ISTRAIVANJE

MIKROORGANIZAMA
MIKROSKOPIMA

Modul: Bioloke osnove plodnosti tla

Mikroskop (gr. mikros=malen, sitan; skopeo=

gledam) je optiki instrument koji se upotrbljava za
promatranje objekata, kao to su mikroorganimi, koji su
presitni da bi se mogli vidjeti golim okom - to je osnova
primjene mikroskopa za stvaranje slike mikrobnog
svijeta.
razvoj:
1600. god. Zacharias i Hans Janssen konstruirali prvi
mikroskop (kombinacija dviju staklenih lea)

1625.god. Giovanni Faber - daje naziv mikroskopu

Prva mikroskopska istraivanja..

Robert
Hooke primitivnim
mikroskopom
otkrio ive stanice
(nazvao ih je male
kutije ili
stanice)
1665.god.

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)

1674.god. Antony van Leeuwenhoek

pomou jednostavnog mikroskopa

(bikonveksna lea umetnuta izmeu
mjedenih ploa) otkrio nevidljive
oblike ivota - najsitnije ivotinje
tj. mikroorganizme

SAMO

JEDNA LEA

Danas
Mikroskopi koji se danas koriste sastavljeni su od niza optikih
i mehanikih djelova, a u osnovi razlikujmo dva tipa:
svjetlosne i elektronske mikroskope.
Svjetlosni ili optiki mikroskopi:
mikroskop s svjetlim vidnim poljem
mikroskop s tamnim vidnim poljem
fluorescentni mikroskop
fazno-kontrastni mikroskop

Elektronski mikroskop
transmisijski mikroskop
pretrani elektronski mikroskop

Grafiki
prikaz tipova
uzoraka to
se istrauju
esto
upotrebljavan
im
mikroskopim
au
mikrobiologiji
i srodnim
podrujima.
Prikazan je i
djelotvoran
domet tih
instrumenata.

Sloeni svjetlosni mikroskop

-

sastoji se najmanje dvaju sustava lea: objektiva koji

poveava uzorak i okulara koji poveava sliku to je dobivena
od objektiva.
- kao izvor svjetlosti u sloenom mikroskopu se upotrebljava
vidljivi dio spektra
- upotrbljava se za istraivanje vrlo sitnih objekata, a i njihove
fine detalje ili ultrastrukture
- ukupno poveanje mikroskopa dobiva se tako da se pomnoi
poveanje objektiva s poveanjem okulara
Mehaniki dijelovi mikroskopa:
postolje (podloga)
stativ (ruica)
tubus s revolverom
stoli mikroskopa
makrovijak i mikrovijak
ureaj za osvjetljavanje

Sloeni svjetlosni mikroskop

Optiki dijelovi - slue za uveavanje i osvjetljavanje predmeta

koji se promatraju
1. OKULAR
- kratka cijev koja sadri dvije lee (gornja ili okularna i donja ili
sabirna lea)
- nalazi se na gornjem kraju tubusa
- poveanja okulara su: 1x, 2x, 5x, 10x, 15x

2. OBJEKTIV
- najvaniji optiki dio mikroskopa
- lee objektiva slue za skupljanje i koncentriranje zraka svjetlosti
koje dolaze iz preparata i za poveavanje stvorene slike predmeta
- MO RAZDVAJANJA - najvanija osobina objektiva -sposobnost
lee da istakne fine detalje i strukturu
- veina mikroskopa ima 3 objektiva s razliitim poveanjima:
malo poveanje (10x)
srednje poveanje (40x)
veliko poveanje (100x)

Prema nainu promatranja preparata razlikujemo 2 sistema

objektiva:
a) SUHI sistem objektiva - za promatranje gljiva, algi, protozoa
- izmeu frontalne lee i preparata nalazi se zrak
- zrak nema isti indeks refrakcije kao staklo te dolazi
do prelamanja svjetlosnih zraka
- malo i srednje poveanje

b) ULJNO IMERZIONI (MOKRI) sistem objektiva - za

promatranje bakterija, njihovih oblika i rasporeda stanica
- izmeu preparata i frontalne lee nalazi se imerzijska
tekuina (anisol, cedrovo ulje i sl.) kojoj je
indeks refrakcije blizu indeksa refrakcije stakla
- Izmeu preparata i frontalne lee nalazi se imerziona
tekuina koja ima skoro isti indeks loma svjetlosti
kao staklo
- veliko poveanje

Objektiv se unosi u kapljicu imerzione tekuine

prostor izmeu dviju staklenih povrina se ujednai u
optikom smislu. U objektiv moe ui vie korisnih
svjetlosnih zraka i time dobijemo bolju sliku.
Kvalitet slike u mikroskopu ovisi o koliini
svjetlosnih zraka koje prolazei kroz preparat ulaze u
objektiv. Svjetlosni zraci trpe prelamanje zbog
prelaska iz gue ( staklo ) u rjeu sredinu ( zrak )
to se dogaa kod suhog sistema objektiva.
Upotrebom imerzione tekuine , koja se stavlja u
vidu jedne kapljice na pripremljeni preparat i u koju
se zaroni frontalna lea , stvara se optiki homogena
sredina , eliminira se prelamanje i u objektiv ulazi
najvea koliina korisnih svjetlosnih zraka.
Prostor izmeu preparata i objektiva ispuni se npr.
anisolom svjetlosni zraci ulaze u frontalnu leu
objektiva ne mijenjajui pravac to omoguuje
bolju vidljivost promatranog preparata.

3. KONDENZOR I IRIS-ZASLON
- kondenzor se nalazi ispod stolia mikroskopa izmeu izvora
svjetla i promatranog preparata
- sastoji se od sustava lea koje sabiru svjetlosne zrake i
usmjeravaju ih prema promatranom preparatu
- Podizanjem ili sputanjem kondenzor regulira promjer snopa
svjetlosnih zraka tj. jae ili slabije osvjetljava preparat
( sputanjem se smanjuje svjetlosni snop ).
- iris-zaslon slui za kontrolu intenziteta svjetla tj. za reguliranje
koliine svjetla koja ulazi u kondenzor

Mikroskop s svjetlim i tamnim vidnim

poljem
oko

oko
Lea okulara

Lea objektiva

Dio zraka svjetla koje

prolaze kroz uzorak
ulaze u lee objektiva,
a dio zraka se gubi

UZORAK
Lea kondenzora

Disk za tamno polje

svjetlo
svjetlo

Tamni objekti su vidljivi u

odnosu na svjetlu pozadinu

svjetlo

Svijetli objekti su vidljivi

u odnosu na tamno polje

FAZNO KONTRASNI MIKROSKOP

Lea okulara
Difrakcijska ploa
Lea objektiva


POJAAVA DIFRAKCIJU
SVIJETLA KOJE PROLAZI
KROZ UZORAK
Koristi se poseban
kondenzor s prstenastom
dijafragmom

Nedifraktivno svjetlo
Difraktivno svjetlo
Lea kondenzora
Prstenasta dijafragma
svjetlo

Fazno -kontrasni
Figure 3.4c

FLUORESCENTNI MIKROSKOP

upotrebljava se UV svijetlo

fluorescentne tvari
adsorbiraju UV svijetlo i
emitiraju vidljivo svijetlo

stanice se mogu bojati

fluorescentnim bojama

Figure 3.6b

ELEKTRONSKI MIKROSKOP


kao izvor svjetlosti koriste se elektronski

zraci ija je valna duina puno puta kraa
od valne duine vidljivog dijela spektra to
daje bolju rezoluciju.
Poveanje ovog mikroskopa je 100 000x i
vie

TRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI
MIKROSKOP (TEM)


ultra tanke sekcije uzorka

Prednost ovog mikroskopa je u velikoj moi razdvajanja

to je pogodno za istraivanje razliitih slojeva u
preparatu. Nepovoljno je to elektroni imaju ogranienu
snagu prodiranja te se samo vrlo tanak sloj preparata
moe djelotvorno istraivati.
Poveanje 10,000-100,000x

TRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI MIKROSKOP

(TEM)
snop elektrona iz elektronskog topa
fokusiran je na malu povrinu posebno
prepariranog , ultratankog prereza
uzorka. Uz pomo elektromagnetskih
lea kondenzora kontrolira se
osvjetljenost, fokusiranje i poveanje.
Umjesto nanoenja preparata na
predmetnicu, kao kod svjetlosnih
mikroskopa, u elektronskom se
mikroskopu preparat nanosi na bakrenu
mreicu. Snop elektrona prolazi kroz
preparat, a potom kroz
elektromagnetske lee objektiva i slika
se poveava


Figure 3.8a

SKENIRAJUI ELEKTRONSKI MIKROSKOP

(SEM)




snop elektrona skenira povrinu cjelokupnog uzorka.

elektroni emitriani od uzorka stvaraju sliku.
omoguuje dobivanje izrazito trodimenzionalne slike
preparata.

SKENIRAJUI ELEKTRONSKI
MIKROSKOP (SEM)
1000-10,000 mo poveanja
 Njegovom primjenom izbjegnut je problem rezanja
preparata (priprava ultratankih prereza ). Primarni
elektronski snop udara po povrini preparata, a
sekundarni snop elektrona, proizveden pomou
skupljaa elektrona, upotrijebljen je za tvorbu
slike na zaslonu ili na fotografskoj ploi
 Pretrani elektronski mikroskop
upotrbljava se u istraivanju povrine
neoteenih stanica i virusa.


Figure 3.8b

Priprava uzorka za mikroskopiranje

svjetlosnim mikroskopom
Mikroskopski preparati slue nam za promatranje morfolokih
karakteristika mikroorganizama. Dijelimo ih u dvije kategorije:
1. NEOBOJENI (NATIVNI) PREPARATI
2. OBOJENI PREPARATI

1. NEBOJENI (NATIVNI) PREPARATI

- koriste se za mikroskopiranje ivih mikroorganizama gdje se
jasno vide vei mikroorganizmi (kvasci, plijesni, alge, vee
bakterije). Mikroskopiraju se pod poveanjem od 400x
Vrste nebojenih preparata:
a) vlani preparati
b) visea kap - za odreivanje pokretljivosti bakterijskih
stanica

Na predmetno stkalce stavi se kap vode. Uzimanje

uzoraka u stavljanje u kapljicu vode na
predmetnom stakalcu. Pokrovnicom se poklopi
suspenzija i mikroskopira.

Priprema preparata visea kap

2. OBOJENI PREPARATI
-veina mikroorganizama je bezbojna, a da bismo ih mogli
istraivati svjetlosnim mikroskopom, moramo ih obojati
Obojeni preparati omoguuju:
- bolje i detaljnije izuavanje mikroorganizama
- bolje uoavanje pojedinih struktura (spore, st. stjenka)
- razlikovanje razliitih tipova mikroorganizama

MIKROBIOLOKE BOJE
Bojila za bojanje mikrobnih stanica najee su u obliku soli, u
kojima je jedan od iona nosilac boje kromogeni dio.
Sposobnost bojila da se vee na makromolekulske komponente
stanice ovisi o elektrinom naboju na kromogenom dijelu, a i o
staninim komponentama koje se boje.
a) KISELA (anionska) bojila imaju negativan naboj i afinitet
prema pozitivno nabijenim dijelovima stanice
- kiseli fuksin (crveno), eozin (crveno), eritrozin (crveno),
fluorescein (uto), nigrozin (crno)

b) BAZINA (kationska) bojila imaju pozitivan naboj te afinitet

prema negativno nabijenim dijelovima stanice
- metilensko modrilo (plava), gentiana violet (ljubiasta), karbol
fuksin (crveno)

Vrste postupaka bojenja:

-JEDNOSTAVNO bojenje koristi se jedno bojilo, slui za
vizualizaciju morfolokog oblika
-DIFERENCIJALNO bojanje upotreba dvaju kontrasnih bojila
- izdvajanje u skupine (bojanje po Gramu)
- vizualizacija struktura (bojanje ahura, spora, bieva,
jezgre)

JEDNOSTAVNO BOJANJE
postupak:
1. Priprema preparata za bojanje
- odmaivanje stakalca
- nanoenje kapljice vode
- nanoenje mikrobne kulture u
kap vode
- ezom se nanesena kap
razmae po povrini
predmetnice
- suenje na zraku
- fiksiranje
2. Bojanje s jednom
mikrobiolokom bojom
3. Ispiranje vodom nakon bojanja
4. Suenje pomou upijajueg
papira
5. Mikroskopiramje uz kap anisola
i
najvee poveanje mikroskopa

Postupak bojenja po Gramu

Bojanje bakterijskih endospora po

Schaeffer Fultonovoj
metodi

Bakterijske endospore

Bojanje bakterijskih ahura (kapsula)

Hranjive podloge za uzgoj

mikroorganizama
Hranjive podloge slue nam za uzgoj mikroorganizama u
laboratorijskim uvjetima. Svojim sastavom i
karakteristikama osiguravaju mikroorganizmima onakve
uvjete ivota koje bi oni imali u prirodnim sredinama.

Dijelimo ih prema:
a) nainu primjene
b) kemijskom sastavu
C) konzistenciji

a)Hranjive podloge prema nainu primjene dijelimo:

obine podloge - slue za izolaciju i uzgoj veeg broja
mikroorganizama
specijalne podloge - slue za uzgoj tono odreene grupe
mikroorganizama

Za utvrivanje specifinosti koristimo selektivne i

diferencijalne podloge.
SELEKTIVNE hranjive podloge imaju takav sastav koji potie
rast eljenih vrsta, a onemoguava rast neeljenih
mikroorganizama. Njihova seletivnost se postie dodatkom neke
inhibicijske tvari.
DIFERENCIJALNE hranjive podloge omoguavaju lake
razlikovanje kolonija eljenog mikroorganizma od drugih kolonija
koje rastu na istoj hranjivoj podlozi.

Razliiti oblici kolonija

na diferencijalnim
podlogama

b)Hranjive podloge prema kemijskom sastavu dijelimo na:

PRIRODNE hranjive podloge - toan kemijski sastav takvih
podloga nije poznat, a prireuju se od produkata biljnog
(plodovi, sokovi) ili ivotinjskog (mlijeko, krvni serum, u)
porijekla
UMJETNE (SINTETSKE) hranjive podloge - pripremaju se iz
istih kemijskih spojeva po odreenim recepturama ije
komponente mogu biti organskog ili anorganskog sastava
KOMPLEKSNE hranjive podloge - slue za uzgoj veine
heterotrofnih gljiva i bakterija. Kemijski sastav takvih
podlogavarira i djelomino je poznat.Komponente su im
kvasni i mesni ekstrakt.
Svaka hranjiva podloga mora osiguravati mikroorganizmima
izvor ugljika, duika, fosfora, aminokiselina, vitamina.

c)Hranjive podloge prema konzistenciji dijelimo:

TEKUE, KRUTE (VRSTE) I POLUTEKUE.
vrstoa podloge postie se dodavanjem agara tekuim
hranjivim podlogama.

Agar je heteropolisaharid koji se dobiva iz morsih algi roda

Gelidium. Zagrijavanjem agara (koji je u obliku praka) na
temperaturu 95-98C on se otopi u tekuoj podlozi, a prilikom
hlaenja kod temp. 40-45C uzrokuje skruivanje hranjive
podloge. Koncentracija agara u vrstim hranjivim podlogama je
1-2%, a u poluvrstim podlogama 0,1-0,5%.

Bez obzira na pripadnost pojedinoj skupini nabrojenih hranjivih

podloga, svaki hranjivi supstrat mora imati:

sve hranjive sastojke koji su potrebni za rast i

razmnoavanje
dovoljnu koliinu vode
povoljanu pH vrijednost
supstrat mora biti sterilan
supstrat mora biti prozraan

STERILIZACIJA
Sterilizacija podrazumijeva svaki proces, kemijski ili fiziki,
pomou kojeg se ubijaju svi oblici ivota, osobito
mikroorganizmi.

Prema sredstvu kojim se sterilizacija provodi razlikujemo:

1) STERILIZACIJA TOPLINOM
2) STERILIZACIJA FILTRACIJOM
3) STERILIZACIJA ZRAENJEM
4) STERILIZACIJA ULTRAZVUKOM

Sterilizacija kemijskim putem vri se pomou nekih

kemijskih agensa (dezinficijensi, antiseptici) koji suzbijaju
rast mikroorganizama (npr.bakteriostatici) ili ubijaju
mikroorganizme i endospore.
- alkoholi, kiseline, halogeni, fenoli, soli tekih metala,
oksidirajui agensi

1) STERILIZACIJA TOPLINOM
-

najei oblik sterilizacije koji je i najsigurniji i

najprikladniji
u obzir dolaze visoke i niske temperature, ali sigurnije su
samo visoke temperature

A) SUHA STERILIZACIJA
-

1) sterilizacija plamenom
za steilizaciju mikrobiolokog pribora od metala (arenje
eze), stakla (otvori epruveta radi spreavanja
kontaminacije hranjivepodloge ili kulture mikroorganizama)
te opaljivanje radnih povrina

2) sterilizacija vruim suhim zrakom

-sterilizacija se izvodi pri temperaturi 160C do 180C uz trajanje
1-2 sataili pri temp. 200 C ili 250C ako se sumnja na
kontaminaciju bakterijskim sporama
- vri se u suhom sterilizatoru (Pasteurova pe)
-primjena: sterilizacija metalnog i staklenog laboratorijskog pribora
- neprikldan za sterilizaciju tekuina koje isparavaju, predmeta od
gume ili slinih materijala koji se tale ili zapale na visokoj temp.

Suhi sterilizator
(Pasteurova pei)

B) Vlana sterilizacija
1)sterilizacija kuhanjem (prokuhavanje u vruoj vodi)
- najjednostavniji oblik sterilizacije
- rijetko se primjenjuje
- spore nekih bakterija mogu preivjeti

2) sterilizacija vodenom parom

a) sterilizacija strujeom vodenom parom - odvija se u
Kochovu loncu
- primjena: sterilizacija hranjivih podloga s tvarima koje
ne podnose temperature iznad 100C. U njemu se
mogu sterilizirati svi materijali koji se mogu navlaiti
i na koje zasiena vodena para ne djeluje tetno.
- trajanje sterilizacije: 30 60 min.

-jednokratna sterilizacija u Kochovu loncu ne ubija spore

nekih vrsta bakterija pa se u tom sluaju primjenjuje
viekratna sterilizacija koja se naziva
TINDALIZACIJA ili FRAKCIONA STERILIZACIJA

Materijal se nekoliko puta stavlja na sterilizaciju - npr. Hranjive

podloge ili neki drugi materijali se nakon sterilizacije ostave na
sobnoj temperaturi ili u termostatu da bi spore mogle isklijati u
vegetativni oblik, a nakon toga sterilizacija se ponovi (zbog
sigurnosti i nekoliko puta).
Frakcionom sterilizacijom ili tindalizacijom uspjeno se
steriliziraju materijali koji sadre spore aerobnih bakterija.

b) sterilizacija strujeom vodenom parom pod tlakom -

odvija se u autoklavu
-najsigurniji nain sterilizacije toplinom
-unitavaju se sve vrste mikroorganizama (vegetativni oblici,spore)
-sterilizacija se provodi u autoklavu
-trajanje sterilizacije: 15 min do 1 sat pri 1-2 atm
-primjena: za sterilizaciju veine hranjivih podloga i kemikalija
te predmeta od gume, porculana i obinog stakla
c) Pasterizacija
-djelotvoran nain sterilizacije za veinu mezofilnih
nesporulirajuih mo. Koji se nalaze u mlijeku
- primjena: za sterilizaciju mlijeka i drugih napitaka
- pasterizacija nije sterilizacija, ali unitava patogene i smanjuje
kvarenje reducirajui razinu nepatogenih mikroorganizama
kvarenja (ne ubija spore i termorezistentne mikroorganizme)
-Izvodi se na temperaturama niim od 100C
- 2 naina pasterizacije: niska pasterizacija 30 min na 63C ili
visoka, kratkotrajna pasterizacija 15 sec na 72C nakon ega
slijedi hlaenje
- koristi se i sterilizacija mlijeka visokom temp. (140-150C) 1-3 sec

Slika: Kochov lonac

autoklav

2. STERILIZACIJA FILTRACIJOM
primjena: za sterilizaciju tekuina koje ne podnose sterilizaciju
nekim drugim nainom jer bi im se izmjenila fizikalna i kemijska
svojstva
postupak: tekuine se filtriraju pod tlakom kroz filtre poznate
veliine pora. Filter zadri mikroorganizme, a propusti tekuinu i u
njoj topljive sastojke koje elimo sauvati
vrste filtra: Chamberlandovi (porculanski) filteri
Berkefeldovi filteri
Seitzovi azbestni filteri
Membranski ili ultrafilteri

3. STERILIZACIJA ZRAENJEM
a) ultraljubiasto zraenje (UV)
-

zrake valnih duljina 240-280 nm, oteuju i zaustavljaju

sintezu mikrobne DNA
Primjena: za sterilizaciju zraka u laboratoriju, operacijskim
dvoranama koriste se UV lampe (kvarcne lampe). Djeluju
samo na one mikroorganizme koji su im izravno izloeni

b) ionizacijsko zraenje
-

elektromagnetske x-zrake i gama zrake, infracrvene zrake

jaeg mikrobicidnog djelovanja od UV-zraka
Primjena: sterilizacija kirurkog pribora, laboratorijskog
plastinog posua
infracrvene zrake zagrijavaju materijal do temperature pri
kojoj dolazi do koagulacije proteina
primjena: medicina, prehrambena i farmaceutska industrija

4. STERILIZACIJA ULTRAZVUKOM
-zvuni valovi visoke frekvencije unitavaju mikroorganizme
-Uglavnom se koristi za razbijanje stanica i oslobaanje
intracelularnih enzima, rjee za sterilizaciju

METODE ZA IZOLACIJU ISTIH

KULTURA
IZOLACIJA je znaajna mikrobioloka tehnika kojom se
izdvajaju iste kulture mikroorganizama iz mjeovite populacije
Za prouavanje morfolokih i fiziolokih osobina
mikroorganizama, kao i njihove identifikacije, potrebno je imati
njihove iste kulture
Pod istom kulturom se podrazumijeva kultura mikroorganizama
koje sadre samo jedan tip stanica.

Za dobivanje istih kultura koriste se slijedee metode:

METODA RAZRJEENJA
METODA ISCRPLJENJA

Metoda razrjeenja


slui za izolaciju i odreivanje broja

mikroorganizama

POSTUPAK:
-u seriju od npr. 6 epruveta odpipetira se 9 ml vode
u prvu se odvae 1 g tla ili nekog drugog materijala koji se
istrauje
-sterilnom pipetom se odpipetira 1ml iz prve epruvete i
prenese u slijedeu, isti postupak ponovimo do kraja (do
este epruvete) mijenjajui pipete pri promjeni razrjeenja
na taj nain dobivamo eljenu seriju razrjeenja (10-1 do
10-6)
-kad elimo odrediti broj mikroorganizama uzimamo po 1ml
suspenzije iz posljednja tri razrjeenja (10-6, 10-5, 10-4) te
stavljamo u Petrijevu zdjelicu, a potom se ulijeva hranjiva
podloga. Postupak se vri u 3 ponavljanja

-Petrijevke se stavljaju u termostat na inkubaciju

- na petrijevkama izraste odreen broj kolonija
-nakon inkubacije odreuje se prosjean broj mikroorganizama
ispitivanog uzorka
- prebroje se kolonije u sve 3 repeticije i izrauna se njihova
srednja vrijednost
-broj ivih stanica datog uzorka odreuje se mnoenjem broja
izbrojanih kolonija s faktorom razrjeenja (faktor razrjeenja je
reciprona vrijednost eksponenta razrjeenja). Dobivena
vrijednost oznaava se kao CFU (colony forming unites) tj.
jedinice koje tvore kolonije.
Broj CFU jednak je broju ivih stanica samo kada jedna kolonija
Nastaje od jedne stanice.
CFU se izraunava prema formuli:

broj izraslih kolonija

CFU = ------------------------------volumen uzorka

x reciprona vrijednost razrjeenja

Metoda razrjeenja

Metoda razrijeenja



Daje nam brojnost ivih, aerobinh mikroorganizama

Nije ukljueno
 Obligatni Anaerobi
 Mikroaerofili
Izraava se
 Colony Forming Unit (CFU)/gramu ili ml
 NE kao ukupne bakterije (mikroorganizmi)

Organienja metode razrijeenja








Mogu se prebrojati samo aerobni mikroorganizmi

nije poznata njihova vrsta
podloge nisu univerzalne
ljudska greka
ponekad je teko razlikovati estice hrane i kolonije
kolonije mogu biti premale da se vide

Metoda iscrpljenja


brz i kvalitetan postupak koji slui samo za izolaciju

postupak ponekad zahtijeva prethodnu pripravu

razrjeenja suspenzije mikroorganizama iz koje
elimo izolirati kulturu
 POSTUPAK:
- Na prethodno izliven i ohlaen hranjivi supstrat u
Petrijevoj zdjelici stavimo kap mikrobiolokog
materijala.
- Materijal razvlaimo po povrini vrste podloge
pomou Pasteurove vilice ili eze, te bez ponovnog
uzimanja materijala razmaemo po drugoj i treoj
Petrijevoj zdjelici. Na taj nain smanjujemo brojnost
mikroorganizama i na treoj Petrijevoj zdjelici nalazi
se najmanji broj kolonija.


Slika:
Metoda
iscrpljenja

IDENTIFIKACIJA BAKTERIJA
- identifikacija je praktian dio taksonomije koji svrstava
izolat u odreene taksone
- do danas je klasificirano i identificirano vie od 2000 vrsta
bakterija
-Fischer i Muller napravili prvu klasifikaciju i sistematizaciju
-1923. izalo prvo izdanje Bergeyeva prirunika za
bakterija. Tokom godina zabiljeena su sva vanija dostignua,
zabiljeene nove vrste, kriteriji klasifikacije i poboljane sheme
klasifikacije. Danas prirunik sadri 4 podvolumena, a svaki od
njih prikazuje specifine skupine bakterija

Karakteristike koje se koriste u klasifikaciji i identifikaciji

mikroorganizama:
1. MORFOLOKE KARAKTERISTIKE KOLONIJA - svaka vrsta
bakterija ima karakteristian tip kolonija na hranjivoj podlozi
2. MORFOLOKE KARAKTERISTIKE BAKTERIJA- oblik stanice,
veliina, ultrastrukture, bojanje po Gramu, pokretljivost,
raspored cilija i flagela, oblik i smjetaj edospora, stanine
inkluzije
3. FIZIOLOKE I BIOKEMIJSKE KARAKTERISTIKE - odnose se
na prirodu i aktivnost bakterijskih enzima i transportnih
proteina. Neke od fizioloke i biokemijske karakteristike
koje se ispituju su:
izvor C i N, sadraj st. stjenke, izvori energije, produkti
fermentacije,sekundarni metaboliti, osmotska tolerancija,
osjetljivost na metabolike inhibitore i antibiotike, pH optimum

Enzimatska aktivnost se iroko primjenjuje za

diferencijaciju bakterija jer i relativno srodne bakterije se
mogu razlikovati na osnovu BIOKEMIJSKIH TESTOVA:
a)sposobnost iskoritavanja C iz razliitih spojeva
(monosaharida,polisaharida)
b)tvorba indola, amonijaka, H2S
c)hidroliza kroba, elatine, kazeina, eskulina
d) iskoritavanje citrata, malonata
e)aktivnost glukozidaze, katalaze, oksidaze, peptidaze,
celulaze, fosfataze, esteraze
f) redukcija nitrata

4. EKOLOKE KARAKTERISTIKE- razlike izmeu

mikroorganizama s obzirom na ekoloke uvjete
(temperatura, pH, svjetlost, slobodan kisik)

5. SEROLOKE KARAKTERISTIKE- imunoloke tehnike koriste

se za komparaciju proteina razliitih mikroorganizama

6. GENETIKE I MOLEKULARNE KARAKTERISTIKE- jedan od

najvanijih pristupa taksonomiji nastao kroz:
- analize proteina
-- analize nukleinskih kiselina