Practica N.

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FERMENTACIN ALCOHLICA CON LEVADURAS
INTRODUCCIN
La Fermentacin alcohlica de define como el proceso bioqumico por el cual las
levaduras transforman los azcares del mosto en Etanol y CO2. Para que la
fermentacin se realice de manera eficiente, el mosto ha de hallarse en
condiciones anaerobias. En condiciones aerobias las levaduras se multiplican
abundantemente con un rendimiento en biomasa muy alto ya que se consiguen
1g de levadura por cada 4g de azcar consumidos los productos obtenidos son
muy poco etanol, agua y CO2.
En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentacin; es decir
degradan los azcares de forma incompleta generando Etanol, CO2 y energa.
En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1g de levadura por
cada 100g de azcares consumidos.
Tanto levaduras como bacterias han sido utilizadas para la produccin de etanol.
Saccharomyces cerevisiae es la levadura ms comnmente utilizada. El Etanol
es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es
crtica para obtener rendimientos altos.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FERMENTACIN ALCOHLICA
Existen factores tanto fsicos como qumicos que inciden positiva o negativamente
en el transcurso de la fermentacin alcohlica, ya sea actuando sobre el
desarrollo de las levaduras o incidiendo directamente sobre la propia
fermentacin. Los ms relevantes son los siguientes:
TEMPERATURA: A mayor temperatura la fermentacin transcurre mas
rpidamente, sin embargo es menos pura, es decir, se produce menos etanol y
mas cantidad de compuestos secundarios.
Las levaduras a 30C tienen su temperatura ptima de desarrollo. Por encima de
35C la actividad disminuye rpidamente y mueren a antes de 45C.
OXIGENO: Aunque la fermentacin es un proceso anaerbico, las levaduras
mantienen una leve respiracin utilizando para ello el oxigeno disuelto en el
mosto.
NUTRIENTES: Los azcares son fuente de energa para las levaduras.
OBJETIVO
Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin realizada
por la levadura de Saccharomyces cerevisiae .

MATERIALES Y EQUIPOS
Azcar, miel o panela, Levadura, Recipiente de vidrio, Manguera y tapn,
Licuadora, Colador, Antiespumante, Alcoholmetro, Agitador mecnico
pHmetro, Equipo de destilacin, Probeta, Esptulas, Balones de 4-6 L,
Refractmetro, Perlas de ebullicin
REACTIVOS
KMNO4, Bisulfito de Sodio, cido Cromotrpico, H2SO4
DATOS Y OBSERVACIONES
Consideraciones a tener en cuenta en la elaboracin del fermento:
Tabla 1: Cantidad de azcar del mosto para corregir los Brix
MATERIALES
QUE CONTIENEN
AZCAR
Azcar Blanca
Azcar Morena
Miel
Glucosa

CANTIDAD
(g)

AGUA (ml)

BRIX

10
10
10
10

100
100
100
100

1
1
0,6
1

NOTA:
No es recomendable utilizar para la prctica frutas tales como: Mango,
Papaya, Guanbana y Guayaba; ya que estas tienen mucho muclago y son
muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentacin
Se sugiere utilizar frutas tales como: Mora, Uva, Lulo, Maracay, Naranja.

Tabla 2: %Azcar en algunas frutas

FRUTA
Anon
Badea Jugo sin semilla
Banano comn
Ciruela comn
Cereza
Ciruela Claudia
Curaba
Chirimoya
Durazno amarillo
Feijoo sin cscara
Frambuesa
Fresas enteras
Guayaba comn
Guayaba pera
Guanbana pulpa
Higo sin semilla
Kiwi pulpa
Lima
Limn comn jugo
Limn mandarina
Limn Tahit
Lulo sin semilla
Mamey pulpa
Mandarina Jugo
Manzana Ana
Manzana sin cscara ni semilla
Maracuy morado pulpa
Maracuy amarillo pulpa
Mora castilla pulpa sin semilla
Naranja jugo
Pera sin cascara
Pia jugo
Tamarindo pulpa concentrada
Tomate arbol pulpa semilla
Toronja jugo
Uchuvas enteras
Uva Queen verde
Uva Isabela
Uva negra
Uva Red Globe
Uva Ribier
Uvas pasas sin semilla
Zapote pulpa

%AZCAR
(g/1000ml)
25.4
10.1
23.4
20.8
16.6
13.0
6.3
18.2
12.0
11.9
11.6
6.9
11.9
6.8
13.0
9.6
14.9
6.0
8.6
5.8
7.2
5.7
12.4
10.1
15.0
14.8
13.6
14.5
5.6
10.4
8.5
13.0
61.3
7.0
9.2
19.6
14.0
15
9.6
17
17
75.0
12.4

AZCAR
(gramos/litro)
254
101
234
208
166
130
63
182
120
119
116
69
119
68
130
96
149
60
86
58
72
57
124
101
150
148
136
145
56
104
85
130
613
70
92
196
140
150
96
170
170
750
124

Tabla 3: Gramos de azcar a adicionar por kilo de mosto.

Gramos de azcar a adicionar por litro de mosto
Densidad 20C

Brix

Alcohol 8%

Alcohol 10%

Alcohol 12%

1.0000
1.0050
1.0070
1.0100
1.0110
1.0150
1.0196
1.0200
1.0250
1.0300
1.0350
1.0399
1.0441
1.0483
1.0500
1.0525
1.0550
1.0567
1.0610
1.0653
1.0696
1.0740
1.0784
1.0828
1.0873
1.0918
1.0963
1.1009

0.0
1.5
2.0
2.7
3.0
4.0
5.0
5.2
6.4
7.6
8.8
10
11.0
12.0
12.4
13.0
13.5
14.0
15.0
16.0
17.0
18.0
19.0
20.0
21.0
22.0
23.0
24.0

144.0
129.0
124.1
116.7
114.2
104.4
94.0
92.1
80.0
67.9
55.9
44.0
34.0
24.0
20.3
14.0
8.6
4.0
0.0

180.0
165.0
160.1
152.7
150.2
140.4
130.0
128.1
116.0
103.9
91.9
80.0
70.0
60.0
56.3
50.0
44.6
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0

216.0
201.0
196.1
188.7
186.2
176.4
166.0
164.1
152.0
139.9
127.9
116.0
106.0
96.0
92.3
86.0
80.6
76.0
66.0
56.0
46.0
36.0
26.0
16.0
6.0
0.0

Alcohol
14%
252.0
237.0
232.1
224.7
222.2
212.4
202.0
200.1
188.0
175.9
163.9
152.0
142.0
132.0
128.3
122.0
116.6
112.0
102.0
92.0
82.0
72.0
62.0
52.0
42.0
32.0
22.0
12.0

PROCEDIMIENTO A (Produccin con Clulas libres)

Preparar un sustrato (tener en cuenta que est en buen estado), medir los grados
Brix y verificar que se encuentren entre 17-20 grados. En caso de ser necesaria
una correccin, se puede adicionar azcar como fuente de carbono suplementaria
hasta obtener los grados Brix requeridos. Una vez corregidos, se ajusta el pH
(3.0-3.5). Finalizado este proceso, se toman 200ml del mosto y en l, se adiciona
la levadura (aproximadamente 2-4g/l) para sua ctivacin a 37 C. Al mosto
sobrante, se le agrega Bisulfito de Sodio (100 p.p.m.) para impedir la proliferacin
bacteriana y el pardeamiento del medio.
Es necesario dejar un espacio en el recipiente para el control de espuma y la
salida del CO2, para ello se le pone el tapn de caucho con un orificio para la
introduccin de una manguera aproximadamente de 1 metro de longitud la cual
tiene una salida que llega a un recipiente con agua donde se observarn las
burbujas del CO2 producidas.

Dejar fermentar libremente durante 4 semanas aproximadamente. A lo largo de

todo el proceso, se debe realizar un control peridico de las propiedades
fisicoqumicas del material en fermentacin, tales como: pH y grados Brix, las
cuales ponen en evidencia el curso que lleva el proceso. (Produccin no de
fermentacin).
En caso de que los grados Brix bajen puede ser necesaria la adicin de ms
cantidad de azcar, proporcional a los grados Brix que se quieran aumentar. VER
TABLA 1.
Finalizado el proceso de fermentacin por parte de la levadura, indicado por la
estabilidad de los grados Brix, se procede a separar el alcohol del material no til,
mediante destilacin, para esto se procede as:
DETERMINACIN DEL GRADO ALCOHLICO VOLUMTRICO
Medir 200 ml del medio en un matraz aforado y anotar la temperatura.
Transvasar la muestra al baln de destilacin, enjuagar el matraz aforado 4
veces, con 10 ml de agua destilada cada vez y aadir los lquidos de lavado al
mismo baln; adicionar perlas de vidrio y adicionar unas gotas del antiespumante.
Ensamblar el equipo y destilar recibiendo el destilado en el mismo matraz donde
se midi la muestra, el cual debe permanecer en bao de hielo. Recoger el
destilado, hasta obtener un volumen aproximadamente igual a del volumen.
Agitar y llevar a volumen con agua, a la temperatura inicial, con una tolerancia de
+/- 2C. Para comprobar la produccin de etanol producido, se realiza una prueba
cualitativa, el cual se toma una porcin del destilado con una esptula y con una
candela se pone la llama debajo de esta, presenciar la produccin de una llama
de color azul intenso, la cual indica la presencia de etanol relativamente puro,
descartndose la presencia de agua en el producto destilado.
Lectura:
Colocar el destilado en la probeta, la cual debe mantenerse en perfecta posicin
vertical. En el lquido no deben existir burbujas ni partculas flotando. Introducir el
alcoholmetro en el lquido, agitar, dejar en reposo al menos 30 segundos y anotar
la temperatura. Leer el grado alcohlico, por encima o por debajo.
PROCEDIMIENTO B (Produccin con Clulas inmovilizadas utilizando como
sustrato jarabe glucosado)
MATERIALES
Cepa de Saccharomyces cerevisiae mantenida en caja petri con agar Sabouraud
4 % de glucosa a 4 C.

Medio de cultivo para la activacin de la cepa

Componente
Fuente de carbono
KH2PO4
(NH4)2SO4
MgSO4 7 H2O
Extracto de Levadura
Peptona Universal
Agua destilada

Cantidad por litro

100.0 g
2.0 g
3.0 g
1.0 g
4.0 g
3.6 g
1.0 L

PROCEDIMIENTO
Se debe repicar la cepa de levadura para obtener un cultivo fresco, esto se realiza
preparando algunas cajas con agar Sabouraud 4 % de glucosa y sembrando el
ellas el microorganismo. Se deben incubar las cajas a 38 C durante 4 das.
Activacin de la levadura: Como el microorganismo se conserva en caja, para
transferirlo al medio de cultivo de produccin del etanol; es necesario activarlo,
para esto se utilizan tubos de ensayo tapa rosca con un volumen de 10 mL del
medio de cultivo para activacin. NOTA: La fuente de carbono utilizada es
sacarosa. Se toman colonias definidas y aisladas de una caja petri y se lleva a los
diferentes tubos con medio previamente preparados y esterilizados,
posteriormente se incuban a 38 C y 150 rpm durante 4 das. Pasado este
tiempo, se selecciona uno de los tubos dependiendo de la cantidad de biomasa
que presente y este se escala a un volumen final de 100 mL del mismo medio de
cultivo utilizado para la activacin de la cepa. Pasadas 24 horas, los 100 mL son
escalados nuevamente a un volumen de 250 mL del mismo medio de cultivo.
Finalmente se escala a 2 L. NOTA: Todos los volmenes escalados se incuban a
38 C y 150 rpm. Despus de 2 das se presentan un crecimiento representativo
de clulas que servirn como inculo. Se deshecha alrededor de 1 L de
sobrenadante, y el medio con clulas restante se divide en dos partes
aproximadamente iguales, 50 mL sern utilizados como inculo para el proceso
en batch y el resto para el proceso en continuo con clulas inmovilizadas.
Se preparan 2.5 L del medio de cultivo pero esta vez el sustrato ser jarabe
glucosado. Para preparar este medio es necesario conocer la concentracin de
azcares en el jarabe, puede utilizarse el mtodo de DNS o Antrona y
posteriormente hacer la dilucin correspondiente para que el jarabe quede a una
concentracin de 100.0 g/L.
FERMENTACIN EN BATCH
Para esta fermentacin se preparan 450 mL de medio de cultivo con jarabe
glucosado a este medio se le agregan los 50 mL del medio separado como
inculo para este proceso y se incuba durante 12 horas a 35 C y 150 rpm;

pasado este tiempo, se toman 10 mL del sobrenadante, a esta muestra se le

realiza un anlisis para determinar la concentracin de sustrato por el mtodo
DNS o Antrona. Se toman aproximadamente 100 mL del mismo sobrenadante
para ser destilados con el fin de concentrar el Etanol y determinar su
concentracin.
FERMENTACIN EN CONTINUO
Las clulas que quedaron en los ltimos 2 L de medio para crecimiento sern las
utilizadas en la inmovilizacin. Antes de montar la fermentacin es necesario
inmovilizar las clulas.
INMOVILIZACIN DE CLULAS
MATERIALES: Jeringa estril, 150 mL de solucin isotnica al 0.85 % (p/v)
(solucin acuosa de NaCl), 190 mL de solucin acuosa de Alginato de sodio al 3
% (p/v), 400 mL de solucin acuosa de CaCl2 al 3 % (p/v). NOTA: Todas las
soluciones deben ser esterilizadas.
PROCEDIMIENTO
Despus de tener una cantidad suficiente de clulas para inmovilizar, se descarta
el sobrenadante del medio de cultivo en el que han crecido. Las clulas que
quedan se centrifugan para obtener pellets libres de medio de cultivo y, se
resuspenden en una solucin de NaCl estril (solucin isotnica).
La inmovilizacin se realiza mezclando una suspensin de levaduras en 100 mL
de solucin isotnica estril con una solucin estril al 2 % de Alginato de Sodio.
Se hace gotear esta mezcla mediante una jeringa estril sin aguja sobre una
solucin previamente esterilizada de CaCl2 al 3 %. Con una altura de gotea de 1
cm se pueden obtener esferas homogneas de menos de 5 cm de dimetro.
MONTAJE DEL BIOREACTOR
Esterilizar durante 15 minutos y a 15 psi el reactor incluyendo las mangueras y la
tapa de este, adems, esterilizar 2 L de medio del cultivo con jarabe glucosado.
En un ambiente estril llenar completamente el reactor con las esferas de
levadura inmovilizada. llenar la columna con el medio de cultivo preparado con
jarabe y mantener durante 8 horas el proceso en batch para acondicionar las
clulas inmovilizadas. Pasado este tiempo, operar el reactor en continuo durante
12 horas a 37 C. Por ltimo, tomar una muestra de 10 mL de medio de cultivo
para el anlisis de azcares y 100 mL para la destilacin y determinacin de la
concentracin de Etanol.
Hacer clculos de rendimiento en los dos procesos y comparar los resultados.

DETERMINACIN DE METANOL
Prueba cualitativa
Diluir la muestra a una concentracin alcohlica entre 5 y 6% (G.L), tomar 50 ml
de la muestra diluida y destilar recolectando 40 ml en el mismo baln donde se
midi la muestra (baln de 50 ml). Ajustar a volumen con agua destilada.
Adicionar 1 ml de solucin de KMNO4 a un erlenmeyer y enfriar en bao de hielo
por 15 minutos, agregar 0,5 ml del destilado. (Mantener en bao de hielo por 30
minutos), decolorar la solucin con una pequea cantidad de NaHSO3 (Bisulfito
de Sodio) seco (+/- 100 mg), aadir 0,5 ml de cido Cromotrpico y adicionar
lentamente y con agitacin 7,5 ml de H2SO4 concentrado. Posteriormente se
pone el erlenmeyer en un bao mara a 60C., durante 15 minutos (para
desarrollar color).
La aparicin de un color que va del violeta al morado intenso indica la presencia
de metanol.
Prueba cuantitativa
Muestra
Proceder igual que la prueba cualitativa, pero dejar enfriar despus del bao
mara. Llevar a volumen con etanol al 5.5 %, agitar y mantener siempre a
temperatura ambiente. Leer absorbancia a 575 nm.
Blanco
Tomar 1 ml de alcohol al 5.5 % llevarlo a un baln volumtrico de 50ml que
contiene 1 ml de KMnO4, colocar en bao de hielo y tratar igual que la muestra.
Solucin estndar de metanol
Medir exactamente 1 ml de metanol y llevar a un baln volumtrico de 100 ml,
ajustar volumen con alcohol al 5.5 % de concentracin = 1 % de metanol. Tomar
2.5 ml de la solucin anterior y llevar a un volumtrico de 100 ml, ajustar volumen
con alcohol al 5.5 % de concentracin = 0.025 % de metanol. Tomar 1 ml de esta
ltima solucin y llevar a un volumtrico de 50 ml que contiene 1 ml de KMnO4 y
tratar en igual forma que la muestra y el blanco.
Leer la absorbancia del estndar.
Determinar la cantidad de metanol en la muestra como sigue:
% v/v metanol = A X 0.025 X F
A*
Donde:

A: absorbancia de la muestra
A*: absorbancia del estndar de metanol
F: factor de dilucin de la muestra.

Preparacin de:
Alcohol del 5.5 %: A partir de etanol absoluto. Tomar 55.5 ml de etanol absoluto
y ajustar a 1 L con agua destilada.
GLOSARIO
GRADOS BRIX: Es el porcentaje de slidos solubles presentes en el jugo o
material fermentecible, los cuales relacionan la gravedad especfica de la solucin
con la concentracin equivalente de sacarosa pura.
PH: Medida de grado de acidez o basicidad de una solucin.
FERMENTACIN: Consiste en el que el azcar contenido en el mosto, su
mayor parte desaparece, ocupando su lugar el alcohol.
GRADO ALCOHOLIMTRICO: Porcentaje de alcohol etlico a 20C.
BILBLIOGRAFA
POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, Mxico. (1978). Pg.
359-376.
JAGNOW, G. Y David W.Bioctenologa: induccin con experimentos modelos. Ed.
Acribia, Zaragoza-Espaa (1991).
RAMIREZ L., Gladys. Manual de laboratorio de Bromatologa. Medelln, Enero de
1999.

Prctica No. 9
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO y OBTENCIN DE
PROTEASAS
INTRODUCCIN
El incremento poblacional que resulta de la multiplicacin celular, es un
componente esencial de la funcin microbiana, y con l se asocian, tanto el
crecimiento, como la generacin metablica; de hecho, las bacterias son
mquinas de duplicacin constante en las que se incluyen reacciones cuya
finalidad es la formacin de las macromolculas necesarias para el ensamblaje de
las nuevas estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayora de
los procariotes, el desarrollo de una clula individual es continuo hasta la divisin
en dos clulas nuevas (fisin binaria), el conocimiento de las caractersticas de
crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues con ello se pueden
reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los
procesos generadores de metabolitos.