Trabajo Prctico N 1

Microscopa, tinciones simples y diferenciales

Alumnos: Polizzotto Axel, Karpinski Ivn, Vera Mara

Profesores: Amor Silvia, Bentancor Leticia
Materia: Microbiologa General; comisin B
Fecha: 10 de octubre de 2013

Resumen
En este trabajo prctico se prepararon extendidos de bacterias con el fin de poder
visualizarlas en el microscopio. Para esto se tieron de diferentes maneras, ya sea con tinciones
simples o diferenciales.
Primero se realiz una tincin simple, utilizando diferentes bacterias, para examinar su
morfologa. Luego, se realizaron tinciones de Gram y de esporas.
Las tinciones simples fueron exitosas, mientras que las de Gram, una no se pudo observar
correctamente, pudindose deber a factores como decoloracin prolongada. La tincin de esporas
fue exitosa, ya que se pudo observar esporas teidas.

Introduccin
En este trabajo se prepararon las muestras realizando extendidos de las mismas sobre los
portaobjetos, para luego ser visualizados en un microscopio de campo claro como el siguiente:

Sus Partes son:

A- Oculares
B- Objetivos
C- Condensador
D- Platina
E- Tornillos macro y micromtrico
F- Fuente lumnica
Tincin Simple
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En este tipo de coloracin el extendido bacteriano se colorea con un nico reactivo. Por
medio de la coloracin simple se puede visualizar la morfologa y disposicin de las clulas
bacterianas. Los colorantes ms utilizados son: azul de metileno, cristal violeta y carbol fucsina.
Tincin de Gram
La coloracin diferencial ms importante utilizada en bacteriologa es la tincin de Gram,
llamada as en honor al investigador que la desarroll. Esta coloracin divide a las bacterias en dos
grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Esta clasificacin es de importancia para la
diferenciacin e identificacin de las bacterias.
La coloracin de Gram utiliza cuatro reactivos:
_Colorante primario (Cristal Violeta): es un colorante bsico que tie a las clulas de color violeta.
_Mordiente: Ioduro de Gram (Lugol): Este reactivo forma un complejo insoluble cuando se une al
colorante primario.
_Agente decolorante (alcohol-acetona): Este reactivo sirve tanto como solvente de lpidos y como
agente deshidratante.
_Contracolorante (Safranina): Este es el reactivo final, se utiliza para colorear de rojo o rosado a
aquellas clulas que fueron previamente decoloradas.
nicamente las Gram negativas podrn tomar ste color, en tanto que las Gram positivas
retendrn el color prpura del colorante primario.

Tincin de esporas
Para teir esporas, se utiliza esta tcnica, la cual nicamente tie esporas.
_Colorante primario (Verde de Malaquita): Las cubiertas de las esporas no aceptan fcilmente el
colorante primario. Para que ste pueda penetrar, es necesario aplicar calor. Luego de cubrir con el
colorante primario, se debe calentar el extendido, tanto las clulas vegetativas como las esporas
aparecern de color verde.
_Agente decolorante (Agua): Una vez que las esporas aceptan el colorante primario, no podrn ser
decoloradas con agua y por lo tanto las esporas permanecern verdes. Por otro lado, el colorante no
muestra una alta afinidad por los componentes de las clulas vegetativas, as que el agua lo remueve
y el resto de las clulas quedarn incoloras.
_Contracolorante (Safranina): Este colorante se utiliza como contraste para teir las clulas
vegetativas incoloras. stas absorben este colorante y aparecern rojas. Las esporas retendrn el
color verde del colorante primario.

Materiales y Mtodos
Para la preparacin de un extendido:
Como se parten de muestras slidas primero se debe colocar una gota de agua sobre cada
portaobjetos que se utiliza, y luego se toma la muestra correspondiente a cada portaobjeto con un
ansa (tocando apenas de la muestra una colonia aislada) y se la coloca sobre el portaobjetos. Se
esparce la muestra sobre el portaobjetos, para que luego se observe mejor en el microscopio. Se deja
secar la muestra al lado de un mechero, y se procede a fijar la muestra, pasndola sobre la llama del
mechero tres veces de manera rpida.
Tincin simple:

Se prepararon extendidos y luego se tieron las siguientes muestras:

Escherichia coli con safranina.
Pseudomona aeruginosa con cristal violeta.
Staphylococcus aureus con azul de metileno.
Bacillus cereus con fucsina.

Para cada tincin se procedi de manera similar, preparando el extendido de cada bacteria y
luego colocndole el colorante y dejarlo reposar durante 3 minutos, luego se lav con agua y se dej
secar junto a la llama de un mechero. Posteriormente se observaron en el microscopio cada muestra.
Tincin de Gram:

Se prepararon extendidos de las siguientes muestras:

Escherichia coli mas Staphylococcus aureus.
Bacillus cereus mas Pseudomona aeruginosa.

Para la preparacin de los extendidos, se procedi de igual manera que la antes mencionada,
con la diferencia que para esta tincin se agregaron dos tipos de bacteria en vez de una para ver las
diferencias entre ellas. Luego se secaron y se fijaron las bacterias al portaobjetos.
Para ambos preparados, se procedi de la misma manera: Se agreg el colorante primario,
cristal violeta, y se dej reposar durante 3 minutos, se procedi a lavar y a agregarle el lugol, que
tambin se lo dejo reposar durante 3 minutos. Luego se agreg el agente decolorante, alcoholacetona, y se lav con agua. Por ltimo, se agreg el contracolorante, safranina, durante 3 minutos
tambin, y se lav. Se dej secar cerca de una llama de mechero.
Se observaron los dos preparados en el microscopio.
Tincin para esporas:
Se prepar un extendido de Bacillus cereus, se sec al aire y se fij por calor. Luego se
cubri el extendido con verde de malaquita y se incub en calor (sobre una olla con agua hirviendo)
durante 15 minutos. Se debe evitar que el colorante se evapore, para esto, se fue agregando
colorante cada vez que se notaba que se secaba.
Pasados los 15 minutos, se enfri el extendido, y se lav cuidadosamente con agua.
Se cubri el extendido con safranina durante 3 minutos. Se lav cuidadosamente con agua,
se sec al aire y se examin al microscopio.
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Resultados
Se obtuvieron los siguientes resultados de las tinciones simples:

Escherichia coli teido con safranina: bacilos de color rosa.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Safranina).

Pseudomona aeruginosa teido con cristal violeta: bacilos de color violeta.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Cristal
violeta).

Staphylococcus aureus teido con azul de metileno: cocos de color azul de metilo.
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Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Azul de
metilo).

Bacillus cereus teido con fucsina: bacilos de color fucsia.

Imgenes con microscopio ptico: a la izquierda con objetivo 10x y a la derecha con objetivo 100x (Colorante Fucsina).

En el caso de las Pseudomonas se podan apreciar como cocos con el objetivo de 10x, pero
al utilizar el objetivo de 100x, se pudo observar su morfologa correcta. Con respecto al
Staphylococcus, como se utiliz como colorante azul de metileno, ste provoc que su visualizacin
sea un poco borrosa. Las dos coloraciones restantes fueron realizadas sin problemas y se pudo
visualizar su morfologa sin alteraciones.
Se obtuvieron los siguientes resultados para las tinciones de Gram:

_Escherichia coli mas Staphylococcus aureus: Cuando se observ la muestra con el objetivo de
100x, se observaron ambas bacterias teidas de color rosa, lo cual indica un posible error al
momento de la decoloracin, ya que se debera haber observado al Staphylococcus de color violeta
por ser una bacteria Gram positiva.
_Bacillus cereus mas Pseudomona aeruginosa: Al observarse con el objetivo de 100x se pudo
visualizar las dos coloraciones, resultando en una coloracin exitosa, ya que los Bacillus se tieron
de violeta mientras que las Pseudomonas fueron teidas de rosa.
Se obtuvo el siguiente resultado en la tincin de esporas:
_Bacillus cereus: Se pudieron visualizar correctamente las esporas teidas con de verde, y al resto
de las bacterias de color rosa, indicando una coloracin exitosa.

Conclusin
Las tinciones simples son tiles para identificar morfologas de las bacterias, pero no su
movilidad, ya que al fijar la bacteria al portaobjeto, sta pierde su movilidad.
Las tinciones diferenciales son tiles para observar y clasificar a las bacterias, como la
tincin de Gram, la cual separa entre Gram positiva y negativa. Pero se debe tener cuidado cuando
se realiza, ya que si no, se pueden obtener falsos positivos o negativos, como lo sucedido en este
trabajo, que se obtuvo Staphylococcus de color rosa, produciendo as un falso negativo. Por este
motivo, se debe realizar con cuidado las coloraciones y las decoloraciones.

Bibliografa

Gua de Trabajos Prcticos N 1 y 2, Microscopa, preparacin de extendidos, coloraciones

simples y diferenciales.
Brock; Biologa de los Microorganismos, 12edicin; Editorial: Pearson Education.