UNIVERSIDAD TCNICA DE COTOPAXI

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y

RECURSOS NATURALES.

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA

ANTEPROYECTO DE TESIS PREVIO A LA OBTENCIN DEL TITULO DE

MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA.

TEMA:
OBTENCIN DE CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS UTILIZANDO
FILGRASTIM A 3 DIFERENTES DOSIS 5, 10 Y 15 MICROGRAMOS EN
CUYES (CAVIA PORCELLUS)

POSTULANTE.
Edison Gustavo Snchez Cepeda
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. Miguel Gutirrez
Latacunga Ecuador
2015

1. TITULO

OBTENCIN DE CLULAS MADRE HEMATOPOYTICAS UTILIZANDO

FILGRASTIM A 3 DIFERENTES DOSIS 5, 10 Y 15 MICROGRAMOS EN
CUYES (CAVIA PORCELLUS)
2. PROBLEMATIZACIN O CARACTERIZACIN GENERAL DE LA
PROBLEMTICA A INVESTIGAR
2.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Durante los ltimos aos en el Ecuador las investigaciones y artculos cientficos acerca
del uso de clulas madre en medicina veterinaria han sido literalmente pocas; siendo
una de las terapias alternativas con resultados ms que positivos en especies de inters
como la equina y canina a nivel mundial.
En general la mayora de mtodos de aislamiento de clulas madre estn registrados en
el campo de la medicina humana con amplios protocolos tanto de movilizacin,
obtencin, preservacin y aplicacin; mientras tanto en medicina veterinaria se
describen pocos protocolos de uso de clulas madre y con especificidad las clulas
madre hematopoyticas (Schwarz, 2011).
En la actualidad los mtodos utilizados para obtener clulas madre hematopoyticas
(CMHs) son sumamente invasivos en los que se cita aquellos procedimientos tales como
punciones de esternn, puncin de la cresta ilaca o de sangre de cordn umbilical.
Estos mtodos de obtencin generan una mayor tasa de morbilidad y mortalidad, se
realiza en un entorno de anestesia general y adems una produccin ms lenta de clulas
madre hematopoyticas y clulas madre mesenquimales (CMMs).
2.1.1. FORMULACIN DEL PROBLEMA
Cul es la probabilidad de obtencin de clulas madre hematopoyticas de los cobayos
al usar filgrastim en tres diferentes dosis?
Qu niveles de concentracin y movilizacin de clulas madre hematopoyticas se
obtendr al inocular tres diferentes dosis de filgrastim en cobayos?
2.2. JUSTIFICACIN
2

Debido a las desventajas que se asocian a la obtencin de CMHs de mdula sea; el

mtodo de obtencin de CMHs de sangre perifrica es el ms accesible y menos
invasivos en los animales que se realiza este procedimiento biomdico en comparacin
de los otros procesos que existen; ya que la mayora de investigaciones con clulas
madre (CM) en animales se las realizan con dosis utilizadas en estudios de humanos.
La investigacin pretende valorar la efectividad del Filgrastim cmo agente movilizador
de clulas madre hematopoyticas al usarlo en diferentes dosis tal cual cmo se lo
realiza en la especie humana; para estandarizar un proceso de aplicacin del frmaco
utilizando la especie cobayo como modelo animal.
Por tal motivo es prioritario dentro de la carrera de medicina veterinaria establecer ste
protocolo bsico de obtencin de clulas madre hematopyticas en la especie cobaya;
y se pretende dar la pauta inicial para aplicar el mismo principio en otras especies de
inters zootcnico.

2.3.

OBJETIVOS
2.3.1. OBJETIVO GENERAL
Obtener clulas madre hematopoyticas en cuyes utilizando filgrastim a
tres diferentes dosis.
2.3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Determinar y analizar los cambios producidos en los componentes

celulares de la sangre entera recolectada pre y post tratamiento

Identificar clulas madre hematopoyticas movilizadas
Valorar el mejor tratamiento con filgrastim para la movilizacin clulas
madre hematopoyticas en la especie cobaya.

3. FUNDAMENTACIN TERICA
3.1. Clulas Madre

Las clulas madre son clulas que se encuentran en todos los organismos multicelulares
y que tienen la capacidad de dividirse (a travs de la mitosis) y diferenciarse en diversos
tipos de clulas especializadas, adems de autorenovarse para producir ms clulas
madre. (Hans R, 2007).
3.1.1. Clasificacin
3.1.1.1. Potencial de diferenciacin
Clulas madre totipotentes, pueden crecer y formar un organismo completo,
tanto los componentes embrionarios (como por ejemplo, las tres capas
embrionarias, el linaje germinal y los tejidos que darn lugar al saco vitelino),
como los extra embrionarios (como la placenta). Es decir, pueden formar todos los
tipos celulares (Mitalipov S, Wolf D. 2009).
Clulas madre pluripotentes, no pueden formar un organismo completo, pero s
cualquier otro tipo de clula correspondiente a los tres linajes embrionarios
(endodermo, ectodermo, mesodermo), as como el germinal y el saco vitelino
(Caulfield,T. Rachul, C.2012).
Clulas madre multipotentes, son aquellas que slo pueden generar clulas de su
misma capa o linaje de origen embrionario por ejemplo: una clula madre
mesenquimal de mdula sea, al tener naturaleza mesodrmica, dar origen a
clulas de esa capa como miocitos, adipocitos u osteocitos, entre otras (Hsu YC,
Fuchs E. 2012).
Clulas madre unipotentes, pueden formar nicamente un tipo de clula en
particular (Hsu YC, Fuchs E. 2012).

3.1.1.2. Por su origen

Clulas madre embrionarias, son consideradas pluripotentes ya que presentan la
capacidad de diferenciarse a tejidos de las tres capas embrionarias. Tienen la
4

capacidad de proliferar continuamente gracias a un perfil transcripcional nico

que las mantiene en un estado indiferenciado (Frisbie DD & Kisiday JD, 2009).
Clulas madre germinales, se localizan en la cresta gonadal de los fetos. Este
lugar es un esbozo de las gnadas y es donde tiene lugar la diferenciacin de la
lnea germinal de vulos y espermatozoides. Estas clulas son pluripotenciales y
tienen una capacidad de diferenciacin similar a las embrionarias (Berg L, Koch
T, Heerkens, 2009).
Clulas madre fetales, se encuentran formando parte de los tejidos y rganos
fetales como sangre, hgado, pulmn. Su potencial de diferenciacin es similar al
de las clulas adultas, aunque parecen mostrar mayor capacidad de expansin y
diferenciacin que stas al encontrarse en un estado primitivo (Rosova I, & Dao
M, 2008).
Clulas madre adultas, poseen la capacidad de diferenciarse para dar lugar a
clulas adultas del tejido en el que se encuentran, por lo tanto se consideran
clulas multipotenciales. En un individuo adulto se conocen hasta ahora alrededor
de 20 tipos distintos de clulas madre, que son las encargadas de regenerar tejidos
en continuo desgaste (como la piel o la sangre) o daados (como el hgado). (b)
Clulas madre hematopoyticas (CMH), las clulas de la sangre en el cuerpo
comienzan

como

clulas

jvenes

(inmaduras)

llamadas

clulas

madre

hematopoyticas (el trmino hematopoytico significa formacin de clulas

sanguneas). Aunque se les denomina clulas madre, estas clulas no son las
mismas que las clulas madre embrionarias, las cuales son estudiadas en la
clonacin y en otros tipos de investigacin.
Las clulas madre viven principalmente en la mdula sea (la parte interior
esponjosa de ciertos huesos) y es aqu donde se dividen para la produccin de
nuevas clulas sanguneas. Una vez que las clulas sanguneas maduran, stas
salen de la mdula sea y entran al torrente sanguneo; a este proceso se le
denomina hematopoyesis. (a)
La hematopoyesis es el proceso que permite la formacin, desarrollo y
maduracin de los elementos

de la sangre como: eritrocitos, leucocitos y

plaquetas a partir de un precursor celular comn e indiferenciado conocido como

5

clula madre hematopoytica pluripotencial. Asimismo, un pequeo nmero de

clulas madre entra en el torrente sanguneo, las cuales se conocen como las
clulas madre de la sangre perifrica. (h)
Las HSCs poseen otra facultad denominada plasticidad que consiste en dar origen
a clulas diferentes a las del linaje hematopoytico, por ejemplo: clulas
neuronales, msculo esqueltico, msculo cardiaco, y clulas hepticas, como
tambin epitelio de la piel, pulmones y riones, esto gracias a la sealizacin del
medio en el que se encuentre. (1)
Figura 1: Esquema del proceso de formacin de la sangre

Fuente: http://medicinamiguellopez.blogspot.com/2013
3.2. Filgrastim
Es un frmaco que se utiliza para estimular la produccin de clulas granulocticas
(clulas del linaje leucocitario) en pacientes que reciben terapias que causan un
descenso en los recuentos de glbulos blancos, tambin se usa para evitar infecciones y
fiebres neutropnicas provocadas por el uso de agentes quimioteraputicos. (g)

3.2.1. Presentaciones farmacuticas: viales jeringas (Tabla 1). El filgrastim o factor

estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) es un lquido incoloro, libre de
preservantes, que debe ser administrado por va intravenosa o subcutnea y que contiene
filgrastim a una actividad especfica de 1.0 0.6 x 108 U/mg (medido por ensayos de
mitognesis celular). (5)
Tabla 1. Composicin del producto dependiendo de la presentacin:

Fue
nte: http://www.neupogen.com/pi.html/2013
3.2.2. Absorcin y eliminacin: la tasa de eliminacin depende de la concentracin del
frmaco en sangre y la vida media de eliminacin en individuos normales y pacientes
con cncer fue de aproximadamente 3.5 horas. La tasa de eliminacin fue de 0.5 a 0.7
mL/minuto/kg. (5)
3.2.3. Dosis y Administracin: El esquema de administracin del medicamento en
humanos vara dependiendo de la enfermedad que se est tratando, y el rango de dosis
que se maneja es de 4 - 69 Ug/kg/da por va intravenosa subcutnea, siendo de la
aplicacin subcutnea la menor dosis. (5)
3.2.4. Efectos del Tratamiento: Reduce significativamente el tiempo de recuperacin
de pacientes tratados para diferentes enfermedades reduciendo la duracin de la fiebre,
el uso de antibiticos, y el tiempo de hospitalizacin. (4)
Entre los efectos del G-CSFrh sobre los neutrfilos estn la estimulacin de
proliferacin de precursores mieloides y la reduccin del tiempo de trnsito de los
neutrfilos inmaduros por mdula para ser liberados ms rpidamente a circulacin
sangunea. Tambin moviliza vesculas secretoras e induce a liberacin del contenido de
los grnulos, activando la funcin fagoctica y el estallido respiratorio. (6)

3.2.5. Movilizacin de HSCs por accin del G-CSF: Entender el efecto clnico de la
movilizacin de las HSCs desde mdula sea (BM) a sangre perifrica (PB) pos
tratamiento con el G-CSFrh, es an motivo de investigacin. Se han postulado
diferentes teoras que explican el fenmeno, que no son mutuamente excluyentes y son
resultado de diferentes estudios. (3)
Lograr en pacientes una movilizacin exitosa con G-CSF, es decir; alcanzar el nmero
deseado de HSCs puede depender de diversos factores como la edad, la patologa, el
grado de compromiso, la carga de quimioterapia y/o radioterapia recibida, adems de la
intensidad del tratamiento. Por otra parte, tambin depende de las caractersticas del
producto utilizado. (2)
3.3.

El Cuy

3.3.1. Generalidades
Es una especie de roedor histricomorfo de la familia Caviidae originaria de la regin
andina de Amrica del Sur. Alcanza un peso de hasta 1 kg. Vive en reas abiertas y
utiliza hoyos y madrigueras para ocultarse y protegerse. La especie fue descrita por
primera vez por el naturalista suizo Conrad von Gesner en 1554. Su nombre cientfico
se debe a la descripcin de Erxleben en 1777, y es una mezcla de la designacin del
gnero de Pallas (1766) y el nombre especfico dado por Linneo (1758). (c)
3.3.2. Origen
Aliaga, L. (1978), indica que el cuy desciende de una especie peruana, conocida en su
estado salvaje con el nombre de cavia cutleri, que fue domesticada primeramente por los
antecesores de los Incas y pueblos afines de la regin andina, en tiempos muy remotos.
Al respecto cadena, S. (2000), manifiesta que el cuy es un roedor oriundo de Amrica
del Sur, en la zona interandina; fue domesticado por los aborgenes en tiempos
preincsicos, mucho antes de los europeos, y que las variedades modernas son
posiblemente descendientes de un precursor desconocido, ya extinto, que se cree
habitaba en la costa oriental de Brasil.
3.3.3. Nombre
El nombre cuy que recibe este roedor en los pases interandinos, proviene seguramente
de la imitacin del sonido natural producido por el animal; aunque en diferentes lugares
se pronuncia de distinto modo: cuy, cuye, cu, coy, curi, coic, cuize (cadena, S. 200).
8

Tambin es conocido con los nombres de cobayo, curi, conejillo de indias y en pases de
habla inglesa como guinea pig. (Gmez, J. 2007).
3.3.4. Descripcin taxonmica
Aliaga, L. (1978), indica que en la escala zoolgica ubica al cuy en la siguiente
clasificacin:
Phylum: Vertebrata
Clase: Mammalia
Orden: Rodentra
Familia: Caviidae
Gnero: Cavia
Especies:Cavia aperea aperea, Erxleben
Cavia aperea azarea, Lichtenstein
Cavia porcellus, Linnaeus
3.3.5. Clasificacin
Los cuyes presentan tipos y variedades de acuerdo a su conformacin, forma y longitud
de pelo y tonos del pelaje (Palomino, R. 2002).
a. Segn su conformacin
Tipo A: Corresponde a cuyes mejorados, con gran dsarrollo muscular, tiene
buena conversin alimenticia y de temperamento tranquilo por lo que es
considerado un clsico productor de carne. ( Gomez, J. 2007)
Tipo B: Corresponde a los cuyes de forma angulosa, escaso desarrollo muscular
y muy nerviosos. Son de temperamento alterado por lo que se hace difcil su
manejo. (Gmez, J. 2007).
b. Segn el pelaje
Tipo 1: Es de pelo corto, lacio y pegado a lo largo del cuerpo; el cual se le
considera el mejor productor de carne
Tipo 2: Es de pelo corto, lacio y pegado a lo largo del cuerpo y que por tal
motivo muestran un pelaje irregular.
Tipo 3: Es de pelo largo y lacio. Es poco difundido como productor de carne
pero muy solicitado por la belleza que muestra su pelaje y es usado como
mascota.

Tipo 4: es de pelo ensortijado al nacimiento, pero se torna lacio-erizado en la

madurez. Adems es un animal poco frecuente y se caracteriza por el sabor
agradable de su carne. (Gmez, J. 2007).
c. Segn a coloracin del pelaje
Pelaje simple: lo constituyen pelajes de un solo color, entre los que podemos
distinguir: Blanco, bayo (amarillo), alazn (rojizo), violeta y negro.
Pelaje compuesto: son tonalidades formadas por pelos que tienen dos o ms
colores, entre los que tenemos: Moro, lobo y ruano.
Overos: son combinaciones de dos colores, siempre prente el moteado blanco,
que puede o no ser dominante. En la denominacin se nombra el color
predominante.
Fajados: Tienen los colores divididos en secciones o franjas de diferentes
colores. (Palomino, R. 2002).
Tabla 2. Datos biolgicos
Esperanza de vida
Peso corporal adulto macho
Peso corporal adulto hembra
Ingesta media diaria de agua
Hibernacin
Frmula dentaria

4-8aos
850-1200g
700-900g
10ml/100g
No
2 ( I 1/1 C 0/0 PM 1/1 M 3/3), todos los
dientes son de crecimiento continuo, no

slo los incisivos.

Fuente:http://www.vetjg.com/shared/php/page.php?
page=artic_peq_medicina_cobaya/2014
Tabla 3. Datos fisiolgicos
Frecuencia respiratoria
90-150rpm
Frecuencia cardiaca
230-310rpm
Temperatura rectal
37.2-39.5C
Volumen sanguneo
75ml/Kg.
Fuente:http://www.vetjg.com/shared/php/page.php?
page=artic_peq_medicina_cobaya/2014
Tabla 4. Constantes hematolgicas
Valor hematocrito
Recuento de eritrocitos
Concentracin de hemoglobina

35-45%
5x1012/L
14.3g/dl
10

Recuento de leucocitos
11.2x109/L
Neutrfilos
37%
Linfocitos
56%
Eosinfilos
5%
Monocitos
8%
Basfilos
2%
Glucosa srica
60-120mg/dl
Bilirrubina total
0.24-0.3mg/dl
Potasio
6.5-8.2meq/L
Sodio
120-155meq/L
BUN
8-20mg/dl
Fosfatasa alcalina
23 UI/L
Fuente:http://www.vetjg.com/shared/php/page.php?
page=artic_peq_medicina_cobaya/2014
3.4. Biometra Hemtica
La biometra hemtica tambin denominada citometra, citologa hemtica o
hemograma es la medicin y reporte de los componentes celulares de la sangre. En la
actualidad la biometra hemtica la integra la determinacin de 15 parmetros y es el
primer examen al que se enfrenta el clnico en la valoracin diagnstica de un paciente.
(7)
El examen valora el estudio de tres lneas celulares, cada una con funciones diferentes
entre s, pero tienen en comn que las produce la mdula sea (eritrocitos, leucocitos,
plaquetas) y consta de dos bloques principales:
1. Formula Roja: Determina los parmetros relacionados con el eritrocito y se
-

compone de los siguientes parmetros:

Hematocrito (Ht): Es el porcentaje de la sangre que est compuesta por
eritrocitos.

Hemoglobina (Hb): Es determinada la cantidad de esta protena expresada en

g./dl.

Conteo Eritroctico (Eri): Es la cantidad total de eritrocitos circulantes por micro

litro de sangre.

2. Formula Blanca: Determina los parmetros relacionados con los leucocitos

(neutrfilos, basfilos, eosinfilos). (i)

11

3.4.1.

Soluciones

anticoagulantes:

Las

diversas

soluciones anticoagulantes

preservativas permiten conservar la sangre durante perodos de 21 das a 42 das a 16C. (j)
-

ACD: cido ctrico, Citrato de sodio, Dextrosa

Vida media 21 das; proporcin 10 cc/60 ml de sangre.

CPD: Citrato de sodio, Fosfato, Dextrosa

Vida media 28 das; proporcin 10 cc/ 60ml de sangre

CPDA: Citrato de sodio, Fosfato, Dextrosa, Adenina

Vida media 35 das; proporcin 10 cc/ 60ml de sangre

HEPARINA:
Vida media 30 horas; proporcin aproximada 400UI/ 60 ml de sangre (j

3.5. Gelofusine
Gelatina Succinilada: Libre de Calcio y de Potasio. Solucin para infusin intravenosa
al 4%.
3.5.1. Composicin: Cada 100 ml contiene: Gelatina Succinilada (Gelatina Fluida
modificada) (peso molecular promedio 30.000) 4.000 g; Cloruro de Sodio 0.701 g;
Hidrxido de Sodio 0.136 g; Agua para Inyectables c.s.p. 100.000 ml. Electrolitos
mmol/l; Na+ 154; Cl- 120; pH 7.1-7.7; Osmolaridad 274 mOsm/l. (f)
3.5.2. Farmacologa: Los efectos intravasculares inmediatos de los sustitutos
plasmticos dependen de su actividad onctica, de su concentracin y de su peso
molecular. El volumen sanguneo medido algunas horas despus de la inyeccin
depende slo de la diferencia entre el volumen administrado para la restitucin
endgena y la eliminacin del sustituto plasmtico del espacio intravascular.(e)
La gelatina fluida modificada tiene un efecto de reposicin de volumen inmediato y al
mismo tiempo suave, sin riesgo de sobrecarga circulatoria o deshidratacin intersticial
debido a su actividad isoonctica. (e)
3.5.3. Farmacocintica: La vida media de Gelofusine es de 4 horas, y su efecto
plasmtico dura entre 4 y 6 horas. Transcurridas 24 horas, queda un 10% de
Gelofusine en plasma y un 25% en el compartimiento extravascular. La fraccin que
no se excreta se metaboliza totalmente en el organismo. Su eliminacin se efecta en
dos tiempos: una fase renal y otra de degradacin enzimtica de la gelatina a nivel
heptico. (e)
12

3.5.4. Indicaciones: Como sustituto coloidal de volumen para:

-

Profilaxis y tratamiento de la hipovolemia absoluta y relativa (p. ej., secundarias

al choque por hemorragia o trauma, prdidas sanguneas perioperatorias,
quemaduras, sepsis). (e)

Profilaxis de la hipotensin (p. ej., asociada a la induccin de una anestesia

epidural o espinal)

Circulacin extracorprea (mquina corazn-pulmn, hemodilisis).

Aumento del nmero de leucocitos en la leucofresis.

3.5.5. Posologa y Administracin: La dosis, la velocidad de infusin y la

administracin dependen de los requisitos individuales y han de ajustarse en funcin de
los requisitos actuales mediante vigilancia de los parmetros principales de la
circulacin. A fin de identificar cuanto antes las reacciones alrgicas (anafilcticas/
anafilactoides) descritas bajo efectos indeseables, deben aplicarse mediante infusin
lenta los primeros 20 a 30 ml, observndose atentamente al paciente. (e)
3.5.6. Contraindicaciones:
No debe administrarse en caso de:
-

Hipersensibilidad conocida a la gelatina

Hipervolemia

Hiperhidratacin

Insuficiencia cardaca grave

Transtorno grave de la coagulacin sangunea

Debe administrarse con mucho cuidado en caso de:

Hipernatremia, dado que Gelofusine contiene sodio

Estados de deshidratcin, dado que en estos casos debe primero el balance de

lquidos.

Insuficiencia renal, dado que la va de excrecin puede estar afectada.

Hepatopata crnica, debido a que en este caso la sntesis de albmina y los

factores de coagulacin pueden estar afectados. (e)

3.6. Marco Conceptual

3.6.1. Mtodos de Obtencin de Clulas Madre

13

2002. HERTEL, inicia la investigacin con clulas madre mesenquimales que

consista en aspirar mdula sea del esternn de equinos. (l)
2002. Harman, reporta el uso de tejido adiposo equino como fuente abundante y
accesible de clulas progenitoras para fines teraputicos en animales de
competencia.
2002. GARCA, presenta que por liposuccin se obtiene un nmero ms elevado de
clulas madre para el trasplante autlogo en el tratamiento de la patologa fistulosa
ano rectal en pacientes con enfermedad de Crohn en el centro de investigacin
Genetrix. (o)
2007. AREVALO, informa la obtencin y cultivo de clulas madre a partir de
sangre de cordn umbilical y mdula sea en humanos.
2010. GMEZ, ratifica el aislamiento de clulas madre a partir de mdula sea.
2011. GAYTN, presenta el metdo de obtencin de clulas madre de sangre de
cordn umbilical en humanos.
2011. JIMNEZ, lleva acabo la obtencin de clulas madre a partir de la pulpa
dental de una persona 0posterior a la extraccin del tercer molar. (n)
2011. MCCARTHY, indica que las clulas madre mesenquimales procedentes de
tejido adiposo del caballo son adecuadas para producir un cartlago funcional.
2012. El mdico BOLTZE, realiza el aislamiento de clulas madre de la mdula
sea de los bovinos en el departamento de neuroregeneracin en el Instituto
Fraunhofer de Leipzig. (m)
2012. DE VITA, deriva CMM de lquido amnitico, membrana amnitica, sangre
del cordn umbilical y tejido de cordn umbilical humano de manera no invasiva y
sin dolor. (q)
2012. VENTURA, indica la obtencin de clulas madre de la membrana amnitica
en perros para el uso en medicina regenerativa. (r)
2012. VILLAGRASA, informa la obtencin, cultivo y proliferacin de clulas
madre mesenquimales en perros de raza Beagle. (s)

14

2012. VENTURA, indica la obtencin de clulas madre cardiacas aisladas de

corazones sanos o afectados con distrofia muscular del golden retriever en la
Universidad catlica de Lovaina (Blgica). (t)
2014. NAGY, reprograma las clulas somticas equinas permitiendo que las lneas
celulares iPS expresaran pluripotencialidad. (p)
3.7. Glosario de Trminos

Afresis: La afresis es la tcnica mediante la cual se separan los componentes

de la sangre, siendo seleccionados los necesarios para su aplicacin

en medicina y devueltos al torrente sanguneo el resto de componentes.

Alcuota: Es una parte que se toma de un volumen (alcuota lquida) o de una

masa (alcuota slida) iniciales para ser usada en una prueba de laboratorio.
Coloidal: Es una sustancia cuyas partculas pueden encontrarse en suspensin
en un lquido, merced al equilibrio coloidal; dichas partculas no pueden

atravesar la membrana semipermeable de un osmmetro.

Embrin: Es la etapa inicial del desarrollo de un ser vivo mientras se encuentra

en el huevo o en el tero de la madre.

Esbozo: Proyecto, plan que se puede alcanzar mayor desarrollo y extensin.
Extracorprea: Que ocurre o se desarrolla fuera del cuerpo.
Granulopoysis: La granulopoyesis consiste en el proceso que permite la
generacin de los neutrfilos, basfilos y eosinfilos (granulocitos polimorfo

nucleares de la sangre).
Hipernatremia: es un trastorno hidroelectroltico que consiste en un elevado
nivel del ion sodio en la sangre (lo contrario de la hiponatremia, que significa

bajo nivel de sodio).

Histricomorfo: Dcese de los roedores que se caracterizan por tener el agujero
infraorbitario muy grande, atravesado por el masetero. II m. pl. Zool. Grupo

formado por estos roedores.

Leucofresis: Proceso por el que se extrae sangre de una vena, se extraen

leucocitos de forma selectiva y se reinfunden el resto de sangre en el donante.

Mitognesis: Induccin de la mitosis de una clula.
Pellet: Es una denominacin genrica, utilizada para referirse a pequeas

porciones de material aglomerado o comprimido.

Neutropenia: La neutropenia es un trastorno hematolgico caracterizado por un
nmero anormalmente bajo de neutrfilos, el tipo ms importante de glbulos
blancos en la sangre.

4. DISEO DE LA INVESTIGACIN
15

4.1.

HIPOTESIS
4.1.1. HIPOTESIS NULA
Mediante la aplicacin de tres diferentes dosis de filgrastim no se
obtiene clulas madre hematopoyticas de sangre perifrica
4.1.2. HIPOTESIS ALTERNATIVA
Mediante la aplicacin de tres diferentes dosis de filgrastim se
obtiene clulas madre hematopoyticas de sangre perifrica.

4.2.

OPERACIONALIZACIN DE LAS VARIABLES O DE LAS

CATEGORIAS FUNDAMENTALES.

VARIABLE

VARIABLES

INDEPENDIENTE

DEPENDIENTES

Filgrastim
(5 Ug., 10 Ug., 15Ug.)

4.3.

INDICADORES

Leucocitos-

Neutrfilos, %

Basfilos,

Eosinfilos-

(Neutrfilos

Cayados- %

Neutrfilos Segmentados)

Eritrocitos

Plaquetas

DISEO METODOLGICO

4.3.1. TIPO DE INVESTIGACIN

El ensayo seleccionado ser de tipo

experimental; ya que provocaremos

voluntariamente una situacin en donde controlaremos las variables posibles

para evaluar los efectos en funcin de la movilizacin y concentracin de clulas
madre hematopoyticas obtenidas.
4.3.2. METODOLOGA
El tipo de metodologa es experimental; ya que el investigador controla
deliberadamente las variables para delimitar relaciones entre ellas y est basado
en la metodologa cientfica. Se recopilarn datos para comparar las mediciones
de comportamiento de un grupo control, con las mediciones de un grupo
experimental.

16

Las variables a utilizar pueden ser variables dependientes (las que queremos
medir o el objeto de estudio del investigador) y las variables independientes (las
que el investigador manipula para ver la relacin con la dependiente).

4.3.3. DISEO EXPERIMENTAL

Para la presente investigacin se utilizar un Diseo Completamente al Azar,
compuesto de cinco observaciones para cada tratamiento inducido. En donde se
halle

diferencias

estadsticas

se

aplicarn

pruebas

de

significacin.

Adicionalmente se realizar correlaciones entre los comportamientos de clulas

sanguneas en cada uno de los grupos experimentales.
Teniendo el siguiente esquema a realizar.
Esquema del ADEVA
F de V

G. L.

TOTAL

15

TRATAMIENT

OS
ERROR EXP.

CV%=

CMEE
x

Tratamientos de la Investigacin
N de
Tratamientos Cobayo

R1

R2

R3

R4

s
T0

T1

5 Ug.

5 Ug.

5 Ug.

5 Ug.

Filgrasti

Filgrasti

Filgrasti

Filgrasti

17

T2

T3

10 Ug.

10 Ug.

10 Ug.

10 Ug.

Filgrasti

Filgrasti

Filgrasti

Filgrasti

m
15 Ug.

m
15 Ug.

m
15 Ug.

m
15 Ug.

Filgrasti

Filgrasti

Filgrasti

Filgrasti

4.3.4. MANEJO DEL ENSAYO

4.3.4.1.

Seleccin y Registro
Se seleccionar y registrar los animales en el CEASA para colocarlos
en las pozas designadas para cada tratamiento y el grupo testigo. Para la
seleccin de los animales se considerar los siguientes parmetros: la
lnea, edad (adultos 3 meses en adelante), sexo (macho), peso (600 a
800 gr. en adelante), estado reproductivo (sin contacto con hembras),
estado sanitario (sano).

4.3.4.2.

Aplicacin del filgrastim

El filgrastim se expandir con solucin salina ya que cada 1ml contiene

300 Ug de frmaco y de esta manera regular la dosis determinada para

cada tratamiento.
Se aplicar del primero al cuarto da del ensayo en los tres tratamientos
T1, T2, T3 con las dosis en estudio (5 Ug, 10 Ug, 15 Ug) a excepcin
del grupo control (T0). Cada aplicacin ser realizada a la misma hora

durante los cuatro das.

La aplicacin del frmaco se la realizar por va subcutnea en el
cobayo con jeringas de insulina (1ml).

4.3.4.3.

Anlisis de los componentes sanguneos

Se obtendrn muestras de sangre de cada cobayo del primero al cuarto
da del ensayo de los tres tratamientos y del grupo testigo; la muestra se
extraer de la vena yugular que es la de mayor calibre en sta especie
animal. Se obtendr una muestra de 2 ml. en los tubos con EDTA.
18

Las muestras sern debidamente identificadas y registradas para su

anlisis en el laboratorio de Agro Calidad, Tumbaco-Quito.

Se establecer la relacin de los parmetros hematolgicos del cobayo
con los de otro animal que tenga la mayor semejanza; ya que los
equipos de biometra hemtica se encuentran regulados para generar
datos de especies especficas.

4.3.4.4.

Obtencin de sangre perifrica

Se extraer la mayor cantidad de sangre perifrica de la vena yugular en
bolsas de con CPDA (Citrato Fosfato Dextrosa Adenina) a una relacin

de 1-2 ml de anticoagulante con 7-9 volmenes de sangre entera.

Las muestras obtenidas sern refrigeradas a una temperatura de 4 a 6 C
y por un tiempo de 4 horas y se mezclarn a volmenes iguales.

4.3.4.5.

Expansin y conteo de clulas madre hematopoyticas

La sangre obtenida ser mezclada con un expansor plasmtico
(Gelofusin); posterior se centrifugar de 2500 a 4000 revoluciones por

5 a 10 minutos.
El sedimento que se obtiene se recoger con micropipetas para realizar
tinciones vitales e identificar por medio de microscopa celular con la

cmara de Neubauer.
La identificacin de las clulas madre hematopoyticas se la realizar
mediante biometra hemtica con la concentracin de la frmula
sangunea (% leucocitos, glbulos rojos, plaquetas) y tincin Giemsa
(Morfologa) y tincin azul Tripn (Viabilidad).

4.3.4.1. UNIDADES EXPERIMENTALES

El estudio se realizar en 20 cobayos machos considerndose a cada una
como una unidad experimental.
4.3.4.2. DURACIN DE LA INVESTIGACION
La presente investigacin se realizar aproximadamente en 30 das

4.3.5.

UBICACIN GEOGRFICA
-

Provincia: Cotopaxi
Cantn: Latacunga
19

Sector: Salache
Lugar del ensayo: UA-CAREN (Unidad Acadmica de Ciencias
Agropecuarias y Recurso Naturales) / CEASA (Centro Experimental
Acadmico Salache)
Temperatura mxima: 20,9 C.
Temperatura mnimo: 8,7 C.
Temperatura promedio: 14,8 C.
Humedad relativa: 78%
Altitud 2725 msnm
Latitud: 00 59 57
Longitud: 78 3714
Fuente: Estacin Meteorolgica UTCCEYPSA-COTOPAXI/Diciembre2014

5.

PROPUESTA TENTATIVA DE ESTRUCTURA DE TESIS

Portada, la que contendr:
Nombre de la Universidad
Nombre de la Carrera
Especializacin
Ttulo de tesis
Denominacin de la obtencin del Ttulo
Nombre completo de los autores
Nombre completo del director de tesis
Ciudad, mes y ao de presentacin
Pgina de responsabilidad o autora.
Agradecimientos dedicatoria (opcional).
ndices de contenidos, cuadros, grficos, grficos, anexos.
Resumen ejecutivo (en espaol).
Abstract (ingls)

CAPITULO 1
Marco Terico
1.1. Clulas Madre
1.1.1 Definicin
1.1.2 Tipos de clulas madre
1.1.3 Clulas madre hematopoyticas
1.2. Filgrastim
1.2.1. Definicin
1.2.2. Uso en medicina
1.3. El Cuy
1.3.1. Generalidades
1.2.4.1. Origen
1.2.4.2. Hbitat
20

1.3.2. Clasificacin taxonmica del cuy

1.3.3. Descripcin morfolgica del cuy
a. Cabeza
b. Boca
c. Cuello
d. Cuerpo
e. Extremidades anteriores
f. Extremidades posteriores
1.3.4. Caractersticas productivas
1.3.5. Caractersticas reproductivas
1.3.6. Parmetros fisiolgicos y hematolgicos
1.3.7. Manejo sanitario
1.3.6.1. Rutina diaria
1.3.6.2. Rutina mensual
1.3.6.3. Rutina anual

CAPITULO 2

Resumen del captulo.

Materiales y mtodos.
Caractersticas del lugar del experimento.
Materiales.
Mtodos

CAPTULO 3.

Resumen del captulo.

Anlisis e interpretacin de resultados.
Conclusiones.
Recomendaciones.
Bibliografa.
Anexos

21

6.

MARCO ADMINISTRATIVO
A. Recursos Necesario
RECURSOS

Transporte
Alimentacin

UNIDAD
CANT. $ UNIT.
REQUERIMIENTOS

$TOTAL

Unidad

40

Raciones

60

2,5

150

Subtotal

190

Hojas

MATERIALES
Unidad
600

CD

Unidad

Impresiones

0,01

Unidad

600

0,1

60

Horas de Internet

Horas

50

0,75

37,50

Anillado

Unidad

1,5

7,5

Unidad Caja/50

Unidad

80

10

800

Guantes de Ltex
Biometra hemtica
Subtotal

930,50

QUIMICOS
Alcohol

Frasco

15

Filgrastim

Ampollas

25

100

Gelofusine

Frasco

27

27
22

Tincin Giemsa

Unidad/100 ml

5,80

5,80

Tincin Tripn

Unidad

10

10

Subtotal

157,80

INSUMOS
Cobayos
Jeringas de insulina
(1ml)

Unidad
Unidad/Caja
100
Unidad
1caja/100

20

100

11,30

4,5

4,50

Unidad

20

60

Unidad

80

0,30

24

Unidad

27

27

Paquete (100gr)

Cubre objetos

Caja

2,80

2,80

Porta objetos

Caja
Caja (10
microlitros)

3,50

3,50

10

10

Agujas
Bolsas de extraccin
de sangre
Tubos tapa lila con
EDTA
Cooler
Algodn

Micropipeta
Subtotal

245,10

EQUIPOS
Balanza
Cmara de
fotografas

Unidad

15

15.00

Unidad

300

300.00

Subtotal

315,00
1838.40
183,84

Imprevistos (10%)
TOTAL

2022,24

23

B. Cronograma de Actividades
ACTIVIDADES

Febrero
2015
Semanas
1

Marzo
2015
Semanas
4

Entrega y aprobacin del plan de tesis

Seleccin de los animales
Aplicacin de filgrastim T1 T2 T3
Biometra hemtica T0 - T1 T2 T3
Recolecta de sangre T1 T2 T3
Procesamiento de las muestras (separacin de CMHs)
Identificacin morfolgica y viabilidad
Elaboracin y correccin del Primer Captulo
Elaboracin y correccin del Segundo Captulo
Tabulacin de los datos obtenidos
Elaboracin y correccin del Tercer Captulo
Entrega del informe final del proyecto de tesis
Defensa del proyecto de tesis

24

Abri
2015
Seman
4

7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
7.1.

Libros, revistas cientficas y trabajos de investigacin.

1. Christopher M, Liu F, Hilton MJ, Long F, Link D. Blood (2009). Suppression of

CXCL12 production by bone marrow osteoblasts is a common and critical pathway
for cytokine-induced mobilization, (1331-1339).

2. Hakansson L, Ho glund M, Jo nsson UB, et al. Br J Haematol (1997). Effects of in

vivo administration of G-CSF on neutrophil and eosinophil adhesion, (603 611).

3. Jos J., David G. (2008). Clula madre hematopoytica y hematopoyesis. Vol. 1, (1)
4. Kondo M, Wagers AJ, Manz MG, Prohaska SS, Scherer DC, Beilhack GF, Shizuru
JA, Weissman IL. (2003). Biology of hematopoietic stem cells and progenitors:
implications for clinical application. Annu Rev Immunol, U.S.A, (759-806)

5. Morstyn G, Dexter TM, Foote MA. Inc (1998). Filgrastim (r-metHuG-CSF) in

Clinical Practice. New York. Marcel Dekker. Parte 1 Pg 41-60.
6. Nicola, NA; Metcalf, D; Matsumoto, M; Johnson, GR. J Biol Chem (1983).
Purification of a factor inducing differentiation in murine myelomonocytic leukemia
cells. Identification as granulocyte colony-stimulating factor, (901723).
7. Piacibello W, Gammaitoni L, Pignochino Y. (2005). Proliferative senescence in
hematopoietic stem cells during ex-vivo expansion. Folia histochemica et
cytobiologica, Italy, (197-202).
8. Aliaga, L. 1978. Crianza de cuyes. Edit. Departamento de publicaciones de la
Universidad Nacional del Centro de Per. Lima, Per. Pp. 24-27.
9. Cadena, S. 2000. Crianza casera y comercial de cuyes. Quito, Ecuador. Edit. Libros
epsiln. Pp. 38-99

25

10. Palomino, R. 2002. Crianza y comercializacin de cuyes. Lima, Per. Edit.

Ripalme. Pp. 14-126
11. Hans R. Schler (2007). The Potential of Stem Cells: An Inventory. En Nikolaus
Knoepffler, Dagmar Schipanski, and Stefan Lorenz Sorgner. Humanbiotechnology
as Social Challenge. Ashgate Publishing
12. Hsu YC, Fuchs E. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012 Jan 23;13(2):103-14.
13. Frisbie DD, Kisiday JD, Kawcak CE, Werpy NM, Mellwraith CW: Evaluation of
adipose-derived estromal vascular fraction or bone marrow-derived mesenchymals
stem cells for treatment of osteoarthritis. J Orthop Res 2009 27 (12): 1675-1680
14. Rosova I, Dao M, Capoccia B, Link D, Nolta JA: Hypoxic precondition results in
increased motility and improved therapeutic potentian of humanmesenchymal stam
cells. Stem Cells 2008, 26(8): 2173-2182
15. Berg L, Koch T, Heerkens T, Bessonov K, Thomsen P, Betts D: Condrogenic
Potential of mesenchymal stromalcells derived from equine bone marrow and
umbilical cord blood. VetComp Orthop Traumatol 2009, 22(5): 363-370

7.2.

Citas virtuales

a) Trasplante de clulas madre,

http://www.cancer.org/acs/groups/cid/documents/webcontent/002991-pdf.pdf
b) Clula madre, http://www.embrios.org/celulasmadre/medicina_reparadora.htm
c) Cavia porcellus, http://es.wikipedia.org/wiki/Cavia_porcellus
d) Medicina de la cobaya, http://www.vetjg.com/shared/php/page.php?
page=artic_peq_medicina_cobaya
e) Gelofusine, http://www.labbehrens.net/productos/anestesicos/gelofusine-detalle.htm
26

f)

Gelofusine,
http://www.farmaciasahumada.cl/fasaonline/fasa/MFT/PRODUCTO/P4066.HTM

g) Filgrastim, http://chemocare.com/es/chemotherapy/druginfo/filgrastim.aspx#.UzR50_Un4QY
h) Hematopyesis, http://es.wikipedia.org/wiki/Hematopoyesis
i) Biometra hemtica, http://www.buenastareas.com/ensayos/BiometriaHematica/476606.html
j) Bolsa de transfusin sangunea, http://www.vet.unicen.edu.ar/html/Areas/Cirugia
%20general/Documentos/16-Transfuciones.pdf
k) Clulas madre de sangre umbilical,
http://www.himfg.edu.mx/descargas/documentos/planeacion/guiasclinicasHIM/Tras
pCeProgenHematopoyxticas.pdf
l) http://jineteycaballo.blogspot.com/2013/06/ahora-podemos-salvar-caballos-conlas.html
m) http://www.discapacidadonline.com/terapia-celulas-madre-acv-desarrollanalemania.html
n) http://www.dgcs.unam.mx/gacetaweb/2013/130722/gaceta.pdf
o) http://www.fluvium.org/textos/vidahumana/vid115.htm
p) http://www.baires-salud.com.ar/celulas-madre-43/crean-celulas-madrepluripotenciales-a-partir-de-caballos-3767.html

q) http://www.veterinariargentina.com/revista/2012/07/anexos-fetales-una-fuentealternativa-de-celulas-madre-mesenquimales-para-la-medicina-veterinaria-equina/

r) http://argos.portalveterinaria.com/noticia.asp?ref=8744&cadena=C
%E9lulas_Madre_&como=1
s) http://argos.portalveterinaria.com/noticia.asp?ref=8842&cadena=C
%E9lulas_Madre_&como=1

27

t) http://argos.portalveterinaria.com/noticia.asp?ref=8655&cadena=C
%E9lulas_Madre_&como=1

8. ANEXOS Y GRFICOS
1.1.

Registro 1

28

1.2.

Registro 2

1.3.

Tabla 1

29

Tabla de Aplicacin de Filgastrim: T1, T2, T3

DIA 1

DIA 2

DIA 3

DIA 4

T0

0 ug.

0 ug.

0 ug.

0 ug.

T1

5 ug.

5 ug.

5 ug.

5 ug.

T2

10 ug.

10 ug.

10 ug.

10 ug.

T3

15 ug.

15 ug.

15 ug.

1.4.

15 g.

Tabla 2

TRATAMIENTO

LEUCOCITOS

ERITROCITOS

PLAQUETAS

HEMATOCRITO

Biometra hemtica

Biometra hemtica

Biometra hemtica

Biometra hemtica

Miles y millones/ml de

Miles y millones/ml
de sangre

Miles y millones/ml
de sangre

sangre

Miles y millones/ml
de sangre

T0
T1
T2
T3
Total

Tabla de Resultados de Biometra Hemtica: Testigo, T1, T2, T3

30

Total