ACTIVIDAD PRÁCTICA BCC5

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
FACULTAD DE MEDICINA

ESTUDIO DE LAS MODIFICACIONES OXIDATIVAS
DE LA LIPOPROTEINA DE BAJA DENSIDAD (LDL):
ANALISIS DE LA OXIDACION DEL COMPONENTE
LIPIDICO Y PROTEICO.

Elaborado por:

Dr. Andrés Trostchansky
Lic. Lucía Bonilla
Dra. Madia Trujillo
Dra. Laura Castro
Dr. Homero Rubbo

Marzo de 2012

Phl: fosfolípidos .063 g/ml.2. A diferencia de la LDL nativa. Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) son partículas esféricas con un diámetro de 19-23 nm. Características de las principales lipoproteínas del plasma humano.E CE y FC Phl y CE B-100 A-I. existe una disminución de la cantidad de grupos ε.Introducción.30 9 × 10 99 : 1 TG Exógenos A-I.amino libres de los residuos de lisina de las LDL lo cual explica el cambio en la especificidad del receptor.C-III. además su regulación está coordinada con la del metabolismo del coleterol impidiendo la acumulación nociva de este lípido.95 -1.019 LDL 1.6 5 × 10 90 : 10 85 : 15 80 : 20 50 : 50 Entre beta y pre .100.beta TG endóge-nos TG endógenos y Ce B-100. monocitos y macrófagos por un proceso no regulado. la lipoproteína pierde su habilidad de ser reconocida por el receptor de la LDL incrementándose a su vez la afinidad por el receptor scavenger. Este es un proceso regulado a la baja que impide la entrada excesiva de lipoproteínas a las células. A-II TG: triacilglicéridos. FC: colesterol libre. B-48. C-I. como consecuencia de modificaciones oxidativas de la LDL (LDL oxidada u ox-LDL).C-II.1. CE: ésteres de colesterol.006 .006 Origen Pre.10 6 × 10 4-5 6 × 10 1. La hipótesis oxidativa de la aterosclerosis postula que las placas de ateroma se forman a partir de células (principalmente macrófagos y musculares lisas) cargadas con lípidos (ésteres de colesterol). resulta en la conversión de los macrófagos en células espumosas formándose la estría grasa que constituye una acumulación focal de lípidos en la íntima arterial y que representa la lesión más precoz del proceso. La LDL humana se define como la población de lipoproteínas que pueden ser aisladas por ultracentrifugación en gradiente de densidad.8 .10 5 . C-I. CIII IDL 1. combinada con la disminución de la degradación de los lípidos oxidados.24 19 – 23 4 .beta > 70 25 .8 6 × 10 1.019 . Mientras la LDL es oxidada. la ox-LDL es reconocida por receptores barrenderos o “scavenger” a nivel de las células endoteliales y musculares lisas. con un rango de densidad entre 1.4. La acumulación intracelular de lípidos.063 g/ml.063 . Durante la oxidación de la LDL a una forma reconocida por los receptores scavenger.95 VLDL 0.019 y 1.063 HDL 1.70 0. B. constituyendo la población de lipoproteínas que poseen una densidad entre 1.019 a 1. Las LDL son internalizadas en las células a través del receptor normal de LDL (receptor apoE/apoB) por endocitosis mediada por receptor.3. Estructura de la LDL.8 . Densidad (g/ml) Movilidad Electroforética Diámetro (nm) Peso molecular (daltons) Relación Lípido/ Proteína Lípidos más Abundantes Principales Apoproteínas Quilomicrones < 0. E C-II.1.1.210 Beta Alfa 22 .

Este core central se encuentra rodeado por una monocapa formada principalmente por unas 700 moléculas de fosfolípidos (particularmente fosfatidilcolina) y 600 moléculas de colesterol libre. tirosinas y metioninas (37. Los demás antioxidantes. alrededor del 50 % son ácidos grasos poliinsaturados. las moléculas de LDL son grandes partículas esféricas con un diámetro de 19 .5 millones como un valor promedio del peso molecular de la lipoproteína cada partícula contiene alrededor de 1600 moléculas de ésteres de colesterol y 170 moléculas de triglicéridos que juntos forman un core central lipofílico.8 millones. En la capa externa de la molécula se encuentra la única proteína que forma parte de la LDL y que recibe el nombre de apolipoproteína B-100 (apo B-100). La apo B-100 es una proteína constituida por 4536 aminoácidos y un peso de 512 kDa.α.caroteno y ubiquinol-10 se encuentran en cantidades menores.8 y 2. Procesos de oxidación lipídica. La variación en el contenido de ácidos grasos poliinsaturados y la relación saturados/poliinsaturados tiene un efecto significativo sobre el comportamiento oxidativo de las distintas partículas de LDL ya que estos ácidos grasos son más susceptibles de oxidación por mecanismos no enzimáticos. El contenido de ácidos grasos y su patrón de distribución varía considerablemente de persona en persona probablemente por los distintos hábitos dietéticos. El número total de moléculas de ácidos grasos unidos a las diferentes clases de lípidos de la LDL es en promedio de 2700. β-caroteno. como ser el γ-tocoferol.alílico del lípido insaturado por un radical libre reactivo y seguido por una secuencia de reacciones propagadoras.152 y 78 mol/mol respectivamente) así como cuatro residuos de cisteína libres. La fase de iniciación. El proceso de ataque y daño oxidativo que sufren los lípidos insaturados se debe a reacciones en cadena mediadas por radicales libres. principalmente ácido linoleico (18:2). propagación y terminación. está promovida por algún tipo de ″iniciador″ que sobrepasa la energía de . La lipoperoxidación procede a través de tres fases: iniciación. De su secuencia aminoacídica se destacan la presencia de triptofanos. Entre ellos se destaca el α-tocoferol con una concentración en nmol/mg de LDL que equivale a aproximadamente seis moléculas de α-tocoferol por partícula de LDL. iniciadas por la abstracción de un átomo de hidrógeno del metileno bis.23 nm y un peso molecular entre 1. Es importante resaltar la presencia de diversos antioxidantes como componentes estructurales de la LDL.Como muestra la tabla. Las cabezas polares de los fosfolípidos se encuentran en la superficie de la partícula de LDL contribuyendo a su solubilidad en la fase acuosa. Tomando 2. De estos. La lipoperoxidación es el proceso en el cual el oxígeno molecular es incorporado a moléculas de lípidos insaturados (LH) para formar hidroperóxidos lipídicos (LOOH). el primer paso crítico.

. El radical peroxilo es un importante intermediario en la cadena de propagación porque una vez formado. estas incluyen la reacción bimolecular de dos radicales alquilo o de dos radicales peroxilo para formar productos no radicalares.). Una vez que se formó el radical alquilo grupos adyacentes le proveen estabilización por resonancia. L. Cosgrove et al propusieron una relación entre la capacidad de los ácidos grasos insaturados (PUFAs) de oxidarse con respecto a la cantidad de dobles enlaces alílicos presentes en la molécula. continuará la cadena de reacciones oxidativas abstrayendo un átomo de hidrógeno de otros grupos alquilo cercanos. LOOH: hidroperóxido lipídico. La duración del ciclo de reacciones de radicales peroxilo es gobernado por varias reacciones competidoras de terminación. siempre que se encuentran disponibles suficientes moléculas de O2 y sustratos lipídicos insaturados.P.). J. . También existen reacciones de tipo radical-radical entre los radicales lipídicos generados durante la propagación y otras especies radicalares LH RH R· INICIACION · HOO · O2 L· LOOH PROPAGACION ·OO LOO· L· + L· LOO· + LOO· L· + LOO· XH + L· XH + LOO· LH LL LOOL + O 2 LOOL X· + LH X· + LOOH TERMINACION Esquema para las transformaciones químicas en las tres fases de lipoperoxidación generalizado para un lípido diinsaturado. Si está presente el oxígeno molecular reaccionará rápidamente con el radical alquilo para formar en el caso del O2 radical peroxilo (LOO. La oxidabilidad de un lípido está dada por la facilidad con la que el átomo de hidrógeno inicial puede ser abstraído. Este ciclo de reacciones propagadoras se repite a través de la abstracción de hidrógenos y formación de LOO. LOO. LH: lípido. XH: compuesto antioxidante.: radical (centrado en el carbono) lipídico.disociación del enlace alílico causando la abstracción del hidrógeno y entonces la formación del radical alquilo (L.: radical lipoperoxilo. En teoría.

4 ml de la solución de plasma y 2. Estudiar la oxidación de la LDL por Cu(II) utilizando diferentes metodologías experimentales. Para ello se agregan 0.15 M (isotónico). 5) La LDL se guarda a 4ºC. 1) 24 ml de plasma se mezclan con KBr para llevar la solución a una densidad final de 1. BSA) de 10 mg/mL 3) Buffer fosfato 50 mM.Protocolo experimental. Materiales: 1) El reactivo de Biuret se prepara mezclando: .0 g de NaOH .3 g/ml. pH 7. 2) En cada tubo de ultracentrifugación se agregan 1.28 g de KBr por ml de plasma.0 g de tartrato de Na-K . analizando las modificaciones sufridas por los tres principales componentes de la lipoproteína: lípidos. Objetivos.llevar a 1 L con agua destilada 2) Solución estándar de proteínas (por ej. se realiza una curva de calibración en el rango de 1 mg/mL a 10 mg/mL de la siguiente forma: . Nota: el NaCl se agrega sobre las paredes del tubo para evitar que se mezclen ambas soluciones y alcanzar eficientemente el gradiente de densidad. La dosificación del contenido proteico de la LDL será realizado mediante la reacción de Biuret de manera espectrofotométrica.30.2 ml de NaCl 0. Dosificación de la concentración de la LDL. 4) Se separa la banda de color naranja que se observa en el tercio superior del tubo evitando arrastrar fracciones superiores. 3) Se centrifuga a 80000 rpm por 90 minutos a 4ºC.6. apolipoproteína B-100 y antioxidantes. Se obtiene una solución de una fase agitando suavemente al plasma. Purificación de LDL.1.4 Metodología: A partir de la solución de concentración proteica conocida. A partir de plasma humano fresco se purifica la fracción de LDL por ultracentrifugación.5 g de CuSO4 .

1 0 0. de proteínas (mg/mL) 1. Para el desarrollo de color del método de Biuret.4 0.8 Homogenizar y dejar reaccionar por 20 minutos a temperatura ambiente. colocar en cada tubo: Vol.0 6. Solución estándar (mL) Vol. En el caso de la muestra problema de LDL. Solución proteica (mL) Vol. Reactivo de Biuret (mL) 0. Oxidación lipídica-Consumo de oxígeno.6 0.0 1. El 100% depende de la temperatura: .4 0. para permitir el desarrollo de color.0 5. CALIBRACION: el aparato se calibra al 100% de oxígeno mediante el burbujeo con pipeta pasteur durante algunos minutos para saturar con aire la cámara que contiene agua solamente. et al (Arch. El consumo de oxígeno se realiza en una cámara de 4 ml de volumen final a agitación constante. Biophys. La oxidación de la LDL se llevará a cabo a 25ºC en presencia de Cu(II) de acuerdo a Batthyány C.Vol.2 0. Luego se mide absorbancia de cada mezcla de reacción a 540 nm. Posteriormente esperar a que se estabilice la medida y llevar a 100% con la perilla de CAL.6 0.8 0. 2000). Buffer fosfato (mL) Conc.0 Determinación de la concentración por espectrofotometría: Preparar una gradilla con 23 tubos correspondientes a: 18 tubos (tres por cada concentración) para la curva de calibración. Biochem..0 2.9 10.0 0.5 0. se determina la concentración de las diluciones 1/2 y 1/3 de la solución obtenida por ultracentrifugación. 4 tubos para la mezcla problema (dos diluciones diferentes por duplicado).0 4.5 0. Oxidación de la LDL. Los procesos de oxidación lipídica en la LDL serán analizados por consumo de oxígeno y espectrofotometría (consumo de antioxidantes) mientras que las modificaciones en la apoliporoteína B-100 serán analizadas por electroforesis. 1 tubo para el blanco de reacción (con buffer fosfato).2 0.

concentración final) en buffer fosfato 50 mM.4 gr de agarosa b) Buffer de muestra 5x : 0. . en un volumen final de 4 ml. aproximadamente 500 ml. detectando las fases de latencia. ajustar pH a 8. concentración final) en una cubeta de espectrofotómetro (volumen 1 ml). 2) Se incuba la LDL (2 mg/ml. La longitud de onda de trabajo se corresponde con aquella donde la solución presenta mayor absorbancia. Para la oxidación de la LDL: 1) Se incuba.58 ml de glicerol + 0.1 mg/ml. Materiales y métodos. a la longitud de onda seleccionada en 1. Oxidación de la LDL. disolver en 800 ml de H2O. concentración final) en una cubeta de espectrofotómetro y realizar medidas de absorbancia cada 5 nm entre 380 nm y 550 nm.Electroforesis en agarosa.3). con CuSO4 en una relación LDL/Cu(II) de 1:75. 2) Se registra el consumo de oxígeno por 100 minutos. Consumo de antioxidantes endógenos de la LDL: oxidación de carotenoides. Realizar el espectro de absorción de la LDL. pH 7. No olvidar dejar con agua la cámara una vez que se termina de trabajar. Para ello incubar LDL (2 mg/ml.4 con CuSO4 en una relación LDL/Cu(II) de 1:75.3 y llevar a 1 litro. a) Gel de agarosa al 0. 1) Determinación de la longitud de onda de trabajo.2 gr glicina + 30. propagación y terminación. durante 60 minutos. 3) Se realizan medidas de absorbancia cada 3 minutos. la LDL (0.Temperatura (ºC) 5 10 15 20 25 28 30 35 37 O2 nmoles/ml 397 351 314 284 258 244 237 222 217 Una vez calibrado se puede empezar a trabajar.5% en buffer de corrida (Tris-Glicina 1x pH=8. aproximadamente 60 ml → 0. OBSERVACIONES: no olvidar lavar después de cada medida y cambiar la membrana cuando se va a trabajar con material diferente al utilizado en la última corrida.3. Se prepara por dilución de un stock 10x: 114.3 gr Tris.42 ml de H2O + 1 ml de buffer corrida 10x c) Buffer corrida: Tris-Glicina 1x pH=8.

¿Cuáles serían los oxidantes responsables de la oxidación de LDL in vivo? . propagación y terminación. Fijación: 10-20 minutos en solución de fijación (antes de fijar poner en el congelador la solución de fijación y el coomasie) d. y de acuerdo a la literatura. 15. Se siembran por pocillo hasta 20 µl de solución de muestra (4 µl de buffer de la muestra 5x + 16 µl de muestra) con una cantidad final de proteína entre 10 a 20 µg.15% en Destain. Determine con ella la concentración de la solución stock de LDL. donde amerite.d) Solución de fijación: 250 ml de etanol:acético:agua (60:10:30) → 150 ml de EtOH + 25 ml acético + 75 ml de H2O e) Solución de tinción: Coomasie Brillant Blue R-250 0. Preparar aprox. a. Se sacan muestras a los 0. de proteínas (mg/mL). e. Se prepara 1 litro Procedimiento La LDL se oxida con cobre como previamente.30 mA) + 15 minutos a 90 voltios c. 4) Para el caso de la electroforesis. Deshidratar el gel por peso entre papel de filtro seco. Corrida: 40 minutos a 65 voltios constante (aprox. 5) Hipotetizar la razón por la cual se observan cambios en la movilidad electroforética de la LDL incubada con Cu(II) y como se relaciona con la formación de las células espumosas. 120 ml → 0. 1) Dibuje la curva de calibración. identificar las especies presentes en cada carril. Además se lo compara con una muestra de plasma. b. las fases de latencia. 2) En los casos de la oxidación lipídica y de antioxidantes graficar las medidas realizadas en función del tiempo identificando. Secado: 1) Con papel de filtro sin peso 2) Con papel de filtro con peso 3) Secador de geles entre papel celofán Análisis de los datos. Decoloración: 1 hora (o hasta que exista buen contraste bandas/fondo) en destain con cambios sucesivos de la solución g.18 gr coomasie f) Solución de Destain: MeOH:acético:H2O (35:25:40). Coloración: 10 minutos en solución de tinción f. 50 y 90 minutos para analizar los cambios en la movilidad electroforética de la LDL. graficando Abs540nm vs Conc. 3) Indicar para cada fase los principales intermediarios involucrados y que función cumplen: reductor u oxidante.

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