimentos empregando bagao in

natura no tratado com amnia aquosa e bagao in natura pr-tratado com soluo de
NH4OH nas concentraes de 4, 10 e 15% (m/m).
A Figura 42 apresenta os valores da concentrao de etanol obtidas na

fermentao dos hidrolisados. A maior concentrao de etanol foi obtida no
experimento que utilizou 10% de soluo de NH4OH (m/m). Neste experimento a
concentrao de etanol alcanou o valor de 5,7 g/L.
81
Etanol (g/L)
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
NH4OH 4%
NH4OH 10%
NH4OH 15%
No tratado
Tempo (h)
Figura 42. Concentrao de etanol dos bagaos in natura no tratado e pr-tratado com
soluo de NH4OH nas concentraes de 4, 10 e 15% (m/m).
A Tabela 28 resume os resultados obtidos nestes experimentos de hidrlise

enzimtica e fermentao alcolica do bagao in natura.

alcolica das amostras do bagao in natura no tratado com NH4OH e pr-tratados a
100C.
Bagao
Converso em
Cmax etanol
Eficincia
Yp/s
In natura
glicose (%)
(g/L)
(%)
NH4OH 4%
57,2
3,8
82,5
0,42
NH4OH 10%
64,2
5,7
83,2
0,43
NH4OH 15%
58,6
4,9
83,1
0,43
No tratado com NH4OH
37,7
2,4
84,6
0,43
82
Os experimentos foram realizados com 7% de carga de slidos. As condies

experimentais das etapas de hidrlise e fermentao foram s mesmas dos experimentos
anteriores. A Figura 43 apresenta o grfico da concentrao de glicose obtida em cada
um dos diferentes experimentos realizados.
A mxima concentrao de glicose foi obtida no experimento utilizando 15% de
soluo de NH4OH foi de 48,8 g/L. E a menor concentrao de glicose foi para o
bagao explodido no tratado com soluo de NH4OH cerca de 21,1 g/L.
55
50
NH4OH 5%
45
NH4OH 10%
NH4OH 15%
40
No tratado
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
15
20
25
30
35
Tempo (h)
Figura 43. Concentrao de glicose ao longo dos experimentos empregando bagao

explodido no tratado e explodido pr-tratado com soluo de NH4OH nas
concentraes de 5, 10 e 15% (m/m).
A mxima converso obtida foi de 79,9% no experimento que utilizou bagao

explodido pr-tratado com soluo de NH4OH (15% m/m). A menor converso foi para
o bagao explodido no tratado com soluo de NH4OH cerca de 58,0%.
83
A Figura 44 apresenta o grfico da fermentao alcolica dos pr-tratados

explodido a 100C e do bagao no tratado com soluo de amnia aquosa. A maior
concentrao de etanol foi do pr-tratado com 15% de soluo de NH4OH alcanando
Etanol (g/L)
22,6 g/L.
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
NH4OH 5%
NH4OH 10%
NH4OH 15%
No tratado
Tempo (h)
Figura 44. Concentrao de etanol do bagao explodido no tratado e pr-tratado com

soluo de NH4OH nas concentraes de 5, 10 e 15% (m/m).
A Tabela 29 resume os resultados obtidos nestes experimentos de hidrlise

enzimtica e fermentao alcolica do bagao explodido.

das amostras do bagao explodido no tratado com NH4 e pr-tratados a 100C.
Bagao
Converso em
Cmax etanol
Eficincia
Yp/s
Explodido
glicose (%)
(g/L)
(%)
NH4OH 5%
70,5
16,5
91,9
0,47
NH4OH 10%
76,7
18,6
90,8
0,46
NH4OH 15%
79,9
22,6
90,8
0,46
No tratado com NH4OH
58,0
9,2
85,4
0,44
84
Nestes experimentos empregaram-se amostras de bagao pr-tratadas nas

melhores condies: in natura tratado com soluo de NH4OH 10% (m/m) (5% carga
de slidos) e explodido com soluo de NH4OH 15 % (m/m) (10% carga de slidos),
ambos por 1h a 100C.
Os experimentos de hidrlise enzimtica e fermentao alcolica foram
realizados nas mesmas condies anteriores. A Figura 45 mostra o grfico de
concentrao de glicose pelo tempo. A mxima concentrao de glicose foi de 26,0 g/L
e o mxima converso na etapa de hidrlise foi de 69,7% para o bagao in natura.
30
25
20
15
10
5
0
0
10
15
20
25
30
35
Tempo (h)
Figura 45. Concentrao de glicose do bagao in natura pr-tratado com soluo de

NH4OH 10% (m/m).
A Figura 46 apresenta o grfico da fermentao alcolica do pr-tratado in
natura a 100C em vrias condies de preparo de inculo. Foram realizados quatro
experimentos nos quais foram avaliados duas linhagens de levedura e dois inculos. A
maior concentrao de etanol foi para o inculo denominado rico com levedura
liofilizada cerca de 12,0 g/L (eficincia de 90,3%) e a menor concentrao de etanol foi
85
do inculo denominado pobre utilizando levedura comercial 10,6 g/L (eficincia de

79,5%).
12
IN_P_C
IN_P_L
IN_R_C
IN_R_L
Etanol (g/L)
10
0
0
Tempo (h)
Figura 46. Concentrao de etanol do bagao in natura em vrias condies de preparo

de inculo.
Legenda:
IN_P_C: Inculo pobre com levedura comercial;
IN_P_L: Inculo pobre com levedura liofilizada;
IN_R_C: Inculo rico com levedura comercial;
IN_R_L: Inculo rico com levedura liofilizada.
A Tabela 30 apresenta a influncia dos inculos no desempenho da fermentao

alcolica para o bagao in natura tratado com 10% de soluo de NH4OH.
Tabela 30. Influncia dos inculos no desempenho da fermentao alcolica do
hidrolisado proveniente da amostra de bagao in natura.
Inculos
Cmax etanol
Eficincia
Yp/s
(g/L)
(%)
IN_P_C
10,6
79,5
0,41
IN_P_L
10,8
81,0
0,41
IN_R_C
11,4
85,8
0,44
IN_R_L
12,0
90,3
0,46
86
A Figura 47 mostra o grfico de concentrao de glicose do bagao explodido

tratado com 15% de soluo de NH4OH ao longo do tempo. A concentrao mxima de
glicose foi de 74,5 g/L e a converso mxima foi de 82,1%.
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
15
20
25
30
35
Tempo (h)
Figura 47. Concentrao de glicose do bagao explodido pr-tratado com 15% de

soluo de NH4OH.
A Figura 48 apresenta o grfico da concentrao de etanol realizada com o

hidrolisado proveniente do bagao explodido pr-tratado. Neste experimento a maior
concentrao de etanol foi obtida com o emprego do inculo denominado rico com a
levedura liofilizada: 34,3 g/L (eficincia da fermentao de 90,1%). A menor
concentrao de etanol foi com o inculo denominado pobre utilizando levedura
comercial: 29,6 g/L (eficincia de 77,7%).
87
35
EXP_P_C
EXP_P_L
EXP_R_C
EXP_R_L
30
Etanol (g/L)
25
20
15
10
5
0
0
Tempo (h)
Figura 48. Concentrao de etanol do bagao explodido em vrias condies de preparo

de inculo.
Legenda:
EXP_P_C: Inculo pobre com levedura comercial;
EXP_P_L: Inculo pobre com levedura liofilizada;
EXP_R_C: Inculo rico com levedura comercial;
EXP_R_L: Inculo rico com levedura liofilizada.
A Tabela 31 apresenta a influncia dos inculos no desempenho da fermentao

alcolica do bagao explodido tratado com 15% de soluo de NH4OH.
Tabela 31. Influncia dos inculos no desempenho da fermentao alcolica do
hidrolisado proveniente da amostra de bagao explodido.
Inculos
Cmax etanol
Eficincia
Yp/s
(g/L)
(%)
EXP_P_C
29,6
77,9
0,40
EXP_P_L
30,4
79,8
0,41
EXP_R_C
33,0
86,8
0,44
EXP_R_L
34,3
90,1
0,46
88
A Tabela 32 apresenta um resumo de todos os resultados obtidos nos

experimentos de hidrlise enzimtica e fermentao alcolica empregando hidrolisados
obtidos a partir de amostras de bagao in natura e explodido submetidas etapa de prtratamento.

alcolica das amostras dos bagaos in natura e explodido pr-tratados.
Amostra de
Condio do pr-
Carga de
Converso em
Eficincia de
bagao
tratamento
slidos (%)
glicose (%)
fermentao (%)
Explodido
Sol. NH4OH 15%,
35,0
68,6
46,1
75,4
38,1
75,2
57,2
82,5
64,2
83,2
58,6
83,1
69,7
90,3
70,5
91,9
76,7
90,8
79,9
90,8
10
82,1
90,1
50 C, 30 min.
Explodido
Sol. NH4OH 15%,

50oC, 60 min.
Explodido
Sol. NH4OH 15%,

o
50 C, 90 min.
In natura
Sol. NH4OH 4%,

100oC, 1 hora.
In natura
Sol. NH4OH 10%,

o
100 C, 1 hora
In natura
Sol. NH4OH 15%,

o
100 C, 1 hora
In natura
Sol. NH4OH 10%,

o
100 C, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 5%,

100oC, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 10%,

o
100 C, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 15%,

o
100 C, 1 hora
Explodido
Sol. NH4OH 15%,

o
100 C, 1 hora
89
5. CONCLUSO
A partir dos resultados obtidos na etapa de pr-tratamento empregando soluo

de NH4OH a diferentes concentraes e condies experimentais conclui-se que:
Nos experimentos realizados com bagao in natura e explodido a
temperatura ambiente houve um aumento da composio percentual de
celulose. Nas condies avaliadas o pr-tratamento mostrou-se seletivo
na remoo da lignina e hemicelulose. A melhor condio foi obtida
para as amostras pr-tratadas por 30 dias;
Nos experimentos realizados com bagao explodido a temperatura de
50C e com concentrao da soluo de NH4OH de 15% (m/m) por
tempos de reao de 30, 60 e 90 minutos, obteve-se um incremento na
composio percentual de celulose para o tempo de reao de 90
minutos. Nas condies avaliadas o pr-tratamento mostrou-se seletivo
na remoo da lignina e hemicelulose;
Nos experimentos realizados a 100C por 60 minutos com amostras de
bagao in natura e explodido variou-se a concentrao da soluo de
NH4OH (4, 5, 10 e 15%). Para a amostra de bagao in natura tratado
com concentrao de 10% NH4OH quase no houve perda de celulose.
A remoo de lignina e hemicelulose foram satisfatrias. Para a amostra
de bagao explodido a melhor condio foi obtida na concentrao de
15% de soluo de NH4OH. Nesta condio, obteve-se a maior remoo
de lignina e hemicelulose.
Estes resultados apontam preliminarmente para a potencialidade da utilizao do

pr-tratamento por amnia aquosa no processo de produo de etanol celulsico. A
composio da amostra de bagao in natura obtida na melhor condio de prtratamento (10% de NH4OH, 100C e 60 minutos) foi: celulose (42,9%), hemicelulose
(9,0%) e lignina total (6,3%), com rendimento de 59,7%. Para a amostra de bagao
explodido, a melhor condio de pr-tratamento foi obtida empregando soluo de
90
NH4OH 15%, a 100C por 60 minutos. (celulose (49,8%), hemicelulose (2,1%) e

lignina total (9,8%), com rendimento de 62,9%.
Os experimentos de hidrlise enzimtica empregando as amostras de bagao in
natura obtiveram os seguintes resultados:
Amostras pr-tratadas a 100C por 60 minutos, concentrao de NH4OH
(4, 10 e 15%), carga de slidos de 3%, carga de enzima de 30 FPU/g de
celulose e 5 CBU/g de celulose: rendimento de hidrlise (converso em
glicose) de 64,2% para a amostra tratada com soluo 10% NH4OH;
Amostra pr-tratada a 100C por 60 minutos, soluo 10% de NH4OH,
10% de carga de slidos e carga de enzima de 30 FPU/g de celulose:
rendimento de hidrlise (converso em glicose) de 69,7%.
Os experimentos de hidrlise enzimtica realizados com amostras de bagao

explodido pr-tratadas obtiveram os seguintes resultados:
Amostras pr-tratadas com soluo de NH4OH 15% (m/m), a 50C,
carga de slidos de 1% e carga enzimtica de 30 FPU/g de bagao e
30 CBU/g de bagao: rendimentos de hidrlise (converso em glicose)
de 35,0% (30 minutos), 46,1% (60 minutos) e 38,1% (90 minutos);
Amostras pr-tratadas a 100C por 60 minutos com solues de NH4OH
(5, 10 e 15%), carga de slidos 7% e carga enzimtica de 30 FPU/g de
celulose e 5 CBU/g de celulose: melhor rendimento de hidrlise
(converso em glicose) para a amostra tratada com soluo 15% de
NH4OH, 79,9%;
Amostra pr-tratada a 100C por 60 minutos, soluo 15% de NH4OH,
10% de carga de slidos e 30 FPU/g de celulose: rendimento de
hidrlise (converso em glicose) de 82,1%.
91
O resultado da hidrlise enzimtica da amostra de bagao in natura pr-tratado

na melhor condio apresentou rendimento de hidrlise (converso em glicose) melhor
que o da amostra de bagao explodido no lavado. Os valores obtidos foram 69,7% para
o bagao in natura tratado com 10% de soluo de NH4OH e 58,0% para o bagao
explodido no lavado, embora os experimentos tenham sido realizados com diferentes
cargas de slidos (5% para o in natura e 7% para o explodido). As eficincias obtidas
na fermentao foram da mesma ordem, 85%.
Nos experimentos realizados com diferentes cargas de enzima verificou-se no
ser necessria a complementao com a enzima -glucosidase.
Nos experimentos realizados com amostra de bagao explodido o aumento na
carga de slidos de 7 para 10% no influenciou no rendimento da hidrlise enzimtica
(converso em glicose), variao da ordem de 3%.
A fermentao dos hidrolisados obtidos na etapa de pr-tratamento foi realizada
empregando a levedura Saccharomyces cerevisiae (linhagens comercial e industrial). As
eficincias na converso da glicose a etanol foram acima de 78% para as fermentaes
empregando meio pobre e da ordem de 88% para os experimentos utilizando meio
rico. Em todos os experimentos realizados a levedura industrial apresentou uma maior
eficincia em relao levedura comercial.
92
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n. 1, p. 5-19, 1995.
100
APNCIE A: Cromatogramas das anlises dos hidrolisados para o bagao explodido

no tratado com NH4OH e pr-tratados a 50C.
Tampo
citrato
Glicose
Xilose
Cromatograma do bagao explodido tratado por 30 minutos. Hidrlise enzimtica

realizada com 1% de carga de slidos.
101
Tampo
citrato
Glicose
Xilose

102
Tampo
citrato
Glicose
Xilose

103
Tampo
citrato
Glicose
Xilose
Cromatograma do bagao explodido (cominudo a 20 mesh). Hidrlise enzimtica

104

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLGICAS

GISLENE MOTA DA SILVA

PR-TRATAMENTO DO BAGAO DE CANA DE ACAR

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOS

GISLENE MOTA DA SILVA

PR-TRATAMENTO DO BAGAO DE CANA DE ACAR COM

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao

Universidade Federal de So Carlos como parte

concentrao Pesquisa e Desenvolvimento de

Orientao: Prof. Dr. Antonio Jos Gonalves da Cruz

Ficha catalogrfica elaborada pelo DePT da

Silva, Gislene Mota da.

Este trabalho dedicado a

Na hora de resolver um problema, no descreia da soluo, como quem comea a viajar

Descrena mente fraca.

Seja forte e reaja.

Sobretudo, acredite que o problema no existe, existindo apenas um conjunto de idias

Seguro os pensamentos para no carem na dvida.

Reconhea-se com a fora de um gigante e nada veja como imodificvel.

Uma pessoa pequena frente ao mar, mas grande frente a um pingo.

Aos amigos dos Laboratrios Geral, Controle, Tecnologia Enzimtica e Simulao.

Ao Programa de Ps-graduao do Departamento de Engenharia Qumica da

Ao Conselho Nacional de Desenvolvomento Cientfico e Tecnolgico - CNPq pelo apoio

Ao projeto temtico BIOEN-FAPESP pelo apoio financeiro.

empresa Genencor pelo fornecimento das enzimas utilizadas neste trabalho.

E a todas as outras pessoas que, de maneira direta ou indiretamente colaboraram para a

1.1.1 Objetivos especficos

2.1 Cana de acar

2.3 Metabolismo da glicose

2.4 Produo de etanol

2.5 Materiais lignocelulsicos

2.5.1 Estruturas das fibras e fibrilas

2.6.1 Amnia aquosa

3.1 Bagao de cana de acar

3.4 Pr-tratamento do bagao de cana

3.4.1 Pr-tratamento com amnia aquosa a temperatura ambiente

3.4.2 Pr-tratamento do bagao explodido com amnia aquosa a 50C

3.4.3 Pr-tratamento do bagao in natura com amnia aquosa a 100C

3.4.4 Pr-tratamento do bagao explodido com amnia aquosa a 100C

3.5 Caracterizao qumica dos bagaos de cana de acar

3.5.1 Hidrlise cida

3.5.2 Determinao da lignina solvel

3.5.3 Determinao de lignina insolvel

3.5.4 Determinao de cinzas da lignina e do bagao

3.5.5 Determinao de carboidratos e cidos orgnicos

3.5.6 Determinao de hidroximetilfurfural e de furfural

3.6 Hidrlise enzimtica

3.6.1 Determinao da concentrao de glicose

3.6.2 Bagao explodido pr-tratado com amnia aquosa a 50C

3.6.3 Bagao in natura pr-tratado com amnia aquosa a 100C

3.6.4 Bagao explodido pr-tratado com amnia aquosa a 100C

3.6.5 Bagao in natura e explodido pr-tratado com amnia aquosa a 100C

3.7 Fermentao alcolica

3.7.1 Determinao da concentrao de etanol

3.7.2 Preparo do inculo e do meio de fermentao alcolica

3.7.3 Bagao in natura e explodido pr-tratado com amnia aquosa a 100C

3.8 Anlise por microscopia eletrnica de varredura (MEV)

4.1 Caracterizao dos bagaos in natura e explodido

4.1.1 Caracterizao dos bagaos pr-tratados a temperatura ambiente 243 C

4.1.2 Caracterizao dos bagaos pr-tratados a 50C

4.1.3 Caracterizao do bagao in natura pr-tratado a 100C

4.1.4 Caracterizao do bagao explodido pr-tratados a 100C

4.2 Hidrlise enzimtica e fermentao alcolica