2009

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y
PRESERVACION DEL
LACTOCOCCUS A PARTIR DE
SUERO LACTEO PARA
PRODUCCIÓN DE NISINA

INTEGRANTES

BARRENO MAYRA QUILLUPANGUI

CRISTINA

GEOVANNA SALAZAR VIZCAINO KARINA

BIOTECNOLOGIA

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1. INTRODUCCIÓN:
La alta capacidad contaminante del suero de leche por su contenido en proteínas y lactosa (materia
orgánica) permite la reproducción de microorganismos produciendo cambios en el DBO que varía
entre 30,000 a 50,000 mg/l, además de la cantidad de ácido láctico presente va alterar los procesos
biológicos que se llevan a cabo en las plantas de tratamiento aumentando los costos.
En el Ecuador se produce 444.195 ton/año de lactosuero que es descargado al drenaje y llega a ríos y
suelos, causando un problema serio de contaminación. Treinta empresas industrializadas han
implementado un sistema de tratamiento de aguas desde el año 2005 y las 250 empresas artesanales se
desconoce algún tratamiento de los residuos lácteos. En el Ecuador no se conoce datos de
aprovechamiento de suero, se tomó como referencia Alpina-Ecuador que realiza tratamientos de sus
líquidos residuales para minimizar la carga orgánica, indicando que un kilogramo de leche puede
obtener 100 gramos de queso y el 90% restante corresponde a suero, contaminando 2000 veces más
que el agua residual doméstica, haciéndola más difícil y costosa para tratar, de esta manera se
aprovecha una cantidad de 33.600 toneladas evitando tratar más de 1.507 toneladas de DQO,
generando alimentos de valor agregado como lactosa en polvo.
Para ello se ha buscado alternativas de aprovechamiento de este residuo y una de ellas es la
identificación de sustancias con efecto antimicrobiano como las bacteriocinas. Se piensa que el 99%
de las bacterias pueden producir cuando menos una bacteriocina y la única razón de que no se hayan
aislado es debido a que han sido muy poco estudiadas (Gordon y O’Brien, 2006).
De Vuyst y Vandame (1994) citan diferentes géneros de microorganismos productores de
bacteriocinas dentro de los más empledos, Lactococcus lactis subsp lactis, Pediococcus acidilactici,
Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Carnobacterium divergens Lactobacillus
helveticus, en función de sus características bioquímicas y modo de acción. La nisina es la única
bacteriocina autorizada como aditivo alimentario especialmente por su actividad frente a los
clostridios, reconocida por la FDA.
El aprovechamiento de este desperdicio lácteo se consigue mediante la utilización de bacterias ácido-
lácticas que son de importancia en la industria de alimentos, siendo utilizadas para la obtención de
ácido láctico, saborizantes, espesantes y bacteriocinas, empleadas para la conservación y mejora
tecnológica de los productos lácteos, cárnicos y vegetales fermentados.
Los beneficiarios directos de este estudio serán las instituciones interesadas a brindar servicios de
remediación ambiental y/o industrias lácteas interesadas en obtener nuevos recursos, los beneficiarios
indirectos son los pobladores que mejorarían su calidad de vida y se lograría proteger la biodiversidad.

2. OBJETIVOS:
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2.1 OBJETIVO GENERAL.
Obtener microorganismos lácteos (LACTOCOCCUS) a partir del lactosuero para la producción de
nisina mediante un sistema de bioproceso.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aislar y seleccionar microorganismos lactococcus a partir de una muestra de lactosuero.
2. Adaptar un proceso con un sustrato fermentable (lactosa) para el desarrollo de lactococcus.
3. Preservar el microorganismo lactococcus mediante crioviales con glicerol al 20%.

3. MARCO TEORICO:

3.1CARACTERISTICAS DEL LACTOCOCCUS

BACTERIA LACTOCOCCUS

Compuestos orgánico
FUENTE DE ENRGIA
Reacciones redox

FUENTE DE CARBONO Lactosa

CATEGORIA Quimiorganotrofos

Lactosa del suero del queso actua como donador y aceptor.

GRUPO ACEPTOR DE
ELECTRONES Proceso de fermentación, oxidación parcial

Homofementativo

Auxotrofo

METABOLISMO Anaerobio facultativo

Carecen de catalasa posee peroxidasa y superoxido dismutasa.

Produce un grupo de antibióticos polipeptídicos llamados nisinas.

3.2 FORMACION DE NISINA

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 FORMACION DE LA NISINA
BACTERIOCINA ESPECTRO DE ACCION (A PARTIR DEL METABOLISMO DEL
LACTOCOCCUS)

Es muy eficaz como conservador En la síntesis de la nisina participan un grupo de genes

frente a bacterias Gram-positivas. ordenados como nisABTCIP, nisRK, y nisFEG que
No es eficaz con las bacterias regulan la expresión del gen estructural nisA.
Gram-negativas. El precursor inactivo NisA es modificado químicamente
Es capaz de impedir el desarrollo por los productos de nisB y nisC que deshidratan a los
de clostridios y bacilos, residuos de treonina y serina y originan la formación de
destruyendo la pared de la espora. los enlaces tioeter característicos de los antibióticos.
NISINA
La sensibilidad a la nisina varía de Una vez modificado el precursor, este es transportado,
unas bacterias a otras. procesado y secretado; para proteger a la célula
La dosis mínima de eficacia no es productora, existen las proteínas NisL y NisFEG que le
siempre la misma. confieren inmunidad.
3.1 CINETICA DE CRECIMIENTO DE LACTOCOCCUS

Gráfico.1

Se muestra una tendencia de crecimiento exponencial del lactococcus teniendo como referencia su tasa
de crecimiento de (µmax =0.523h-1) y el tiempo generacional de (tg =1h) cuyo tiempo transcurrido es
cada 5 horas, partiendo de una concentración inicial de1x102ufc/ml, indicando que el crecimiento de
este microorganismo es lento tomando como indicativo que cada hora se duplica por tanto a las 24
horas se obtendría una concentración 3.5E9 ufc/ml.

3.2 CINETICA DE CRECIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE NISINA

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 Gráfico.2

En la gráfica 2 permite ver el crecimiento exponencial del lactococcus y la producción de nisina en el

medio modificado de lactosuero con caseína, donde la producción del antibiótico es mínima en la fase
log debido a que este es producido en la fase estacionaria, es decir cuando ha cesado el crecimiento
microbiano, por lo tanto se puede ver que en la fase máxima de crecimiento comienza a disminuir el
pH y existe mayor producción de nisina, esto también se debe al consumo de caseína debido a que este
microorganismo es auxotrofo capaz de fermentar la lactosa y producir altas cantidades de acido
láctico, contienen un complejo proteolítico que le permite hidrolizar la caseína, este exige un
suministro exógeno de aminoácidos para su crecimiento, por que es incapaz de efectuar su síntesis a
partir de una fuente nitrogenada mineral simple, formando el metabolito secundario (nisina).

Sin embargo, la estabilidad de este antibiótico es mayor mientras más bajo se encuentra el pH hasta
alcanzar valores de 2, sin embargo su acción antimicrobiana es máxima a pH 6.5-6.8 siendo su
estabilidad pequeña.

4. MARCO METODOLOGICO

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4.1 MUESTREO

El experimento se realiza en laboratorio de microbiología de la Facultad de ciencias químicas con

muestras de suero lácteo obtenidas de la fábrica de quesos La Andina en Machachi Ecuador.
Las muestras de suero lácteo fueron escogidas totalmente al azar y empacadas en bolsas herméticas
selladas y guardadas en un cooler, con hielo para mantener la muestra fresca. El tiempo trascurrido
entre toma de muestra y análisis es de un día

4.2 TECNICA DE AISLAMIENTO PARA LACTOCOCCCUS.

4.2.1 Preenriquecimiento:

Se tomaron 10ml de suero lácteo con 90 ml de caldo Elliker se debe incubar en condiciones de
anaerobiosis a 37ºC por 5 días en una estufa, para adaptar a los microorganismos que se encuentran
dañados o debilitados, ya que son de crecimiento lento.

4.2.2 Aislamiento:

Realizar diluciones decimales desde 10-1 hasta 10-4 .Tomar cada tubo de la dilución y sembrar por
estriado en el medio Elliker agar (que tiene un pH de 6.8 antes de esterilizar este medio es el más
selectivo para el aislamiento de lactococcus) por duplicado, las cajas se incubaran a 37ºC por 5 días,
manteniendo las condiciones de anaerobiosis en una jarra gaspac y se coloco una tira indicadora para
verificar la anaerobiosis.
Realizar una resiembra con el mismo medio Elliker agar por duplicado para obtener cepas puras.

4.2.3 Selección:

Se debe tomar las colonias que muestran distinta morfología en función tamaño, forma, borde,
elevación, transparencia, color y velocidad de crecimiento. Pero la selección se basa específicamente
en las colonias que son resistentes a diferentes concentraciones de caseína a las que serán sometidas
las bacterias en el suero de quesería.
A los lactococcus seleccionados se procede a pasar a suero de quesería pasteurizado suplementado con
caseína hidrolizada obteniéndose mejores resultados de producción de nisina a una concentración de
15g por litro y a un pH menor de 5 después de 24 horas de fermentación según el Centro de Estudios y
de Investigación en Biotecnología (CIBIOT) Colombia.

4.3 Preservación:

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Las cepas de Lactococcus aisladas se transfieren a caldo BHI con glicerol (20% v/v) y se congelaron a
-80 ºC hasta su posterior análisis.

5. RESULTADOS:

PARÁMETROS DE SELECCIÓN:

CONC. CONC.
MÍNIMA DE MÁXIMA DE
CEPA pH
CASEÍNA CASEÍNA
2,5g/500ml 12,5g/500ml
LAC-1 X 4
LAC-2 X 4
LAC-3 X 4
LAC-4 X 4
LAC-5 X 4
LAC-6 X 4
LAC-7 X 4
LAC-8 X 4
LAC-9 X 4
LAC-10 X 4
LAC-11 X 4
LAC-12 X 4

6. DISCUSIONES:
 Al realizar el experimento sobre la producción de nisina a partir de lactococcus se pudo
determinar que la velocidad de crecimiento del microorganismo fue lenta, afectando el tiempo
de realización del aislamiento y selección.
 El sinergismo entre el lactoccocus y lactobacillus genero dificultad en el aislamiento del
microorganismo deseado ya que el lacctobacillus se desarrolla más rápido que el lactococcus.
 El metabolismo respiratorio de este microorganismo tuvo inconvenientes, debido a que
varía según las condiciones dadas afectando su crecimiento.
 Para la realización del aislamiento del microorganismo se necesito de un breve análisis de
diferenciación, ya que a pesar del medio específico (Eliker) utilizado se obtuvieron
lactococcus y lactobacillus que son sinergistas siendo necesario identificar las bacterias por
medio de tinción gram escogiéndolas de acuerdo a su morfología (cocos gran positivos).
 Para determinar la selección de la mejor cepa se sometió al microorganismo a
concentraciones máximas 12.5 g/500ml y mínimas 2.5g/500ml de caseína, mediante este
análisis se eligió a las mejores cepas puesto que dicho microorganismo presenta enzimas que
degrada la caseína, incrementando la velocidad de su crecimiento.

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7. CONCLUSIONES:

 Se aislaron 15 cepas biotecnológicas (lactococcus) de 10 muestras de suero de quesería.

 De las 10 muestras de suero analizadas no todas contenían la cepa de interés, esto depende de
la micro flora presente en cada muestra siendo una de las razones principales para su limitado
crecimiento.
 El aislamiento tardo un aproximado de 2 semanas por ser una bacteria de crecimiento lento y
microaerofilica ; siendo necesario el proporcionar de un medio ambiente adecuado para su
crecimiento, medio de anaerobiosis ( jarras gaspac)
 La selección se la hizo de acuerdo a parámetros específicos como pH y concentración de
caseína, permitiendo evaluar y seleccionar las mejores cepas debido a su resistencia a
condiciones minimas y maximas de nutrientes.
 La selección se realizo en base a la concentración de caseína, tomando como referencia tres
concentraciones siendo una mínima de 2,5g/500ml una optima de 7,5g/500ml y una máxima
12,5g/500ml.
 Se determino que de las cajas sembradas, 12 fueron las seleccionadas obteniéndose el
resultado de 7 cepas resistentes a las concentraciones mínimas y 6 cepas resistentes a
concentraciones máximas.
 La concentración optima para el desarrollo de los microoranismos (lactococcus) fue a
concentraciones de caseína de 7.5mg/500ml de suero, esto se comprobo al realizar la selección
a diferentes concentraciones se observo que existio mayor produccion de biomasa y su pH se
encontaraba alrededor de 6 lo cual indica que son los factores optimos para que exista más
crecimiento de este microorganismo.
 Mediante estos parámetros de selección se tomo en cuenta a los microorganismos lactococcus
que sobrevivieron a estas condiciones extremas de nutrientes y pH, obteniendo 12 mejores
cepas resistentes a las concentraciones mínima y máxima de caseína.
 El Lactococcus Lactis produce una bacteriocina denominada nisina la cual no se pudo
propagar y obtener el metábolito deseado debido al limitado tiempo para lograr la
finalización del proyecto.

8. RECOMENDACIONES:

 Se recomienda la toma de varias muestras debido a que este microorganismo es de difícil

aislamiento.
 Se recomiendo considerar el ambiente de anaerobiosis en este tipo de microorganismo para su
crecimiento.
 Se debe tomar en cuenta los requerimientos nutricionales así como su metabolismo de este
microorganismo (lactococcus), debido a que de esto depende poder o no aislarlo.
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 Se recomienda utilizar medios especificos y selectivos para la obtencion de biomasa.
 Se recomienda utilizar una metodología sencilla y añadir la de preferencia
peptona de caseína ya que la caseína precipita con el calor esto no sucede
con la peptona de caseína, y es dificultoso al tratarla de calentar con el
medio.
 Se recomienda trabajar con muestras que no hayan sufrido tratamiento
térmico como leche o suero sin pasteurizar ya que se encuentra una
microflora sin stress fácil de manipular.

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RECOMENDACIONES:
BIBLIOGRAFIA:
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• http://viaclinica.com/article.php?pmc_id=1182390
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• http://www.pab.ec/document/perfiles/PM_QUESO.pdf
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29S4TQ&hl=es&ei=qBAGS9zxAYzHlAfChqWnDA&sa=X&oi=book_result&ct=resul
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%20lactococcus%20lactis%20%2B%20METABOLISMO&f=false
• http://www.expoinnovaquimica.com/sitio/docs/memorias/posters/EVALUACION_DE_
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