3.

Osnove molekularne biologije

Nasljeivanje, geni i DNA
Ekspresija genetike informacije
Rekombinantna DNA
Detekcija nukleinskih kiselina i proteina
Funkcija eukariotskih gena
KLJUNI POKUS: Pretpostavka DNA provirusa
MOLEKULARNA MEDICINA: HIV i AIDS
SUVREMENA MOLEKULARNA BIOLOGIJA tei razumjeti mehanizme odgovorne za
nasljeivanje i ekspresiju genetike informacije koja odreuje strukturu i funkciju stanice.
Kao to je prikazano u prvom poglavlju, sve stanice dijele odreena osnovna svojstva, a to
temeljno jedinstvo stanine biologije posebice je vidljivo na molekularnoj razini. Postojanje
temeljnoga staninog jedinstva omoguilo je znanstvenicima da izaberu jednostavnije
organizme, primjerice bakterije, kao model za provoenje mnogih fundamentalnih
eksperimenata u oekivanju da e molekularni mehanizmi i u organizmima razliitim poput
ovjeka i E. coli biti slini. Brojni eksperimenti potvrdili su tonost te pretpostavke i danas je
jasno da je molekularna biologija stanice jedinstveni put razumijevanja raznolikih vidova
staninoga ponaanja.
Poetni napredak u molekularnoj biologiji postignut je koritenjem prednosti brzog rasta i
jednostavne genetike bakterija poput E. coli i njezinih virusa. Razvoj rekombinantne DNA
tehnologije koji je uslijedio omoguio je da se osnovni principi i eksperimentalni pristupi
razvijeni u prokariotima proire i na eukariotske stanice. Posljedice razvoja rekombinantne
DNA tehnologije su goleme. U ranim je fazama rekombinantna DNA tehnologija omoguila
izolaciju i karakterizaciju pojedinih gena, a od nedavno i odreivanje cjelokupnih redoslijeda
nukleotida u genomima sloenih organizma poput biljaka i ivotinja, ukljuivi i ovjeka.
3.1. Nasljeivanje, geni i DNA
Mogunost reprodukcije temeljno je svojstvo svih ivih bia. Svi organizmi genetiku
informaciju, koja odreuje njihovu strukturu i funkciju, nasljeuju od svojih roditelja. Isto
tako, sve stanice nastaju iz prethodno postojeih stanica, i nuno je da se genetiki materijal
umnoi i podijeli pri svakoj podjeli stanice. Nain na koji se genetika informacija
udvostruuje i prenosi sa stanice na stanicu, ili s organizma na organizam, sredinje je pitanje
biologije. Prepoznavanje molekule DNA kao nositelja genetike informacije i otkrivanje
mehanizama njezina prijenosa stvorilo je temelj naem dananjem razumijevanju biologije na
molekularnoj razini.
Geni i kromosomi
Temeljne principe genetike postavio je Gregor Mendel 1865. godine na osnovi pokusa
krianja graka. Ispitivanjem nasljeivanja nekoliko dobro definiranih svojstava kao to je
primjerice boja sjemenke, Mendel je uspio razumjeti osnovne principe njihova prijenosa.
Pretpostavio je da je svako svojstvo odreeno parom nasljednih elemenata koje danas zovemo
genima, i na taj je nain uspio objasniti sve rezultate dobivene krianjem. Po jedna kopija
gena za svako svojstvo (nazivamo je alel) nasljeuje se od svakog roditelja. Primjerice,
krianje dviju sorti graka, jedne sa utim, a druge sa zelenim sjemenkama, daje potomstvo
prikazano na slici 3.1. Svaka roditeljska sorta ima po dvije identine kopije gena koji odreuje
utu (Y engl. yellow) ili zelenu (y) boju sjemenke. Biljke nastale krianjem su hibridi koji su
naslijedili po jednu kopiju gena koji odreuje utu (Y) i jednu kopiju gena koji odreuje
www.perpetuum-lab.com

zelenu (y) boju sjemenke. Sve biljke potomci prikazanoga krianja (prva filijalna ili F 1
generacija) imaju ute sjemenke, stoga kaemo da je gen koji odreuje utu boju sjemenki (Y)
dominantan, a gen koji odreuje zelenu boju sjemenki (y) recesivan. Genotip (genetiki
ustroj) biljaka F1 generacije je stoga Yy, a njihov fenotip (fiziki izgled) je uta boja sjemenki.
Kriamo li meusobno dva potomka F1 generacije dobivamo F2 generaciju u kojoj se aleli za
utu i zelenu boju sjemenke razdvajaju (segregiraju) tako da je omjer biljaka F 2 generacije sa
utim i zelenim sjemenkama 3 : 1.
Mendelovo otkrie, koje je oito bilo ispred svog vremena, uglavnom je zapostavljano do
1900. godine kada su Mendelovi zakoni nasljeivanja ponovo otkriveni te je konano
spoznana njihova vanost. Ubrzo nakon toga predloeno je da su kromosomi nositelji gena.
Uoeno je da je veina stanica viih biljaka i ivotinja diploidna, tj. da sadrava po dvije
kopije svakog kromosoma. Iznimka su spolne stanice (spermiji i jajne stanice) koje nastaju
posebnim tipom diobe koji nazivamo mejoza, a u kojoj se samo po jedan lan kromosomskog
para prenosi na svaku novonastalu stanicu (slika 3.2). Posljedino, spermiji i jajne stanice su
haploidne i sadravaju samo po jednu kopiju svakog kromosoma. Sjedinjenje dviju takvih
haploidnih stanica pri oplodnji stvara novi diploidni organizam u kojem jedan kromosom
svakoga para potjee od mukoga, a drugi od enskoga roditelja. Ponaanje parova
kromosoma tijekom mejoze stoga oslikava ponaanje alela tijekom segregacije, to je
rezultiralo pretpostavkom da su kromosomi nositelji gena.
Osnove mutacija, povezanosti gena, i odnosa izmeu gena i kromosoma velikim su dijelom
razjanjene i pokusima provedenim na vonoj muici, Drosophila melanogaster. Vonu je
muicu mogue jednostavno uzgajati u laboratorijskim uvjetima na odgovarajuim
podlogama, a razmnoava se priblino svaka dva tjedna to je znaajna prednost za genetika
ispitivanja. Zbog tih je svojstava Drosophila i dalje vrlo popularan organizam za genetika
ispitivanja na ivotinjama, posebice u podruju genetike razvoja i diferencijacije.
Poetkom 20. stoljea otkriven je velik broj genetikih promjena (mutacija) kod vone
muice koje su uglavnom pogaale lako uoljiva svojstva poput boje oiju i oblika krila.
Pokusi krianja pokazali su da se neki od gena koji odreuju ta svojstva nasljeuju neovisno
jedan o drugom to je upuivalo na to da se nalaze na razliitim kromosomima koji se
neovisno razdvajaju tijekom mejoze (slika 3.3). U isto vrijeme, neki su se drugi geni esto
nasljeivali zajedno. U tom sluaju govorimo o vezanim genima, a povezuje ih smjetaj na
istom kromosomu. Broj skupina vezanih gena jednak je broju kromosoma nekog organizma
(etiri kod vrste Drosophila) to je dodatno podralo pretpostavku da su kromosomi nositelji
gena. Do 1915. godine gotovo je stotinu gena identificirano i kartirano na etiri kromosoma
vone muice to je dovelo do opeg prihvaanja kromosoma kao nositelja nasljeivanja.
Geni i enzimi
Rana genetika istraivanja bila su usmjerena na identifikaciju i kartiranje gena koji odreuju
lako uoljiva svojstva poput boje oiju vone muice, no nain na koji ti geni odreuju fenotip
nije bio poznat. Prve spoznaje o vezi izmeu gena i enzima pojavile su se 1909. godine, kad je
uoeno da je nasljedna bolest fenilketonurija (vidi: Molekularna medicina u Poglavlju 2)
posljedica genetikoga poremeaja u metabolizmu aminokiseline fenilalanin. Pretpostavljeno
je da je taj poremeaj posljedica nedostatka enzima koji katalizira odgovarajue metabolike
reakcije, to je potaklo formuliranje generalne hipoteze da geni odreuju sintezu enzima.
Jasniji dokaz povezanosti gena sa sintezom enzima proiziao je iz eksperimenta koji su 1941.
godine na gljivici Neurospora crassa proveli George Beadle i Edvard Tatum. U laboratoriju

www.perpetuum-lab.com

Neurospora moe biti uzgajana na minimalnom ili bogatom mediju slinim onima opisanim u
Poglavlju 1 za uzgoj E. coli. Za gljivicu Neurospora crassa minimalni se medij sastoji samo
od soli, glukoze i biotina. Bogati medij obogaen je aminokiselinama, vitaminima, purinima i
pirimidinima. Beadle i Tatum izolirali su mutante ove gljivice koje normalno rastu na
bogatom mediju, no ne mogu rasti na minimalnom mediju. Otkrili su da je svakoj mutanti za
rast potreban specifian prehrambeni nadomjestak, primjerice odreena aminokiselina.
tovie, potreba za odreenim prehrambenim nadomjestkom bila je u korelaciji s
nemogunou sinteze te iste molekule. Na osnovi ovih promatranja Beadle i Tatum su
zakljuili da svaka mutacija rezultira nedostatkom odreenoga metabolikoga puta. Kako je
bilo poznato da metabolikim putovima upravljaju enzimi, iz eksperimenata na gljivici
Neurospora crassa proiziao je zakljuak da svaki gen odreuje strukturu jednog enzima, tj.
hipoteza jedan gen jedan enzim. Danas znamo da se mnogi enzimi sastoje od vie
polipeptida, pa je trenutno prihvaen oblik ove hipoteze da svaki gen odreuje strukturu
jednoga polipeptidnog lanca.
Molekula DNA nositelj je genetike informacije
Razumijevanje kromosomske osnove nasljeivanja i odnosa izmeu gena i enzima nije samo
po sebi pruilo molekularno objanjenje gena. Kromosomi sadravaju i proteine i DNA, i
prvotno se mislilo da su geni proteini. Prvi dokazi koji su vodili prema suprotnoj ideji da je
molekula DNA nositelj genetike informacije doli su iz eksperimenata provedenih na
bakterijama. Ti eksperimenti predstavljaju prototip suvremenog pristupa odreivanja uloge
gena unoenjem novih molekula DNA u stanicu, to e biti objanjeno kasnije u ovom
poglavlju.
Uloga molekule DNA otkrivena je iz rezultata eksperimenata provedenih na bakteriji koja
uzrokuje upalu plua (Pneumococcus). Virulentni sojevi ove bakterije okrueni su kapsulom
izgraenom od polisaharida koja titi bakterije od napada imunosustava domaina. Budui da
kapsula bakterijskim kolonijama daje glatki izgled u kulturi, soj bakterija koji proizvodi
kapsulu oznaujemo S (engl. smooth). Mutirani sojevi koji su izgubili sposobnost stvaranja
kapsule (oznaeni s R, engl. rough) tvore kolonije s hrapavim rubom te nisu letalni ako njima
zarazimo mia. Godine 1928. uoeno je da mi inficiran smjesom hrapavih (R) bakterija i
toplinom ubijenih glatkih (S) bakterija razvija upalu plua i ubrzo umire. Bakterije koje su
zatim izolirane iz takvog mia bile su S tipa. Kasniji su eksperimenti pokazali da su ekstrakti
S bakterijskih kultura u kojima nije bilo itavih bakterijskih stanica takoer u stanju prevesti
(transformirati) R bakterije u S oblik. Zakljueno je da je neka tvar u ekstraktu S bakterija
(nazvana transformirajui princip) odgovorna za genetiku transformaciju R oblika u S oblik
bakterije.
Godine 1944. Oswald Avery, Colim MacLeod i Maclyn McCarty izolirali su DNA iz
bakterijskih ekstrakata i pokazali da enzimi koji razgrauju DNA unitavaju sposobnost
transformacije, dok enzimi koji razgrauju proteine nemaju takav uinak (slika 3.4). Na taj su
nain dokazali da je transformirajui princip zapravo molekula DNA. Ipak, tek e
eksperimenti provedeni tijekom sljedeih nekoliko godina na bakterijskim virusima rezultirati
prihvaanjem DNA kao genskog materijala. Naime, kad bakterijski virus inficira stanicu,
DNA virusa, a ne njegovi proteini, mora ui u stanicu kako bi omoguila umnaanje virusa.
tovie, DNA roditeljskog virusa (a ne njegovi proteini) prenosi se na novonastale estice
virusa. Usklaenost tih rezultata s nastavkom ispitivanja aktivnosti DNA u transformaciji
bakterija dovela je do konanog prihvaanja ideje da je DNA genski materijal.

www.perpetuum-lab.com

Struktura DNA
Poznavanje trodimenzionalne strukture DNA koju su 1953. godine otkrili James Watson i
Francis Crick temelj je suvremene molekularne biologije. U vrijeme kad su Watson i Crick
radili na strukturi DNA bilo je poznato da je DNA polimer koji se sastoji od etiri tipa
duikovih baza, dva purina (adenin [A] i gvanin [G]) i dva pirimidina (citozin [C] i timin [T]),
vezanih za fosforilirane eere. S obzirom na sredinju ulogu DNA kao genskog materijala,
objanjenje njezine trodimenzionalne strukture bilo je kritino za razumijevanje njezine
funkcije. Watson i Crickov pogled na taj problem bio je pod znaajnim utjecajem Linus
Paulingova objanjenja vodikove veze i -uzvojnice, estog oblika sekundarne strukture
proteina (vidi Poglavlje 2). Eksperimentalni podatci o strukturi DNA proizili su iz
kristalografskih ispitivanja Mauricea Wilkinsa i Rosalind Franklin. Analiza tih podataka
otkrila je da je molekula DNA uzvojnica koja ini zavoje od 3,4 nm. Podatci su pokazali i da
je razmak izmeu susjednih baza 0,34 nm, stoga se jedan zavoj uzvojnice sastoji od 10 parova
baza. Vano je otkrie bilo da je promjer uzvojnice priblino 2 nm, to je upuivalo na to da
se molekula DNA sastoji od dvaju, a ne od jednoga lanca DNA.
Na osnovi ovih podataka Watson i Crick su izgradili svoj model molekule DNA (slika 3.5).
Osnovna svojstva modela su da je DNA dvostruka uzvojnica sa eerno-fosfatnom okosnicom
na vanjskoj strani molekule. Baze su smjetene u unutranjosti molekule i orijentirane tako da
se vodikove veze stvaraju izmeu nasuprotnih purina i pirimidina. Sparivanje baza vrlo je
specifino: A se uvijek sparuje s T, a G s C. Ova specifinost objanjava raniji rezultat Erwina
Chargaffa koji je analizirao sastav baza u razliitim molekulama DNA i utvrdio da je koliina
adenina uvijek jednaka koliini timina, a koliina gvanina jednaka koliini citozina. Zbog
specifinog su sparivanja baza dva lanca molekule DNA komplementarna i svaki lanac
sadrava cjelokupnu informaciju potrebnu za odreivanje slijeda baza u drugom lancu.
Replikacija DNA
Otkrie komplementarnog sparivanja baza izmeu dva lanca u molekuli DNA dalo je odgovor
na pitanje kako genetiki materijal moe upravljati svojom vlastitom replikacijom, procesom
koji se mora dogoditi pri svakoj diobi stanica. Predloeno je da se dvije niti DNA mogu
razdvojiti i sluiti kao kalup za sintezu novoga komplementarnog lanca iji bi slijed bio
odreen specifinim sparivanjem baza (slika 3.6). Ovaj proces nazivamo
semikonzervativnom replikacijom jer je u svakoj novonastaloj molekuli DNA sauvan po
jedan stari lanac roditeljske DNA.
Izravnu podrku modelu semikonzervativne replikacije DNA pruio je elegantni eksperiment
koji su 1958. godine proveli Matthew Meselson i Frank Stahl obiljeivi DNA izotopima koji
su promijenili njezinu gustou (slika 3.7). E. coli je prvo uzgajana u mediju koji je sadravao
teki izotop duika (15N) umjesto normalnoga duika (14N). DNA tih bakterija umjesto
normalnoga duika 14N sadravala je teki izotop 15N, te je stoga bila gua od DNA bakterija
uzgajanih u normalnom mediju. Takvu teku DNA ( 15N) bilo je mogue razdvojiti od
normalne DNA (14N) ravnotenim centrifugiranjem u gradijentu CsCl, to je omoguilo
prouavanje procesa sinteze DNA. E. coli koja je rasla u 15N mediju prenesena je u normalni
medij te joj je omogueno da se podijeli jo jednom. DNA bakterija dobivenih diobom je
izolirana i analizirana centrifugiranjem u gradijentu gustoe CsCl. Rezultat ove analize
pokazao je da je sva teka DNA zamijenjena novosintetiziranim molekulama DNA ija je
gustoa izmeu gustoe tekih (15N) i lakih (14N) molekula DNA. Takav rezultat objanjen je
modelom u kojem tijekom replikacije dolazi do razdvajanja dvaju tekih roditeljskih lanaca
DNA od kojih svaki slui kao kalup za sintezu po jednoga novog lakoga lanca DNA. Rezultat
su molekule DNA od kojih svaka sadrava po jedan laki i jedan teki lanac te je njihova

www.perpetuum-lab.com

gustoa izmeu gustoe teke i lake molekule DNA. Ovaj eksperiment pruio je izravni dokaz
za semikonzervativnu replikaciju DNA i jasno naglasio vanost komplementarnog sparivanja
baza izmeu dvaju lanaca DNA u dvostrukoj uzvojnici.
Sposobnost DNA da slui kao kalup za vlastitu sintezu dodatno je potvrena kad je utvreno
da enzim izoliran iz E. coli (DNA-polimeraza) moe katalizirati replikaciju DNA in vitro. U
prisutnosti lanca DNA koji slui kao kalup, DNA-polimeraza mogla je katalizirati ugradnju
nukleotida u komplementarni lanac DNA.
3.2. Ekspresija genetike informacije
Geni djeluju tako da odreuju strukturu proteina koji su odgovorni za funkcioniranje stanice
na molekularnoj razini. Identifikacija DNA kao genetikog materijala i razjanjenje njezine
strukture otkrilo je da genetika informacija mora biti odreena redoslijedom etiriju baza (A,
C, G i T) koje izgrauju molekulu DNA. S druge strane, proteini su polimeri izgraeni od 20
razliitih aminokiselina iji slijed odreuje njihovu strukturu i funkciju. Prva izravna veza
izmeu mutacije gena i promjene u slijedu aminokiselina pokazana je 1957. godine, kad je
utvreno da je razlika izmeu hemoglobina pacijenata oboljelih od nasljedne bolesti srpaste
anemije i normalnoga hemoglobina u svega jednoj aminokiselini, no dublje razumijevanje
molekularnog odnosa izmeu DNA i proteina proizilo je iz serije eksperimenata koji su
iskoristili prednosti E. coli i njezinih virusa kao genetikih modela.
Kolinearnost gena i proteina
Najjednostavnija pretpostavka koja bi objasnila odnos gena i proteina bila je da redoslijed
nukleotida u DNA odreuje redoslijed aminokiselina u proteinima. Mutacije u genu
odgovarale bi promjenama u slijedu nukleotida u molekuli DNA koje bi mogle nastati zbog
zamjene jednog nukleotida nekim drugim, zbog dodavanja (adicije) ili uklanjanja (delecije)
nukleotida. Promjene u slijedu nukleotida u molekuli DNA tada bi rezultirale odgovarajuim
promjenama u slijedu aminokiselina u proteinu kojega kodira mutirani gen. Ova je
pretpostavka predvidjela da bi razliite mutacije u istom genu mogle promijeniti razliite
aminokiseline u proteinu kojega taj gen kodira, a da bi poloaj mutacije unutar gena trebao
odgovarati poloaju promijenjene aminokiseline u proteinu.
Brzo umnaanje i jednostavnost genetikoga sustava E. coli bili su od velike pomoi pri
traenju odgovora na ova pitanja. Bilo je mogue izolirati razliite mutante bakterije E. coli,
ukljuujui i nutritivne mutante koje (poput mutanti gljivice Neurospora crassa prikazanih
ranije) rastu samo uz dodatak odreene aminokiseline. Brz rast bakterije E. coli omoguio je
izolaciju i kartiranje vie mutacija unutar jednoga gena, to je rezultiralo prvim dokazom
linearnog odnosa izmeu gena i proteina. Charles Yanofsky i njegovi kolege kartirali su seriju
mutacija u genu koji kodira enzim potreban za sintezu aminokiseline triptofana. Analiza
enzima koje kodiraju ti mutirani geni pokazala je da relativni poloaj promjena u
aminokiselinama odgovara poloaju mutacija u genu (slika 3.8). Dakle, slijed aminokiselina u
proteinu kolinearan je sa slijedom nukleotida u genu, to je u skladu s pretpostavkom da
redoslijed nukleotida u molekuli DNA odreuje redoslijed aminokiselina u proteinu.
Uloga glasnike RNA
Iako se inilo da slijed nukleotida u DNA odreuje slijed aminokiselina u proteinu, iz toga
nije nuno proizlazilo da sama molekula DNA upravlja sintezom proteina. tovie, u prilog
tome nije govorila ni injenica da je DNA smjetena u jezgri eukariotske stanice, dok se
sinteza proteina odvija u citoplazmi. inilo se puno vjerojatnije da neka druga molekula
prenosi genetiku informaciju s molekule DNA na mjesto sinteze proteina (ribosomi).

www.perpetuum-lab.com

RNA je djelovala kao vjerojatni kandidat za takvog posrednika jer je slinost njezine strukture
sa strukturom DNA upuivala na to da bi RNA mogla biti sintetizirana na osnovi DNA kalupa
(slika 3.9). Molekula se RNA razlikuje od molekule DNA po tome to je jednolanana, a ne
dvolanana, to je njezina eerna komponenta riboza, a ne deoksiriboza, i to sadrava
pirimidinsku bazu uracil (U) umjesto timina (T) (vidi sliku 2.10). No ni promjena eera, niti
zamjena uracila timinom ne utjee na sparivanje baza, stoga je sintezom RNA mogue
upravljati koristei DNA kao kalup. tovie, kako je RNA smjetena poglavito u citoplazmi,
inilo se da je ona logini posrednik u prijenosu informacije s DNA na ribosome. Ova
svojstva RNA sugerirala su tijek genetike informacije koji prepoznajemo kao sredinju
dogmu molekularne biologije:
DNA RNA protein
U skladu s ovim konceptom, molekula RNA sintetizira se na osnovi DNA kalupa (proces koji
nazivamo prepisivanje ili transkripcija), a proteini se sintetiziraju na osnovi RNA kalupa
(proces koji nazivamo prevoenje ili translacija).
Eksperimentalni dokaz postojanja RNA posrednika koji je predvidjela sredinja dogma pruili
su Sidney Brenner, Francois Jacob i Matthew Meselson prouavanjem E. coli inficirane
bakteriofagom T4. Sinteza RNA E. coli prestaje nakon infekcije bakteriofagom T4 i jedina
nova RNA koja nastaje u inficiranim bakterijama prepisana je s DNA T4 virusa. RNA
bakteriofaga T4 dolazi u kontakt s bakterijskim ribosomima, te stoga prenosi informaciju s
DNA na mjesto sinteze proteina. Zbog svoje uloge u prijenosu genetike informacije
molekula RNA koja slui kao kalup za sintezu proteina nazvana je glasnika RNA (mRNA,
od engl. messenger). Sintezu RNA na osnovi DNA kalupa katalizira enzim nazvan RNApolimeraza.
Osim mRNA, za sintezu proteina vana su i dva druga tipa RNA ribosomska RNA (rRNA)
koja je sastavni dio ribosoma i transportna RNA (tRNA) koja djeluje kao adaptor koji
donosi aminokiseline na RNA kalup. Osnove strukture i funkcije tih molekula opisane su u
nastavku ovoga poglavlja, a detaljnije su prikazane u poglavljima 6 i 7.
Genetiki kod
Na koji se nain slijed nukleotida u RNA prevodi u slijed aminokiselina u proteinu? U ovom
koraku ekspresije gena genetika se informacija prenosi s nukleinskih kiselina na proteine,
molekule koje su kemijski jako razliite, to otvara dva nova problema za razumijevanje
djelovanja gena.
Budui da aminokiseline nisu strukturno srodne duikovim bazama, izravno komplementarno
sparivanje mRNA i aminokiselina tijekom ugradnje aminokiselina u proteine nije se inilo
vjerojatnim. Kako je onda mogue da se aminokiseline slau na mRNA kalup tijekom sinteze
proteina? Ovaj problem rijeen je otkriem tRNA koje slue kao adaptori izmeu
aminokiselina i mRNA tijekom prevoenja genetike informacije (slika 3.10). Prije njezine
uporabe u sintezi proteina, svaka aminokiselina se pomou specifinog enzima povezuje s
odgovarajuom tRNA. U sljedeem koraku sparivanje baza izmeu prepoznavajueg slijeda
na molekuli tRNA i komplementarnog slijeda na mRNA usmjerava aminokiselinu vezanu na
tRNA na njezin toan poloaj na mRNA kalupu.

www.perpetuum-lab.com

Drugi problem u prevoenju slijeda nukleotida u slijed aminokiselina bio je odreivanje

genetikoga koda. Na koji je nain mogue informaciju sadranu u slijedu etiri razliita
nukleotida prevesti u slijed 20 razliitih aminokiselina u proteinima? Budui da je 20
razliitih aminokiselina potrebno odrediti pomou svega etiri nukleotida, bilo je nuno da
najmanje tri nukleotida budu ukljuena u kodiranje svake aminokiseline. Koriteni
pojedinano, etiri nukleotida mogli bi kodirati svega etiri aminokiseline, a koriteni u
parovima, svega esnaest (42) aminokiselina. Koriteni u obliku tripleta etiri nukleotida
mogu kodirati 64 (43) razliite amonokiseline, to je vie nego dovoljno za 20 razliitih
aminokiselina koje doista izgrauju proteine.
Da je genetiki kod zaista organiziran u triplete potvreno je eksperimentima provedenim na
bakteriofagu T4 koji je nosio mutacije u intenzivno studiranom genu nazvanom rII. Fagi s
mutacijama u tom genu tvore jako velike plakove koje je vrlo lako razlikovati od plakova koje
tvore virusi divljeg tipa. Identifikacija i kartiranje mutacija u genu rII vrlo je jednostavno pa
je napravljena detaljna genetika karta ovog lokusa. Ispitivanje rekombinanata izmeu rII
mutanata koji su nastali adicijom ili delecijom nukleotida pokazalo je da adicija ili delecija
jednoga ili dva nukleotida uvijek rezultira mutantnim fenotipom. Nasuprot tomu, fagi koji su
imali deleciju ili adiciju tri nukleotida esto bi zadrali funkciju divljeg tipa (slika 3.11). Ovo
otkrie sugeriralo je da se geni itaju od neke fiksne toke u skupinama od po tri nukleotida.
Adicija ili delecija jednoga ili dva nukleotida poremetila bi okvir itanja itavoga gena, to bi
dovelo do ugradnje pogrjenih aminokiselina itavom duinom kodiranog proteina. Nasuprot
tomu, adicija ili delecija tri nukleotida rezultirala bi samo dodatkom ili gubitkom jedne
aminokiseline, dok bi ostatak proteina bio nepromijenjen, a esto bi i zadrao prvobitnu
funkciju.
Sljedei korak u otkrivanju genetikoga koda bio je pridruiti odgovarajuu aminokiselinu
svakom tripletu nukleotida. Za rjeavanje ovog problema primijenjen je sustav koji je mogao
sintetizirati proteine in vitro (in vitro translacija). Tada je ve bilo poznato da ekstrakti
stanica, koji sadravaju ribosome, aminokiseline, tRNA i enzime odgovorne za vezanje
aminokiselina na pripadajue tRNA (aminoacil-sintetaze), mogu katalizirati ugradnju
aminokiselina u proteine. Takav nain sinteze proteina ovisi o prisutnosti mRNA vezane na
ribosome, a samu je sintezu mogue znaajno pojaati dodatkom proiene mRNA. Budui
da u takvom sustavu dodana strana mRNA upravlja sintezom proteina, ispitivanje prevoenja
sintetikih mRNA poznatoga slijeda nukleotida omoguilo je dekodiranje genetikoga koda.
Prvi eksperiment tog tipa proveli su Marshall Nirenberg i Heinrich Matthaei koristei
sintetiki RNA polimer koji je sadravao samo uracil kao kalup za in vitro sintezu proteina
(slika 3.12). Utvrdili su da poli-U kalup odreuje ugradnju samo jedne aminokiseline,
fenilalanina, u polipeptid koji se sastoji od ponavljajuih fenilalaninskih ostataka. Slini
eksperimenti s RNA polimerima koji su sadravali samo jednu vrstu nukleotida pokazali su da
AAA kodira lizin, a CCC kodira prolin. Ostatak genetikoga koda dekodiran je koristei RNA
polimere koji su sadravali smjese nukleotida. Na taj nain deifrirana su sva 64 tripleta
(kodona) (tabl. 3.1). Od 64 kodona 61 kodon odreuje aminokiseline, a preostala tri (UAA,
UAG i UGA) predstavljaju STOP kodone koji signaliziraju kraj sinteze proteina. Genetiki
kod je degeneriran to znai da su mnoge aminokiseline odreene s vie no jednim kodonom.
Uz nekoliko iznimaka (prikazanih u Poglavlju 10), svi se organizmi slue istim genetikim
kodom to je vrst dokaz da su se sve dananje stanice razvile od istoga zajednikog pretka.

www.perpetuum-lab.com

RNA virusi i obrnuto prepisivanje

Nakon dekodiranja genetikoga koda inilo se da su temeljni principi molekularne biologije
postavljeni. U skladu sa sredinjom dogmom, genetiki materijal sastoji se od DNA koja ima
svojstvo samoreplikacije i mogunost prijenosa informacije (prepisivanja) na molekulu
mRNA, koja onda slui kao kalup za sintezu proteina. Ipak, kao to je ve navedeno u prvom
poglavlju, mnogi virusi kao genetiki materijal sadravaju RNA umjesto DNA to zahtijeva
neki drugi oblik prijenosa genetike informacije.
RNA genomi su isprva otkriveni kod biljnih virusa od kojih se mnogi sastoje samo od RNA
molekula i proteina. Izravni dokaz da RNA obavlja ulogu genetikog materijala tih virusa
pruili su eksperimenti provedeni sredinom 20. stoljea koji su pokazali da proiena RNA
izolirana iz virusa mozaika duhana moe inficirati nove stanice domaina u kojima onda
nastaju nove infektivne virusne estice. Nain replikacije veine virusnih RNA genoma
razjanjen je ispitivanjem RNA bakteriofaga bakterije E. coli. Otkriveno je da ti virusi nose
informaciju za specifini enzim koji katalizira sintezu RNA molekule na osnovi RNA kalupa
(RNA upravljana RNA sinteza) primjenjujui isti princip komplementarnog sparivanja baza
koji se rabi pri replikaciji DNA ili prepisivanju DNA u RNA.
Iako je utvreno da se veina ivotinjskih RNA virusa (primjerice polio virus ili virus
influence) umnoava RNA upravljanom sintezom RNA, ovaj mehanizam nije mogao objasniti
umnoavanje jedne porodice ivotinjskih virusa (RNA tumorskih virusa) koji su bili posebice
interesantni zbog svoje sposobnosti da uzrokuju tumore kod inficiranih ivotinja. Iako ovi
virusi sadravaju genomsku RNA, eksperimenti koje je poetkom 1960-ih godina proveo
Howard Temin pokazali su da za umnoavanje virusnih estica mora doi do sinteze DNA u
inficiranim stanicama, to je dovelo do pretpostavke da se RNA tumorski virusi (danas ih
nazivamo retrovirusi) umnoavaju putem sinteze DNA posrednika kojeg nazivamo DNA
provirus (slika 3.13). Ova je pretpostavka u poetku nailazila na veliki otpor znanstvenika jer
je ukljuivala RNA upravljanu sintezu DNA to se protivilo sredinjoj dogmi. Godine 1970.
su Temin i David Baltimore neovisno jedan o drugome otkrili da retrovirusi sadravaju dosad
nepoznati enzim koji katalizira sintezu DNA na osnovi RNA kalupa, a dobiveni su i jasni
dokazi prisutnosti virusne DNA u inficiranim stanicama. S ovim je otkriima sinteza DNA na
osnovi RNA kalupa, koju danas nazivamo obrnuto prepisivanje (reverzna transkripcija)
prihvaena kao oblik prijenosa genetike informacije u biolokim sustavima.
Obrnuto prepisivanje nije vano samo kao mehanizam umnoavanja retrovirusa, ve i u jo
najmanje dva druga iroka podruja molekularne i stanine biologije. Obrnuto prepisivanje
nije ogranieno samo na retroviruse. Odvija se i u stanicama i kao to je prikazano u
poglavljima 4 i 5, esto je odgovorno za premjetanje (transpoziciju) slijeda nukleotida s
jednoga na neko drugo mjesto u DNA njihovih kromosoma. tovie, sekvenciranje genoma
ovjeka pokazalo je da je priblino 40% genomske DNA ovjeka nastalo obrnutim
prepisivanjem. S druge strane, enzimi koji kataliziraju RNA upravljanu sintezu DNA
(reverzne-transkriptaze) mogu biti uporabljeni za sintezu DNA kopija bilo koje RNA
molekule u eksperimentalnim sustavima. Primjena reverzne-transkriptaze omoguila je
ispitivanje eukariotske mRNA metodama koje se koriste za manipuliranje molekulama DNA,
a koje su opisane u nastavku ovog poglavlja.

www.perpetuum-lab.com

3.3. Rekombinantna DNA

Klasini eksperimenti u molekularnoj biologiji znaajno su unaprijedili nae temeljno
razumijevanje prirode i ekspresije gena. Budui da su ta istraivanja bila zasnovana poglavito
na genetikim analizama, njihov je uspjeh u znaajnoj mjeri ovisio o koritenju jednostavnih
organizama koji se brzo razmnoavaju (kao to su primjerice bakterije i virusi). Kako su
genomi veine eukariota (primjerice genom ovjeka) i do tisuu puta sloeniji od genoma
bakterije E. coli, nije bilo jasno kako bi se ti temeljni principi primijenili i na vie organizme.
Poetkom 1970-ih mogunost istraivanja sloenih genoma na molekularnoj razini nije
djelovala obeavajue. Posebice se inilo da nema naina na koji bi bilo mogue izolirati i
ispitivati pojedinane gene.
Ovu prepreku napretku molekularne biologije savladao je razvoj rekombinantne DNA
tehnologije koja je znanstvenicima pruila mogunost da izoliraju, sekvenciraju i manipuliraju
genima izoliranim iz bilo kojeg tipa stanica, pa i onih sloenih organizama. Primjena
rekombinantne DNA tehnologije omoguila je detaljna molekularna ispitivanja strukture i
funkcije eukariotskih gena i genoma te je na taj nain produbila nae razumijevanje stanine
biologije.
Restrikcijske endonukleaze
Prvi korak u razvoju rekombinantne DNA tehnologije bila je karakterizacija restrikcijskih
endonukleaza, enzima koji kidaju DNA na specifinim redoslijedima. Ovi enzimi otkriveni
su u bakterija gdje vjerojatno slue kao obrambeni mehanizam protiv ulaska strane DNA
(primjerice virusne) u stanicu. Bakterije imaju velik broj razliitih restrikcijskih endonukleaza
koje kidaju DNA na vie od stotinu specifinih mjesta prepoznavanja, a svako od tih mjesta
sastoji se od specifinog slijeda od etiri do osam parova baza (primjeri su navedeni u tablici
3.2).
Budui da restrikcijske endonukleaze razgrauju DNA u specifinim redoslijedima, mogue
ih je primijeniti za kidanje molekule DNA na jedinstvenim mjestima. Primjerice restrikcijska
endonukleaza EcoRI prepoznaje slijed od est parova baza GAATTC. Ovakav slijed
nukleotida prisutan je na pet mjesta u DNA bakteriofaga , te stoga EcoRI razgrauje DNA
u est fragmenata duljine od 3,6 do 21,2 kilobaze (1 kb = 1.000 parova baza) (slika 3.14). Ti
fragmenti mogu biti razdvojeni prema veliini gel-elektroforezom, metodom koja razdvaja
molekule na osnovi razlika u brzini kojom putuju u elektrinom polju. Gel, koji je najee
sainjen od agaroze ili poliakrilamida, smjeta se izmeu dva rezervoara s puferom u kojima
se nalaze elektrode. Zatim se uzorak (primjerice smjesa fragmenata DNA koje treba
analizirati) pipetom unosi u prethodno napravljene bunarie u gelu i ukljuuje se elektrino
polje. Nukleinske kiseline su negativno nabijene (zbog fosfata u njihovim okosnicama) te
stoga putuju prema pozitivnoj elektrodi (anodi). Gel djeluje kao sito koje selektivno usporava
vee molekule. Manje molekule se stoga kroz gel kreu bre to omoguuje da se molekule u
smjesi razdvoje na osnovi razlika u veliini.
Razliitim metodama mogue je utvrditi redoslijed restrikcijskih fragmenata i dobiti
(primjerice) kartu EcoRI restrikcijskih mjesta u DNA faga. Utvreni poloaji restrikcijskih
mjesta za brojne razliite restrikcijske endonukleaze mogu se iskoristiti za stvaranje detaljnih
restrikcijskih karata molekula DNA kao to su primjerice genomi virusa (slika 3.15). Osim
toga, nakon elektroforeze mogue je izolirati pojedine fragmente nastale razgradnjom
restrikcijskim endonukleazama to omoguuje njihovo detaljno ispitivanje, primjerice
odreivanje slijeda nukleotida u molekuli DNA. Na taj je nain karakterizirana DNA brojnih
virusa.

www.perpetuum-lab.com

Sama razgradnja restrikcijskim endonukleazama meutim nema dovoljnu rezoluciju za

analizu veih molekula DNA, kao to su primjerice stanini genomi. Restrikcijska
endonukleaza s mjestom prepoznavanja od est parova baza (kao to je primjerice EcoRI)
statistiki e gledano prepoznati jedno mjesto svakih 4.096 parova baza (1/46). Stoga se moe
oekivati da e razgradnjom molekule veliine DNA (48,5 kb) nastati oko deset EcoRI
fragmenata to je u skladu s rezultatom prikazanim na slici 3.14. Meutim razgradnja veih
genoma restrikcijskim endonukleazama daje znaajno drugaije rezultate. Primjerice genom
ovjeka sastoji se od priblino 3106 kb i stoga se moe oekivati da emo restrikcijskom
razgradnjom dobiti vie od 500.000 EcoRI fragmenata. Tako velik broj fragmenata nije
mogue razdvojiti, te agarozna gel-elektroforeza genoma ovjeka razgraenog EcoRI
restrikcijskom endonukleazom umjesto razdvojenih fragmenata daje samo kontinuirani
razmaz DNA. Kako nije mogue izolirati pojedine restrikcijske fragmente iz takve smjese,
sama razgradnja restrikcijskim nukleazama nije odgovarajua metoda za pripravu homogenog
uzorka DNA za daljnju analizu. Veliku koliinu proienih fragmenata DNA mogue je
pripraviti molekularnim kloniranjem.
Proizvodnja rekombinantnih molekula DNA
Temeljna je strategija molekularnoga kloniranja unijeti fragment DNA koji nas zanima
(primjerice komadi DNA ovjeka) u neku drugu molekulu DNA (zovemo je vektor) koja se
moe samostalno umnaati u stanici domainu. Tako nastala hibridna (rekombinantna)
molekula ili molekularni klon sastoji se od ugraenoga eljenog fragmenta DNA
povezanoga s DNA vektora. Omoguimo li takvom vektoru da se umnoi u odgovarajuem
domainu dobit emo velik broj kopija ugraenoga fragmenta DNA. Primjerice fragment
DNA ovjeka mogue je ugraditi u vektor (slika 3.16). Takve rekombinantne molekule tada
je mogue unijeti u bakteriju E. coli gdje se one uinkovito razmnoavaju, a milijuni novih
bakteriofaga sadravat e milijune kopija ugraenoga eljenog fragmenta humane DNA. Dok
na eljeni fragment predstavlja moda jednu stotisuinku genoma ovjeka, nakon ugradnje u
vektor on ini priblino jednu desetinu DNA vektora. Taj je fragment sada lako razdvojiti od
ostatka DNA vektora razgradnjom restrikcijskim endonukleazama i gel-elektroforezom.
Rezultat je velik broj kopija homogenoga proienog fragmenta humane DNA koji moemo
analizirati i s njime dalje rukovati.
Fragmente DNA kojima se koristimo za stvaranje rekombinantnih molekula obino
pripravljamo razgradnjom restrikcijskim endonukleazama. Mnogi od tih enzima kidaju u
mjestu prepoznavanja tako da ostavljaju nazubljene (ljepljive) krajeve jednolanane DNA koji
se meusobno mogu povezati komplementarnim sparivanjem baza (slika 3.17). Vezu izmeu
tih krajeva povezanih komplementarnim sparivanjem baza mogue je uvrstiti tretmanom s
DNA ligazom, enzimom koji zatvara prekide u lancima DNA (vidi Poglavlje 5). Na taj je
nain mogue u rekombinantnu DNA molekulu povezati dva razliita fragmenta DNA
(primjerice fragment DNA ovjeka i DNA vektor) pripravljena razgradnjom pomou iste
restrikcijske endonukleaze.
Fragmenti DNA koje moemo klonirati ne moraju nuno zavravati odgovarajuim slijedom
nukleotida koji prepoznaju restrikcijske endonukleaze). Naime, na tupe krajeve bilo kojeg
fragmenta DNA mogue je dodati sintetike DNA spojnice koje sadravaju mjesta
prepoznavanja za velik broj razliitih restrikcijskih endonukleaza. Te su spojnice kratki
oligonukleotidi koje je lako pripraviti kemijskom sintezom, a omoguuju da se praktino bilo
koji fragment DNA pripremi za ugradnju u vektor.

www.perpetuum-lab.com

10

Osim DNA sekvenci mogue je klonirati i RNA sekvence (slika 3.18). Prvi je korak u tom
procesu pripraviti DNA kopiju RNA molekule koristei enzim reverznu-transkriptazu. Tako
proizvedenu molekulu DNA (nazivamo je cDNA jer je komplementarna molekuli RNA koju
smo koristili kao kalup) mogue je ugraditi u vektor na ve opisani nain. Budui da su
eukariotski geni najee isprekidani nekodirajuim redoslijedima (intronima, vidi Poglavlje
4) koje se prekrajanjem (engl. splicing) uklanjaju iz mRNA, mogunost kloniranja i cDNA i
genomske DNA bila je kljuna za razumijevanje strukture i funkcije gena
Vektori za rekombinantnu DNA
Ovisno o veliini fragmenta DNA koji elimo ugraditi i svrsi eksperimenta koji planiramo, za
pripravu rekombinantnih molekula na raspolaganju nam je vie razliitih tipova vektora za
kloniranje. Prema namjeni ih moemo podijeliti na 3 osnovna sustava: vektore za izolaciju i
umnaanje klonirane DNA, vektore za ekspresiju klonirane DNA i vektore za unos
rekombinantnih DNA molekula u eukariotske stanice.
Vektori izvedeni iz bakteriofaga esto se koriste za poetnu izolaciju genomske DNA ili
cDNA iz eukariotskih stanica (slika 3.19). Iz vektora za kloniranje uklonjeni su dijelovi
genoma bakteriofaga koji nisu nuni za umnaanje virusa, a zamijenjeni su s jedinstvenim
restrikcijskim mjestima za ugradnju klonirane DNA. Veliina fragmenta DNA koji je mogue
ugraditi u takve vektore ograniena je na priblino 15 kb zbog nunosti pakiranja takvog
rekombinantnoga genoma u estice faga. elimo li primjerice izolirati genomske klonove
DNA ovjeka, spojit emo nasumine fragmente prosjene veliine oko 15 kb s krajevima
vektora. Takvu rekombinantnu DNA mogue je uinkovito ugraditi u estice faga mijeajui
je s proteinima (koje nazivamo ekstrakti za pakiranje) in vitro. S takvim esticama faga
zatim inficiramo kulture E. coli. Budui da svaka estica faga stvara odvojeni plak, mogue je
izolirati rekombinantne molekule koje sadravaju samo jedan specifini fragment DNA
ovjeka. Rekombinantne vektore koji sadravaju specifini gen koji nas zanima mogue je
identificirati hibridizacijom nukleinskih kiselina ili nekim drugim metodama pretraivanja
(opisano u nastavku ovoga poglavlja).
Plazmidni vektori (slika 3.20) omoguuju lake rukovanje kloniranim DNA molekulama od
bakteriofagnih vektora. Plazmidi su male krune molekule DNA koje u bakterijskim
stanicama postoje kao slobodne molekule (nisu integrirane u bakterijski "kromosom") te se
umnoavaju neovisno od kromosomske DNA. Sve to je potrebno imati u plazmidnoj DNA je
ishodite replikacije (slijed nukleotida koji DNA-polimerazu stanice domaina upuuje da
replicira stranu molekulu DNA). Osim ishodita replikacije, plazmidni vektori sadravaju
gene za rezistenciju na antibiotike (primjerice rezistenciju na ampicilin) koji omoguuju
odabir bakterija s rekombinantnim plazmidom. Veliina plazmidnih vektora obino je izmeu
2 i 4 kb DNA, to je znaajno manje od veliine DNA vektora (30 do 45 kb) i stoga
olakava analizu ugraenoga fragmenta DNA.
Da bi bio kloniran u plazmidnom vektoru fragment DNA se ugrauje u odgovarajue
restrikcijsko mjesto na vektoru i tako nastalom rekombinantnom molekulom transformira se
E. coli. Da bi se odreeni fragment DNA klonirao u plazmidni vektor on se najprije mora
ugraditi u odgovarajue restrikcijsko mjesto na tom vektoru, a zatim se tako nastalom
rekombiniranom molekulom transformira bakterija E. coli. Zatim se odabiru kolonije koje su
rezistentne na antibiotik jer one sadravaju plazmidnu DNA. Bakterije u kojima se nalaze
plazmidi mogue je sad umnoiti u eljenim koliinama i iz njih izolirati DNA. Male krune
molekule plazmidne DNA, kojih esto ima vie stotina u svakoj stanici, mogue je razdvojiti

www.perpetuum-lab.com

11

od kromosomske DNA bakterija. Rezultat je proiena plazmidna DNA koja je prikladna za

daljnju analizu ugraenoga fragmenta DNA.
Brojne analize genomske DNA zahtijevaju kloniranje fragmenata DNA veih no to ih mogu
prihvatiti vektori. Za tu se namjenu koriste pet glavnih tipova vektora (tabl. 3.3). Kozmidni
vektori mogu prihvatiti umetke veliine oko 45 kb. Ovi vektori sadravaju DNA bakteriofaga
koja omoguuje uinkovitu ugradnju klonirane DNA u estice faga. Kozmidni vektori
sadravaju i ishodite replikacije i gene za rezistenciju na antibiotike svojstvene plazmidima,
pa se mogu replicirati kao plazmidi u bakterijskim stanicama. Druga dva tipa vektora
izvedena su pak iz bakteriofaga P1 i mogu prihvatiti fragmente DNA veliine od 70 do 100
kb. Sadravaju sekvence koje omoguujeju in vitro ugradnju rekombinantne DNA u estice
P1 faga, a u bakteriji E. coli se mogu neovisno replicirati poput plazmida. Takozvani P1
umjetni kromosomi (PAC engl. P1 artificial chromosome) takoer sadravaju sekvence
bakteriofaga P1, ali se u bakteriju E. coli unose izravno kao plazmidi, a prihvaaju fragmente
DNA veliine od 130 do 150 kb. Bakterijski umjetni kromosomi (BAC engl. bacterial
artificial chromosome) su vektori izvedeni iz prirodnog plazmida koji nalazimo u E. coli
(nazivamo ga F faktor). Ishodite replikacije i ostale redoslijede F faktora omoguuju BAC da
se replicira kao stabilni plazmid ak i uz umetke od 120 do 300 kb. Jo vee fragmente DNA
(250 400 kb) mogue je klonirati u vektoru koji nazivamo umjetni kromosom kvasca
(YAC engl. yeast artificial chromosome). Ti vektori sadravaju ishodite replikacije kvasca i
neke druge elemente (centromere i telomere, vidi Poglavlje 4) koji im omoguuju da se
repliciraju u stanicama kvasca kao linearne molekule sline kromosomima.
Sekvenciranje DNA
Molekularno kloniranje omoguuje izolaciju pojedinanih fragmenata DNA u koliinama koje
su prikladne za detaljnu karakterizaciju i odreivanje slijeda nukleotida. Odreivanje slijeda
nukleotida brojnih gena otkrilo je strukture njihovih proteinskih produkata, a razjasnilo je i
svojstva DNA sekvenci koje reguliraju njihovu ekspresiju. tovie, slijed nukleotida u
kodirajuim regijama novih gena esto je srodan slijedu nukleotida u nekim ve otprije
poznatim genima pa je funkciju novo otkrivenih gena esto mogue prepoznati na osnovi
slinosti u sekvencama.
Suvremene metode sekvenciranja DNA su brze i tone pa je danas odreivanje slijeda
nukleotida DNA od nekoliko kilobaza razmjerno jednostavan zadatak. Stoga je neusporedivo
jednostavnije klonirati i sekvencirati DNA nego to je odrediti slijed aminokiselina u proteinu
kojeg taj gen kodira. Budui da slijed nukleotida u genu moemo izravno prevesti u slijed
aminokiselina u proteinu, najlaki nain odreivanja primarne strukture proteina je
sekvenciranje kloniranoga gena ili cDNA.
Najea metoda za sekvenciranje DNA zasniva se na preuranjenom prestanku sinteze DNA
zbog ugradnje dideoksinukleotida (koji nemaju 3' OH skupinu na deoksiribozi) koji
prekidaju sintezu DNA lanca DNA-polimerazom (slika 3.21). Sinteza DNA zapoinje
poetnicom koja je na jednom kraju obiljeena radioizotopom. Provode se etiri neovisne
reakcije od kojih svaka osim normalnih nukleotida sadrava i po jedan od dideoksinukleotida
(A, C, G ili T). Ugradnja dideoksinukleotida zaustavlja sintezu DNA jer je 3' OH skupina
nuna za vezanje sljedeeg nukleotida. Na taj nain nastaje serija obiljeenih molekula DNA
koje sve zavravaju bazom koja odgovara dideoksinukleotidu koritenom u toj reakciji. Ti se
fragmenti DNA zatim razdvajaju prema veliini gel-elektroforezom i detektiraju izlaganjem
gela filmu osjetljivom na X-zrake (autoradiografija). Veliina svakog fragmenta odreena je

www.perpetuum-lab.com

12

poloajem na koji se ugradio dideoksinukleotid, stoga slijed nukleotida u DNA odgovara

redoslijedu fragmenata koji proitamo s gela.
Sekvenciranje DNA esto se izvodi i pomou automatiziranih sustava koji koriste
fluorescentno obiljeene poetnice u reakciji ugradnje dideoksinukleotida (slika 3.22).
Novosintetizirani lanci DNA izlaze iz gela za elektroforezu i prolaze kroz lasersku zraku koja
pobuuje fluorescentni biljeg. Emitiranu svjetlost oitava fotomultiplikator, a raunalo
prikuplja i analizira podatke. Takva automatizacija jako je ubrzala sekvenciranje to je bilo
potrebno za odreivanje slijeda nukleotida cjelokupnoga genoma ovjeka, kao i genoma
brojnih bakterija, gljivica, vrsta poput Arabidopsis thaliana, Chaernobis elegans, Drosophila
melanogaster, te mia.
Ekspresija kloniranih gena
Osim odreivanja slijeda nukleotida pojedinoga gena, te stoga i slijeda aminokiselina u
njegovom proteinskom produktu, molekularno kloniranje je omoguilo pripravu velikih
koliina proteina za strukturna i funkcionalna ispitivanja. Veina proteina prisutna je u vrlo
malim koliinama u eukariotskim stanicama, stoga je konvencionalnim biokemijskim
metodama nemogue pripraviti vee koliine tih proteina. Meutim, kad jednom imamo
klonirani gen, taj problem moemo rijeiti koristei posebno dizajnirane vektore koji
omoguuju snanu ekspresiju kloniranoga gena u bakterijskim ili eukariotskim stanicama.
Da bismo eksprimirali eukariotski gen u E. coli, eljenu cDNA kloniramo u plazmidni ili
fagni vektor (nazivamo ga ekspresijski vektor). Vektor sadrava sekvence koje potiu
prepisivanje i prevoenje umetnutoga gena u bakterijskim stanicama (slika 3.22). Klonirani
gen esto moe biti tako jako eksprimiran da njegov proteinski produkt predstavlja i do 10%
ukupnih proteina bakterije. Nakon toga je proiavanje proteina kodiranoga kloniranim
genom u koliinama potrebnim za detaljna biokemijska ili strukturna ispitivanja jednostavan
zadatak.
esto je potrebno klonirani gen eksprimirati u eukariotskim stanicama umjesto u bakterijama.
Taj oblik ekspresije vaan je da bismo, primjerice, osigurali normalno odvijanje
posttranslacijskih modifikacija proteina (kao to su dodatak ugljikohidrata ili lipida). Sinteza
stranih proteina u eukariotskim stanicama postie se (analogno postupku s E. coli) ugradnjom
kloniranoga gena u vektor (obino izveden od virusa) koji omoguuje visoku razinu
ekspresije toga gena. Sustav koji se esto koristi za proizvodnju rekombinantnih proteina u
eukariotskim stanicama je infekcija insektnih stanica bakulovirusnim vektorima koji
omoguuju visoku razinu ekspresije gena umetnutih na mjesto gena za strukturne proteine
virusa. Visoku razinu ekspresije kloniranih gena mogue je postii i u stanicama sisavaca uz
pomo odgovarajuih vektora. Takoer je praktino klonirani gen eksprimirati u kvascu zbog
mogunosti primjene i jednostavnih metoda genetike kvasca za ispitivanje interakcija
kloniranog proteina s drugim proteinima ili specifinim slijedovima DNA.
Umnoavanje DNA lananom reakcijom polimeraze
Molekularno kloniranje omoguuje pripravu velikih koliina specifinih DNA fragmenata
umnoavanjem i izolacijom iz bakterija. Alternativni pristup za pripravu velike koliine neke
DNA molekule je lanana reakcija polimeraze (PCR, engl. polymerase chain reaction), koju
je 1988. godine razvio Kary Mullis. Ukoliko je poznat dio slijeda nukleotida u nekoj molekuli
DNA, lananom reakcijom polimeraze mogue je u potpunosti in vitro pripraviti goleme
koliine te molekule. Osnova metode je opetovano umnaanje odreenog segmenta DNA
pomou DNA-polimeraze. Broj molekula DNA dvostruko je vei nakon svakoga kruga

www.perpetuum-lab.com

13

umnaanja i poveava se eksponencijalno, te je iz maloga broja kopija molekula kalupa koje

su prisutne na poetku reakcije mogue pripraviti veliku koliinu DNA. Primjerice, iz jedne
e molekule DNA nakon 30 ciklusa umnaanja teorijski nastati 2 30 (priblino milijardu)
identinih kopija. To znai da je jednu jedinu molekulu DNA mogue umnoiti do koliine
koja je potrebna za molekularno kloniranje, analizu razgradnjom restrikcijskim
endonukleazama, ili odreivanje slijeda nukleotida.
Osnova metode za umnaanje DNA lananom reakcijom polimeraze prikazana je na slici
3.24. Poetni materijal moe biti klonirani fragment DNA ili pak smjesa razliitih molekula
DNA, primjerice ukupni ekstrakt DNA stanica ovjeka. Da bismo mogli umnoiti eljeni
segment DNA, moramo poznavati slijed nukleotida koji ga okruuju kako bismo mogli
kreirati specifine poetnice koje e zapoeti sintezu DNA na eljenim mjestima. Te poetnice
su najee kemijski sintetizirane molekule DNA duljine od 15 do 20 nukleotida. Koriste se
dvije poetnice koje e zapoeti sintezu u suprotnim smjerovima na dva komplementarna
lanca DNA. Reakcija zapoinje zagrijavanjem kalupa na visoku temperaturu (primjerice 95
C) kako bi se razdvojila dva lanca DNA. Temperatura se tada snizuje kako bi se omoguilo
poetnicama da se specifino poveu s komplementarnim sljedovima na lancima kalupa.
DNA-polimeraza tada sintetizira lanac DNA komplementaran kalupu poevi od specifino
povezanih poetnica. U jednom ciklusu umnoavanja iz svake molekule kalupa nastaju po
dvije nove identine molekule DNA. Ovaj je proces mogue ponoviti velik broj puta, a u
svakom e se ciklusu broj molekula DNA udvostruiti.
Viestruki uzastopni ciklusi grijanja i hlaenja, koji su sastavni dio lanane reakcije
polimeraze, provode se u posebnim termoblokovima koje je mogue programirati, a nazivamo
ih termocikleri. Enzimi koje koristimo u lananoj reakciji polimeraze su stabilni i na visokim
temperaturama kojima razdvajamo lance DNA molekule. Naime, ovi su termostabilni enzimi
izolirani iz bakterija poput Termus aquaticus koje ive u termalnim izvorima na
temperaturama od priblino 75 C. Takve su polimeraze stabilne i na visokim temperaturama
kojima razdvajamo lance dvolanane DNA, pa je umnaanje DNA lananom reakcijom
polimeraze mogue jednostavno provesti. Na ovaj je nain takoer mogue umnoiti RNA
molekule ukoliko prije lanane reakcije polimeraze napravimo cDNA kopiju molekule RNA
reverznom-transkriptazom.
Ukoliko je slijed nukleotida nekoga gena poznat u dovoljnoj mjeri da moemo pripremiti
odgovarajue poetnice, lanana reakcija polimeraze iznimno je mona metoda za pripravu
velikih koliina DNA iz poetnog materijala koji moe sadravati svega nekoliko traenih
molekula DNA u smjesi velikog broja razliitih drugih molekula DNA. Primjerice, ciljane
sekvence duljine i do nekoliko kilobaza mogue je umnoiti iz ukupne genomske DNA, a
jednu je cDNA mogue umnoiti iz ukupne stanine RNA. Takve je umnoene dijelove DNA
mogue dalje obraivati ili analizirati, primjerice da bismo otkrili mutacije u genu koji nas
zanima. Lanana reakcija polimeraze stoga znaajno pridonosi repertoaru metoda
rekombinantne DNA. Njezina je snaga posebice izraena u dijagnostici nasljednih bolesti,
ispitivanju ekspresije gena tijekom razvoja i u sudskoj medicini.

www.perpetuum-lab.com

14

3.4. Detekcija nukleinskih kiselina i proteina

Razvoj molekularnoga kloniranja omoguio je izolaciju i karakterizaciju pojedinanih gena iz
eukariotskih stanica, no za razumijevanje njihove uloge u stanicama bilo je potrebno
analizirati i razumjeti brojne procese kao to su primjerice regulacija ekspresije, ili
unutarstanina organizacija proteina koje oni kodiraju. U ovom emo poglavlju prikazati
temeljne metode koje se danas primjenjuju za detekciju specifinih nukleinskih kiselina i
proteina. Te su metode vane za razliita istraivanja kao to su, primjerice, kartiranje gena na
kromosomima, analiza ekspresije gena i odreivanje smjetaja proteina u unutarstaninim
organelima. Iste temeljne metode koriste se i za izolaciju pojedinih gena kao molekularnih
klonova.
Hibridizacija nukleinskih kiselina
Osnova detekcije specifinih redoslijeda nukleinskih kiselina je sparivanje baza izmeu
komplementarnih niti RNA ili DNA. Pri visokim se temperaturama (90 100 C)
komplementarni lanci DNA razdvajaju i nastaju jednolanane molekule. Kaemo da se DNA
denaturirala. Ako takve denaturirane molekule DNA inkubiramo na odgovarajuoj
temperaturi (primjerice 65 C), renaturirat e se u dvolanane molekule na osnovi
komplementarnog sparivanja baza. Taj proces ponovnog uspostavljanja dvolanane strukture
nazivamo hibridizacijom nukleinskih kiselina. Hibridne nukleinske kiseline mogu stvoriti
dva lanca DNA, dva lanca RNA ili jedan lanac DNA i jedan lanac RNA.
Hibridizacija nukleinskih kiselina omoguuje detekciju molekula DNA ili RNA koje su
komplementarne bilo kojoj izoliranoj nukleinskoj kiselini kao to je primjerice virusni genom
ili klonirani gen (slika 3.25). Klonirana DNA je radioaktivno obiljeena, najee time to je
sintetizirana u prisutnosti radioaktivno obiljeenih nukleotida. Takva se radioaktivna DNA
tada koristi kao sonda za hibridizaciju s komplementarnim DNA ili RNA sekvencama, koje
onda detektiramo zahvaljujui radioaktivnosti dvolananih hibrida.
Southern blot (tehnika koju je razvio E. M. Southern) je iroko rasprostranjena metoda za
detekciju specifinih gena u staninoj DNA (slika 3.26). DNA koju analiziramo razgraujemo
restrikcijskim endonukleazama i nastale fragmente DNA razdvajamo gel-elektroforezom. Na
gel se tada stavlja nitrocelulozna ili najlonska membrana na koju se prenose (blotaju)
fragmenti DNA. Tako pripravljena replika gela inkubira se s radioaktivnom sondom koja se
hibridizira s fragmentima DNA koji sadravaju komplementarne sljedove nukleotida. Poloaj
tih fragmenata postaje vidljiv nakon izlaganja blota filmu osjetljivom na X-zrake.
Kad umjesto molekula DNA elimo detektirati molekule RNA koristimo varijaciju Southern
blot metode koju nazivamo Northern blot (ime metode izabrano je prema analogiji s
engleskim znaenjem rijei south jug; north sjever, o.p.). U ovoj se metodi ukupna
stanina RNA izolira i razdvoji prema veliini gel-elektroforezom. Kao i u Southern blotu,
RNA se prenosi na membranu i detektira hibridizacijom s radioaktivno obiljeenom sondom.
Northern blot se esto koristi za analizu ekspresije gena, primjerice, elimo li utvrditi je li
specifina mRNA prisutna u razliitim tipovima stanica.
Umjesto analize jednog po jednog gena to rade Southern i Northern blot metode,
hibridizacija s DNA mikroipovima omoguuje istovremenu analizu desetina tisua gena.
Kako cjeloviti genomi eukariota postaju poznati, hibridizacija s DNA mikroipovima prua
znanstvenicima priliku za globalnu analizu sekvenci prisutnih u uzorcima stanine RNA ili
DNA. DNA mikroip sastoji se od predmetnog stakalca ili membrane na koju su fragmenti

www.perpetuum-lab.com

15

cDNA robotiziranim sustavima utisnuti u velikom broju malih tokica visoke gustoe (slika
3.27). U svakoj se toki na mikroipu nalazi jedan oligonukleotid ili cDNA. Na klasino
predmetno mikroskopsko stakalce mogue je utisnuti vie od 100.000 razliitih
oligonukleotida, to omoguuje pripravu DNA mikroipova koji pokrivaju cjelokupne
genome. Kao to je prikazano na slici 3.27, DNA mikroipova mogue je primijeniti za
analizu ekspresije gena, primjerice za usporeivanje gena koje eksprimiraju dva razliita tipa
stanica. U eksperimentima ovog tipa sintetiziraju se cDNA probe od ukupne mRNA koja je
eksprimirana u dva tipa stanica (primjerice tumorskim i normalnim stanicama). Te dvije
skupine cDNA obiljeavaju se razliitim fluorescentnim bojama (obino crvenom i zelenom),
pomijeaju i hibridiziraju s mikroipovima na kojima se nalazi 10.000 ili vie humanih gena
predstavljenih kao pojedinane tokice. DNA mikroip tada se analizira laserskim itaem
visoke rezolucije, a relativni omjeri transkripcije nekoga gena u tumorskim i normalnim
stanicama odgovaraju omjeru crvene i zelene fluorescencije na odgovarajuim tokicama na
DNA mikroipu.
Osim u ekstraktima stanica, hibridizacijom nukleinskih kiselina moemo homologne DNA ili
RNA molekule detektirati i na kromosomima ili intaktnim stanicama. Metodu nazivamo
hibridizacija in situ, a u njoj radioaktivno ili fluorescentno obiljeenu sondu hibridiziranu na
specifinim staninim ili substaninim strukturama analiziramo mikroskopom (slika 3.28).
Primjerice obiljeene je sonde mogue hibridizirati s intaktnim kromosomima kako bismo
odredili podruja kromosoma koja sadravaju gene koji nas interesiraju. Hibridizacijom in
situ takoer moemo detektirati specifine mRNA u razliitim tipovima stanica u tkivu.
Detekcija malih koliina DNA ili RNA lananom reakcijom polimeraze
Amplifikacija DNA lananom reakcijom polimeraze daleko je osjetljivija metoda od detekcije
staninih DNA ili RNA sekvenci Southern ili Northern blot metodom. Dok je za hibridizaciju
na blotu potrebno priblino 100.000 kopija neke DNA ili RNA molekule, lanana reakcija
polimeraze moe umnoiti jednu jedinu kopiju DNA (ili RNA nakon obrnutog prepisivanja)
do razine koja se moe lako detektirati.
Kao to je ve opisano, specifinost umnoavanja u lananoj reakciji polimeraze postie se
primjenom oligonukleotidnih poetnica koje se hibridiziraju s komplementarnim sekvencama
na molekulama kalupa. Na taj nain lanana reakcija polimeraze moe selektivno umnoiti
specifinu molekulu DNA u sloenim smjesama kao to su primjerice ukupna stanina DNA
ili RNA. Zbog toga je lananu reakciju polimeraze mogue primijeniti za detekciju specifine
molekule DNA ili RNA u vrlo malim koliinama poetnog materijala, primjerice iz jedne
jedine stanice. Ovakva neuobiajena osjetljivost omoguila je primjenu lanane reakcije
polimeraze u brojnim podrujima, ukljuujui i analizu ekspresije gena stanicama koje
moemo pribaviti samo u ogranienim koliinama.
Protutijela kao sonde za proteine
Ispitivanje ekspresije i funkcije gena zahtijeva detekciju ne samo DNA i RNA, ve i
specifinih proteina. U tim ispitivanjima protutijela preuzimaju ulogu sondi kojima moemo
selektivno reagirati s pojedinim proteinima. Protutijela su proteini koje proizvode stanice
imunosustava (B-limfociti) koje reagiraju protiv molekula (antigena) koje organizam
domaina prepoznaje kao strane, primjerice proteinski omota virusa. Imunosustav
kraljenjaka sposoban je stvoriti milijune razliitih protutijela od kojih svako prepoznaje
jedinstveni antigen (protein, ugljikohidrat ili neku drugu molekulu koja nije prirodnog
podrijetla). Jedan limfocit proizvodi samo jedan tip protutijela, no zbog programiranog
preureivanja gena tijekom razvoja imunosustava, geni koji kodiraju protutijela razlikuju se

www.perpetuum-lab.com

16

od limfocita do limfocita (vidi Poglavlje 5). Ove varijacije rezultiraju velikim brojem
razliitih protutijela koja proizvode razliiti limfociti programirani da odgovore na razliite
antigene.
Proizvodnju protutijela mogue je potaknuti imunizacijom ivotinje nekim stranim proteinom.
Primjerice, protutijela koja prepoznaju proteine ovjeka esto se proizvode u kuniu. U
serumima takvih ivotinja nalaze se smjese protutijela (koja proizvode razliiti limfociti) koja
reagiraju s razliitim dijelovima molekule antigena kojim je ivotinja imunizirana.
Pojedinana protutijela (monoklonska protutijela) mogue je proizvesti uzgajajui u kulturi
klonalne linije B-limfocita izoliranih iz imuniziranih ivotinja (najee mia). Kako je svaki
limfocit programiran da proizvodi samo jedno protutijelo, klonalne linije limfocita proizvode
monoklonska protutijela koja sva prepoznaju istu antigenu determinantu, te su stoga vrlo
specifino imunoloko orue.
Iako se najee proizvode protutijela koja prepoznaju proteine proiene iz stanica, mogui
su i neki drugi oblici imunizacije. Primjerice, ivotinje je mogue imunizirati intaktnim
stanicama kako bi proizvele protutijela na nepoznate proteine koji su eksprimirani u
odreenim vrstama stanica (primjerice tumorskim). Takva je protutijela onda mogue
iskoristiti za identifikaciju proteina koji su specifini za vrstu stanica koja je koritena za
imunizaciju. Protutijela se esto proizvode i na rekombinantne proteine eksprimirane u
bakterijama. Na ovaj nain molekularno kloniranje omoguuje proizvodnju protutijela na
proteine koje je gotovo nemogue u dostatnim koliinama proistiti iz eukariotskih stanica.
Osim na cjelovite proteine, protutijela je mogue razviti i na sintetike peptide od svega 10 do
15 aminokiselina. Ukoliko je poznat slijed nukleotida u nekom genu, mogue je razviti
protutijela na sintetike peptide iji je slijed aminokiselina izveden iz dijela sekvence toga
gena. Budui da takva protutijela proizvedena na sintetike peptide esto prepoznaju i
cjeloviti protein, za uspjenu nam je proizvodnju protutijela na neki protein dovoljno
poznavati slijed nukleotida kloniranoga gena.
Protutijela moemo na razne naine primijeniti za detekciju proteina u staninim ekstraktima.
Dvije uobiajene metode su imunoblot (poznat i kao Western blot) i imunoprecipitacija.
Western blot (slika 3.29) je jo jedna varijacija Southern blot metode. Proteini u ekstraktima
stanica isto se prvo razdvajaju prema veliini gel-elektroforezom, no kako su proteini razliiti
oblikom i nabojem, ovaj je proces neto drugaiji od elektroforeze nukleinskih kiselina.
Proteine razdvajamo metodom koju nazivamo SDS-poliakrilamidna gel-elektroforeza
(SDS-PAGE) u kojoj su proteini otopljeni u otopini koja sadrava negativno nabijeni
detergent natrij-dodecilsulfat (SDS). Na svaki se protein vee velik broj molekula detergenta
koje ga denaturiraju i daju mu ukupni negativni naboj. Pod tim uvjetima svi proteini putuju
prema pozitivnoj elektrodi, a brzina putovanja (kao i kod nukleinskih kiselina) odreena je
samo njihovom veliinom. Nakon elektroforeze proteini se prenose na membranu i zatim
inkubiraju s protutijelima koja prepoznaju eljeni protein. Protutijela vezana na membranu
mogue je detektirati razliitim metodama, a to onda otkriva i protein na koji su se ta
protutijela vezala.
Imunoprecipitaciju koristimo kako bismo izolirali proteine koje prepoznaju specifina
protutijela (slika 3.30). Stanice se najee uzgajaju u prisutnosti radioaktivno obiljeene
aminokiseline kako bismo dobili radioaktivno obiljeene proteine. Takvi radioaktivni ekstrakti
stanica inkubiraju se s protutijelima koja se veu na ciljne proteine protiv kojih su razvijena
(antigene). Nastali kompleksi protutijelo-antigen izoliraju se i analiziraju elektroforezom to
omoguuje detekciju radioaktivno obiljeenog antigena autoradiografijom.

www.perpetuum-lab.com

17

Kao to je ve prikazano u Poglavlju 1, protutijelima moemo vizualizirati proteine unutar

stanica, a i u lizatima stanica. Primjerice, stanice moemo obojiti protutijelima obiljeenim
fluorescentnim bojama, a unutarstaninu lokalizaciju antigenih proteina moemo analizirati
fluorescentnim mikroskopom (vidi sliku 1.28). Protutijela je mogue obiljeiti i biljezima koji
su vidljivi pod elektronskim mikroskopom, primjerice tekim metalima, to omoguuje
ispitivanja i na ultrastrukturnoj razini.
Sonde za pretraivanje knjinica rekombinantne DNA
Iste metode koje koristimo za detekciju nukleinskih kiselina i proteina u ekstraktima stanica
primjenjujemo i za otkrivanje molekularnih klonova koji sadravaju umetnute specifine
fragmente stanine DNA. Primjerice hibridizaciju nukleinskih kiselina moemo primijeniti da
identificiramo genomski ili cDNA klon koji sadrava sekvence DNA za koje postoje
odgovarajue sonde. Ukoliko je cDNA klonirana u ekspresijski vektor, mogue ju je
identificirati koristei protutijela koja prepoznaju proteine kodirane u toj cDNA.
Prvi korak u izolaciji genomskog ili cDNA klona esto je priprava knjinice rekombinantne
DNA, zbirke klonova koji sadravaju sve genomske ili mRNA sekvence odreenog tipa
stanica (slika 3.31). Primjerice genomsku knjinicu DNA ovjeka mogue je pripraviti
klonirajui nasumine fragmente veliine oko 15 kb u vektor. Kako je veliina genoma
ovjeka oko 3106 kb, DNA ekvivalent jednoga genoma bio bi predstavljen s 200.000 takvih
klonova. Zbog statistikih fluktuacija u uzorkovanju, u knjinici od 200.000 klonova mnogi
geni ne bi bili prisutni, a neki bi bili prisutni u vie klonova. Zbog toga se, kako bismo postigli
visoku vjerojatnost da e svaki gen biti predstavljen u knjinici, obino pripravljaju vee
knjinice od priblino milijun rekombinantnih bakteriofaga.
Bilo koji gen za koji postoji odgovarajua sonda mogue je lagano izolirati iz takve
rekombinantne knjinice. Rekombinantne bakteriofage nasaujemo na E. coli i svaki se fag
umnoava i stvara plak na bakterijskoj livadi. Plakovi se tada prenose na membrane u procesu
slinom prijenosu DNA s gela na membranu u Southern blot metodi i zatim hibridiziraju s
radioaktivno obiljeenom sondom radi otkrivanja plakova faga koji sadravaju eljeni gen.
Odgovarajue rekombinantne bakteriofage tada je mogue izolirati s originalne ploice i
umnoiti eljeni umetak stanine DNA. Na slian je nain mogue pretraivati i bakterijske
kolonije koje nose plazmidne DNA klonove, te je specifine klonove mogue hibridizacijom
izolirati i iz fagnih i iz plazmidnih knjinica gena.
Rekombinantne knjinice mogue je pretraivati razliitim sondama. Primjerice cDNA klon
mogue je koristiti kao sondu za izolaciju odgovarajuega genomskog klona, a genom
kloniranim iz jednog organizma (primjerice mia) mogue je izolirati srodni gen iz neke druge
vrste (primjerice ovjeka). Osim izoliranih fragmenata DNA, sonde mogu biti i sintetiki
oligonukleotidi to omoguuje izolaciju gena na osnovi djelomino poznatog slijeda
aminokiselina u proteinima koje kodiraju. Primjerice, na osnovi djelomino poznatog slijeda
aminokiselina u nekom proteinu mogue je sintetizirati oligonukleotide duljine od 15 do 20
baza. Ovim je sondama sad mogue izolirati cDNA klonove koje je (kao to smo ve
prikazali) puno lake sekvencirati i karakterizirati nego sam protein. Na ovaj je nain mogue
eksperimentalno doi do izoliranoga i kloniranoga gena poevi od svega djelomino
poznatog slijeda aminokiselina u proteinu.
Alternativni pristup izolaciji gena poevi od njihova proteinskog produkta je pretraivanje
ekspresijskih knjinica pomou specifinih protutijela. U tom se sluaju cDNA knjinica

www.perpetuum-lab.com

18

pripravlja u ekspresijskom vektoru koji potie sintezu proteina u E. coli. Bakterijske se

kolonije zatim prenose na membranu, a klonovi koji proizvode eljeni protein otkrivaju
protutijelima (kao u Western blot metodi).
Prikazane metode za identifikaciju molekularnih klonova i otkrivanje gena i genskih
produkata u stanicama oslikavaju fleksibilnost rekombinantne DNA tehnologije. Poevi s
nekim kloniranim genom, mogue je ne samo odrediti slijed nukleotida u tom genu i koristiti
ga kao sondu za ispitivanje organizacije i prepisivanja gena, ve i eksprimirati protein kojeg
taj gen kodira i na njega proizvesti specifina protutijela. S druge strane koristei se
oligonukleotidnim sondama ili protutijelima mogue je klonirati gene na osnovi samo
djelomino poznate strukture nekoga proteina. Rekombinantnom DNA tehnologijom mogue
je eksperimentalnu analizu razvijati ili od DNA prema proteinima, ili od proteina prema DNA
to omoguuje veliku fleksibilnost strategija koje se danas primjenjuju za ispitivanje
eukariotskih gena i proteina koje oni kodiraju.

www.perpetuum-lab.com

19

3.5. Funkcija gena u eukariotima

Tehnologija rekombinantne DNA, prikazana u prethodnim odlomcima, mono je orue za
detaljnu karakterizaciju gena eukariotskih genoma. Ipak, za razumijevanje funkcije gena nije
dovoljna analiza molekularnih klonova u bakterijama, ve je nuna analiza gena unutar
stanica ili cjelovitog organizma. U klasinoj se genetici funkcija gena utvruje na temelju
promijenjenog fenotipa mutiranih organizama. Razvoj rekombinantne DNA tehnologije
otvorio je novu dimenziju u analizi funkcije gena na taj nain to je omoguio izravnu analizu
kloniranoga gena njegovim ponovnim unoenjem u eukariotsku stanicu. Kod jednostavnijih
eukariota, kao to su primjerice kvasci, rekombinantna DNA tehnologija omoguila je
izolaciju molekularnih klonova koji odgovaraju praktino svakom mutiranom genu. Postoje i
tehnike koje omoguujeju unoenje kloniranih gena u ivotinjske i biljne stanice u kulturi, kao
i u cjelovite organizme, te njihovu funkcionalnu analizu. Kombinacija ovakvog pristupa sa
sposobnou uvoenja mutacija u kloniranu DNA in vitro proiruje mogunosti
rekombinantne DNA tehnologije u ispitivanju funkcije eukariotskih gena.
Genetike analize u kvascima
Kvasci su posebice pogodni organizmi u istrazivanjima molekularne biologije eukariota (vidi
Poglavlje 1). Genom kvasca Saccharomyces cerevisiae sastoji se od priblino 1,2 107 parova
baza i 200 je puta manji od genoma ovjeka. Kvasce je lagano uzgajati u kulturi gdje se
udvostruuju priblino svaka 2 sata, te nam stoga kvasci pruaju neke od temeljnih prednosti
koje pruaju i bakterije (mali genom i brzo razmnoavanje).
Mutacije je u kvascima jednako lako otkriti kao i u E. coli. Primjerice, lako je izolirati
mutante kvasaca koje zahtijevaju odreenu aminokiselinu ili neki drugi hranidbeni
nadomjestak u podlozi na kojoj rastu. Osim toga, kvasce s pogrekama u genima potrebnim za
temeljne stanine procese (za razliku od metabolikih pogreaka) mogue je izolirati kao
mutante osjetljive na temperaturu. Takve mutante kodiraju proteine koji su funkcionalni na
jednoj temperaturi (permisivna temperatura), ali ne i na nekoj drugoj temperaturi
(nepermisivna temperatura), dok normalni kvasci proizvode normalne proteine koji su
funkcionalni i na jednoj i na drugoj temperaturi. Kvasac s mutacijom osjetljivom na
temperaturu u nekom kljunom genu mogue je otkriti zahvaljujui selektivnom rastu na
odreenoj temperaturi. Sposobnost izolacije mutacija osjetljivih na temperaturu omoguila je
otkrivanje kvaevih gena koji kontroliraju brojne temeljne stanine procese, kao to je
primjerice sinteza i procesiranje RNA, napredovanje kroz stanini ciklus ili transport proteina
izmeu staninih odjeljaka.
Razmjerno jednostavna genetika kvasca omoguuje kloniranje gena koji odgovara bilo kojoj
mutaciji na osnovi njezine funkcionalne aktivnosti (slika 3.32). U prvom se koraku pripravlja
genomska knjinica normalne DNA kvasca u vektorima koji se umnaaju kao plazmidi i u
kvascu i u E. coli. Zbog razmjerno maloga genoma kvasca cjelokupna se knjinica sastoji od
svega nekoliko tisua plazmida. Mutante kvasca osjetljive na temperaturu zatim se
transformiraju smjesom takvih plazmida i izabiru se transformirani kvasci koji su stekli
sposobnost rasta na nepermisivnoj temperaturi. Transformirani kvasci sadravaju normalnu
kopiju traenoga gena na plazmidnoj DNA koju je zatim jednostavno izolirati u svrhu daljnje
karakterizacije.
Na ovaj su nain izolirani geni koji kodiraju razne kljune proteine kvasaca. U mnogim su
sluajevima tako izolirani geni kvasaca omoguili identifikaciju i kloniranje srodnih gena iz
stanica sisavaca. Dakle, osim to je pruila vaan modelni sustav za ispitivanje eukariotskih

www.perpetuum-lab.com

20

stanica, jednostavna genetika kvasaca omoguila je i kloniranje srodnih gena sloenijih

eukariota.
Prijenos gena u biljke i ivotinje
Za razliku od stanica kvasaca, stanicama viih eukariota nije mogue genetiki manipulirati
na jednostavan nain, no i u njima je mogue ispitivati funkcije gena unoenjem klonirane
DNA. Takvi su se eksperimenti (openito ih nazivamo prijenosom gena) pokazali kljunim
za ispitivanje brojnih vanih procesa, kao to su primjerice mehanizmi koji reguliraju
ekspresiju gena ili procesiranje proteina. Kao to e biti prikazano kasnije u ovoj knjizi,
prijenos gena omoguio je otkrivanje i karakterizaciju gena koji kontroliraju rast i
diferencijaciju ivotinjskih stanica, ukljuujui brojne gene odgovorne za nenormalni rast
tumorskih stanica.
Metodologija unosa DNA u ivotinjske stanice prvo je razvijena za unos infektivne virusne
DNA i stoga se esto naziva transfekcija (rije izvedena iz pojmova transformacija +
infekcija) (slika 3.33). DNA je u ivotinjsku stanicu u kulturi mogue unijeti na vie naina.
Primjerice, izravnom mikroinjekcijom u jezgru stanice, koprecipitacijom DNA s kalcijevim
fosfatom u sitne estice koje spontano ulaze u stanice, ugradnjom DNA u lipidne vezikule
(liposome) koji se spajaju sa staninom membranom, ili izlaganjem stanica kratkim
elektrinim pulsevima koji privremeno otvaraju pore u staninoj membrani (elektroporacija).
Strana DNA se na taj nain moe unijeti u velik broj stanica i prenijeti u jezgru gdje e se
prepisivati tijekom sljedeih nekoliko dana fenomen koji nazivamo prolazna ekspresija. U
manjem broju stanica (obino 1% ili manje) strana DNA se stabilno ugrauje u stanini
genom i pri diobi stanica prenosi se na stanice keri ba kao i bilo koji drugi stanini gen.
Stabilno transformirane stanice mogue je odabrati ukoliko transfektirana DNA sadrava
biljeg za selekciju, primjerice gen za rezistenciju na inhibitor rasta normalnih stanica. Zajedno
s genom za rezistenciju na inhibitor, u stanice je mogue unijeti bilo koji klonirani gen te
analizirati njegov uinak na ponaanje stanica, primjerice na rast ili diferencijaciju.
Kao vektore za unos klonirane DNA u stanice mogue je koristiti i ivotinjske viruse.
Posebice su pogodni retrovirusi jer njihov normalni ivotni ciklus ukljuuje stabilnu
integraciju virusnoga genoma u genom inficiranih stanica (slika 3.34). Retrovirusi se mogu
koristiti za uinkovit unos kloniranih gena u razliite tipove stanica, to ih ini znaajnim
vektorom sa irokim rasponom primjene.
Klonirane je gene mogue unijeti i u matine linije viestaninih organizama to omoguuje
njihovo ispitivanje in vivo, a ne samo u kulturi stanica. Jedna od metoda je izravna
mikroinjekcija klonirane DNA u pronukleus oploene jajne stanice, a koristi se za stvaranje
mieva koji nose strane gene (transgeninih mieva) (slika 3.35). Injektirana se jajna stanica
prenosi u surogat majku gdje se razvija sve do okota. U oko 10% okoenih mieva strana e
se DNA ugraditi u genom oploene jajne stanice i stoga e biti prisutna u svim stanicama u
organizmu. Budui da je strana DNA prisutna i u spolnim stanicama tih ivotinja, daljnjim
razmnoavanjem prenijet e se na potomstvo ba kao i svaki drugi gen.
Karakteristike embrionalnih matinih (EM) stanica omoguuju alternativni pristup
unoenja kloniranih gena u mia (slika 3.36). EM stanice mogue je uvesti u kulturu iz ranih
mijih embrija, a zatim ih ponovo vratiti u rani miji embrio gdje e normalno sudjelovati u
razvoju i diferencirati se u stanice bilo kojeg tkiva mia, ukljuujui i spolne stanice. Ovaj
pristup omoguuje da u EM stanice u kulturi unesemo kloniranu DNA, te izaberemo one
stanice koje su se stabilno transformirale i unesemo ih u mije embrije. Takvi embriji razvit e

www.perpetuum-lab.com

21

se u kimerne ivotinje u kojima e neke stanice potjecati od normalnih embrionalnih stanica, a

neke od transfektiranih EM stanica. U nekim od tih mieva transfektirane EM stanice razvit e
se u spolne stanice, pa e se njihovim daljnjim razmnoavanjem transfektirani gen izravno
prenositi na potomstvo.
Kloniranu DNA mogue je unijeti i u biljne stanice na razliite naine. Jedan pristup je
unoenje DNA u protoplaste elektroporacijom na isti nain kako je opisano za ivotinjske
stanice. Meutim, pri tome je neophodno prvo ukloniti staninu stijenku kako bismo dobili
stanicu obavijenu samo staninom membranom (protoplast). Alternativno, DNA moe biti
izravno unesena u intaktne biljne stanice bombardiranjem stanica mikroprojektilima oko kojih
je omotana DNA, primjerice malim esticama tungstena. Neke od tih stanica umiru, no ostale
preivljavaju i postaju stabilno transformirane.
Biljni virusi iskoriteni su kao vektori za uinkovit unos rekombinantne DNA u razliite biljke
i biljne stanice. Najpoznatiji takav vektor izveden je iz plazmida prisutnog u bakteriji
Agrobacterium tumefaciens (Ti plazmid) (slika 3.37). U prirodi se Agrobacterium privruje
za lie biljaka, a Ti plazmid se prenosi u biljne stanice gdje se ugrauje u kromosomsku
DNA, to vektore izvedene iz Ti plazmida ini jako uinkovitim za unoenje rekombinantne
DNA u osjetljive biljne stanice. Kako je mnoge biljke mogue regenerirati iz pojedinanih
stanica u kulturi (vidi Poglavlje 1), transgenine je biljke mogue izravno razviti iz stanica u
koje je rekombinantna DNA unesena u kulturi to je daleko jednostavnije od proizvodnje
transgeninih ivotinja.
Mutageneza klonirane DNA
U klasinim je genetikim ispitivanjima, koja koriste bakterije ili kvasce kao modele,
promatranje promijenjenog fenotipa mutiranih organizama klju za otkrivanje gena i
razumijevanje njihove uloge. Naime, mutirani geni otkrivaju se tako jer za posljedicu imaju
vidljivu promjenu fenotipa, primjerice rast osjetljiv na temperaturu ili odreene hranidbene
potrebe. Mogunost izolacije gena rekombinantnom DNA tehnologijom otvorila je novi
pristup mutagenezi. Danas je mogue unijeti bilo koju promjenu u klonirani gen i ispitati
uinke te mutacije na funkciju gena. Takav je postupak nazvan obrnutom genetikom jer se
prvo odreena mutacija unosi u gen, a zatim se promatraju promjene fenotipa. Mogunost
unoenja specifinih mutacija u kloniranu DNA (in vitro mutageneza) pokazala se znaajnim
oruem za ispitivanje ekspresije i funkcije eukariotskih gena.
Klonirane gene mogue je promijeniti razliitim postupcima in vitro mutageneze, a rezultat su
delecije, insercije ili zamjene pojedinih nukleotida. Uobiajena metoda mutageneze je
koritenje sintetikih oligonukleotida za uvoenje promjena u molekulu DNA (slika 3.38). U
ovoj se metodi sintetiki oligonukleotidi koji nose mutiranu bazu koriste kao poetnice za
sintezu DNA. Novosintetiziranu DNA koja sadrava mutaciju mogue je zatim izolirati i
karakterizirati. Primjerice, mogue je promijeniti pojedine aminokiseline u proteinu kako bi se
ispitala njihova uloga u funkciji proteina.
Pomou opisane metode i njezinih varijacija, te zahvaljujui rekombinantnoj DNA tehnologiji
mogue je unijeti praktino bilo kakvu promjenu u klonirani gen. Uinke mutacija na
ekspresiju i funkciju gena mogue je zatim analizirati unoenjem promijenjenoga gena u
odgovarajue stanice. In vitro mutageneza omoguila je detaljno ispitivanje funkcije
kodirajuih, ali i regulatornih podruja kloniranih gena.

www.perpetuum-lab.com

22

Unoenje mutacija u stanine gene

Iako je prijenos kloniranih gena u stanice (posebice u kombinaciji s in vitro mutagenezom)
mono orue za ispitivanje strukture i funkcije gena, takvim eksperimentalnim pristupom nije
mogue odrediti ulogu nepoznatoga gena u stanici ili odreenom organizmu. Stanica s
unesenim kloniranim genom najee jo uvijek sadrava i normalnu kopiju toga gena u
svojoj kromosomskoj DNA, koja nastavlja obavljati svoju normalnu ulogu u stanici. Zbog
toga je potrebno prvo ukloniti aktivnost normalne stanine kopije odreenoga gena da bismo
shvatili bioloku ulogu kloniranoga mutiranoga gena. Kao to je prikazano u sljedeem
odlomku, ovaj je postupak razmjerno jednostavno provesti u kvascima. Iako znaajno
kompliciranije, danas je mogue na nekoliko naina i u ivotinjskim stanicama inaktivirati
kromosomske kopije kloniranoga gena, ili onemoguiti njihovo normalno funkcioniranje.
Unoenje mutacija u gene kvasca razmjerno je jednostavno jer se unesena DNA sekvenca
esto zamjenjuje s normalnom kromosomskom kopijom mehanizmom homologne
rekombinacije (slika 3.39). Na taj se nain klonirani gen, u koji smo in vitro unijeli odreenu
mutaciju, ugrauje u kromosom na mjesto normalnog alela te postaje dio normalne
kromosomske kopije gena kvasca. U najjednostavnijem sluaju klonirani gen inaktiviramo
mutacijom tako da onemoguimo njegovu normalnu funkciju, te ga unosimo na mjesto
normalnoga gena u kromosom kvasca kako bismo utvrdili njegovu ulogu u staninim
procesima. Na ovaj nain mogue je inaktivirati i ispitivati ak i one gene koji su nuni za rast
stanica, jer se kvaev ivotni ciklus sastoji od haploidnog i diploidnog stadija. Naime,
neaktivna kopija gena unosi se u diploidne stanice koje onda sadravaju jednu funkcionalnu i
jednu neaktivnu kopiju ciljnog gena. Stanice se tad potaknu na mejotiku diobu, a uinci
inaktivacije toga gena promatraju se na haploidnom potomstvu.
Rekombinacija izmeu strane DNA i homolognoga kromosomskoga gena vrlo je rijetka u
stanicama sisavaca, te je inaktivacija gena ovim pristupom daleko tea nego u kvascima.
Veina transfektirane DNA ugradi se u genom stanica primateljica nasuminom
rekombinacijom s nesrodnim sekvencama. Ovaj se problem pojavljuje vjerojatno zbog toga
to su genomi stanica sisavaca daleko vei od genoma kvasca. Danas su razvijene razliite
metode koje poveavaju uestalost homologne rekombinacije u genomima sisavaca, te
uspjenost selekcije i izolacije stanica u kojima je dolo do homologne rekombinacije. Vano
je da je gene mogue inaktivirati ne samo u somatskim, ve i u linijama embrionalnih
matinih stanica u kulturi. Pomou EM stanica mogue je proizvesti transgenine mieve, pa
se u tom sluaju uinak inaktivacije gena ispituje u kontekstu organizma, a ne samo
pojedinanih stanica. Na taj su nain ispitane funkcije stotina mijih gena, to je bilo posebice
znaajno za razumijevanje uloge specifinih gena tijekom razvoja mia.
Alternativni pristup inaktivaciji gena homolognom rekombinacijom je blokiranje ekspresije
gena protusmislenim nukleinskim kiselinama (slika 3.40). Ovim pristupom protusmislena
RNA ili jednolanana DNA koja je komplementarna molekuli mRNA gena koji nas zanima
(protusmislena) unosi se u stanicu. Protusmislena RNA ili DNA hibridizira s mRNA i blokira
njezino prevoenje u proteine. tovie, RNA-DNA hibridi koji nastaju zbog unoenja
protusmislene DNA molekule najee se brzo razgrauju u stanici. Protusmislene RNA
mogu se mikroinjekcijom izravno unijeti u stanicu. Jo jedan od naina je da stanice
transfektiramo vektorima koji su dizajnirani da eksprimiraju protusmislenu RNA.
Protusmislena DNA obino je u obliku kratkih oligonukleotida (duljine oko 20 baza) koji se
mikroinjektiraju u stanice. Budui da stanice i spontano unose sline oligonukleotide iz
staninog medija, protusmislene je oligonukleotide mogue jednostavno dodati u kulturu
stanica.

www.perpetuum-lab.com

23

RNA interferencija (RNAi) je dodatan vrlo uinkovit nain za ometanje ekspresije gena na
razini mRNA (slika 3.41). Tijekom RNA interferencije kratke dvolanane RNA molekule (21
do 23 oligonukleotida) potiu razgradnju komplementarne mRNA. Iako mehanizam na koji
dvolanana RNA potie razgradnju ciljne mRNA jo uvijek nije potpuno razjanjen,
pretpostavlja se da ukljuuje djelovanje ribonukleaze koja se povezuje s dvolananom RNA te
se zatim na osnovi komplementarnog sparivanja baza usmjerava na ciljnu mRNA. RNAi je
prvo uvedena za uinkovito poticanje razgradnje mRNA u obliu Caenorhabditis elegans.
Kasnije je njezina primjena proirena na vonu muicu (Drosophila melanogaster) i uronjak
(Aradopsis thaliana), a nedavno i na stanice sisavaca.
Osim inaktiviranja gena ili poticanja razgradnje mRNA, ponekad je mogue izravno ometati
funkciju proteina u stanicama (slika 3.42). Jedan od naina je mikroinjektiranje protutijela
koja specifino blokiraju aktivnost odreenog proteina. Alternativno, odreeni mutirani
proteini mogu ometati funkciju normalnih kopija ukoliko su eksprimirani u istoj stanici,
primjerice kompeticijom s normalnim proteinom za vezanje na ciljnu molekulu. Kloniranu
DNA, koja kodira takve mutirane proteine (nazivamo ih dominantni inhibirajui mutanti),
mogue je unijeti u stanice prijenosom gena u svrhu ispitivanje uinka blokiranja funkcije
normalnoga gena.

www.perpetuum-lab.com

24

KLJUNI POJMOVI

SAETAK
NASLJEIVANJE, GENI I DNA
gen,
alel,
dominantnan, Geni i kromosomi: Kromosomi su nositelji gena
recesivan, genotip, fenotip,
kromosom, diploidan, mejoza,
haploidan, mutacija
hipoteza jedan gen jedan Geni i enzimi: Gen odreuje slijed aminokiselina u
enzim
polipeptidnom lancu
transformacija
Identifikacija DNA kao genetikog materijala: DNA je
identificirana kao genetiki materijal eksperimentima s
transformacijom bakterija
Struktura DNA: DNA je dvostruka uzvojnica u kojoj se
stvaraju vodikove veze izmeu purina i pirimidina u
nasuprotnim lancima. Zbog specifinog sparivanja baza (A
T, G C) dva su lanca molekule DNA komplementarna u
slijedu nukleotida
semikonzervativna replikacija, Replikacija
DNA:
DNA
se
udvostruuje
DNA-polimeraza
semikonzervativnom replikacijom u kojoj se dva lanca
razdvajaju i svaki slui kao kalup za sintezu novoga lanca
EKSPRESIJA GENETIKE INFORMACIJE
Kolinearnost gena i proteina: Redoslijedom nukleotida u
DNA odreen je slijed aminokiselina u proteinu
sredinja dogma, prepisivanje, Uloga glasnike RNA: Glasnika RNA djeluje kao
prevoenje, glasnika RNA
posrednik koji prenosi informaciju s DNA na ribosome
(mRNA),
RNA-polimeraza,
gdje slui kao kalup za sintezu proteina.
ribosomska
RNA (rRNA),
transportna RNA (tRNA)
genetiki kod, prevoenje in Genetiki kod: Transportna RNA slui kao adaptor izmeu
vitro, kodon
aminokiselina i mRNA tijekom prevoenja. Svaka je
aminokiselina odreena kodonom koji se sastoji od tri
nukleotida.
retrovirus, obrnuto prepisivanje, RNA virusi i obrnuto prepisivanje: DNA je mogue
reverzna-transkriptaza
sintetizirati na osnovi RNA kalupa to je prvo otkriveno
kod retrovirusa.
REKOMBINANTNA DNA
restrikcijske endonukleaze, gel- Restrikcijske endonukleaze: Restrikcijske endonukleaze
elektroforeza, restrikcijska karta
kidaju DNA na odreenim sekvencama ime nastaju
fragmenti DNA definirane veliine.
molekularno kloniranje, vektor, Proizvodnja
rekombinantnih
molekula
DNA:
rekombinantna
molekula,
Rekombinantna molekula DNA sastoji se od eljenoga
molekularni klon, DNA ligaza,
fragmenta DNA ugraenog u vektor koji se moe
cDNA
neovisno umnaati u odgovarajuoj stanici domainu
plazmid, ishodite replikacije, Vektori za rekombinantnu DNA: Za kloniranje fragmenata
kozmid, P1 umjetni kromosom DNA razliite veliine koriste se razliiti vektori.
(PAC),
bakterijski
umjetni
kromosom (BAC), umjetni
kromosom kvasca (YAC)
dideoksinukleotid,
Sekvenciranje DNA: U kloniranom fragmentu DNA
autoradiografija
mogue je odrediti slijed nukleotida.

www.perpetuum-lab.com

25

ekspresijski vektor, bakulovirus

lanana
(PCR)

reakcija

polimeraze

hibridizacija
nukleinskih
kiselina, sonda, Southern blot,
Northern blot, DNA mikroip,
hibridizacija in situ

Ekspresija kloniranih gena: Proteine koje kodiraju

klonirani geni mogue je sintetizirati u velikim koliinama
u bakterijama ili eukariotskim stanicama.
Umnoavanje DNA lananom reakcijom polimeraze: PCR
omoguuje in vitro umnaanje i izolaciju specifinih DNA
fragmenata
DETEKCIJA NUKLEINSKIH KISELINA I PROTEINA
Hibridizacija
nukleinskih
kiselina:
Hibridizacija
nukleinskih kiselina omoguuje detekciju specifinih
molekula DNA ili RNA.

Detekcija malih koliina DNA ili RNA lananom reakcijom

polimeraze: PCR je osjetljiva metoda za detekciju malih
koliina specifinih molekula DNA ili RNA.
protutijelo,
antigen, Protutijela kao sonde za proteine: Protutijela koristimo za
monoklonsko
protutijelo, detekciju specifinih proteina u stanicama ili staninim
imunoblot,
Western
blot, ekstraktima.
imunoprecipitacija,
SDSpoliakrilamidna
gelelektroforeza (SDS-PAGE)
knjinica rekombinantne DNA, Sonde za pretraivanje knjinica rekombinantne DNA:
genomska knjinica, knjinica Specifine rekombinantne molekule DNA pronalazimo u
cDNA
knjinicama rekombinantne DNA uz pomo hibridizacije
nukleinskih kiselina ili protutijela.
FUNKCIJA GENA U EUKARIOTIMA
mutanta
osjetljiva
na Genetike analize u kvascima: Jednostavna genetika i brzo
temperaturu
razmnoavanje kvasca omoguuju molekularno kloniranje
gena koji odgovaraju bilo kojoj mutaciji u kvascu.
prijenos gena, transfekcija, Prijenos gena u biljke i ivotinje: Klonirane gene mogue
prolazna ekspresija, liposom, je unijeti u stanice viih eukariota i viestanine organizme
elektroporacija,
transgenini radi funkcionalne analize.
mi, embrionalne matine (EM)
stanice, Ti plazmid
obrnuta genetika, in vitro Mutageneza klonirane DNA: In vitro mutagenezu klonirane
mutageneza
DNA koristimo za ispitivanje uinka odreenih mutacija na
funkciju gena.
homologna
rekombinacija, Unoenje mutacija u stanine gene: Mutacije je mogue
protusmislene
nukleinske unijeti u kromosomske gene homolognom rekombinacijom
kiseline, RNA interferencija s kloniranom DNA. Osim toga, ekspresiju ili funkciju
(RNAi), dominantni inhibitorni specifinih genskih produkata mogue je blokirati
mutant
protusmislenim
nukleinskim
kiselinama,
RNA
interferencijom ili dominantnim inhibitornim mutantama.

www.perpetuum-lab.com

26

Pitanja
1. Definirajte pojam prevoenje (translacija) u kontekstu molekularne biologije.
2. to je sve potrebno za provoenje sinteze proteina in vitro?
3. Kako je provedeno prvo povezivanje nekog kodona s aminokiselinom koju taj protein
oznauje?
4. Na to mislimo kada kaemo da je genetiki kod degeneriran?
5. Objasnite zato adicija ili delecija jednoga ili dva nukleotida u kodirajuem dijelu gena
rezultira nefunkcionalnim proteinom, a adicija ili delecija tri nukleotida esto rezultira
proteinom koji zadrava normalnu funkciju.
6. Objasnite koja svojstva mora imati umjetni kromosom kvasca da bismo pomou njega u
kvascu mogli klonirati dio humane DNA izrezane pomou EcoR1.
7. Zato je lanana reakcija polimeraze (PCR) vrlo korisna tehnika u molekularnoj biologiji?
8. Kakva je razlika izmeu genomske i cDNA knjinice?
9. Ispitujete enzim u kojem je cistein u aktivnom mjestu kodiran tripletom UGU. Kakav e
utjecaj na enzimsku aktivnost imati mutacija tree baze u C, a kakav mutacija iste te baze u
A?
10. Razgradnja molekule DNA velike 4 kB s EcoR1 daje dva fragmenta; jedan od 1 kb i jedan
od 3 kb. Razgradnja iste molekule s HindIII daje fragmente od 1,5 i 2,5 kb. Razgradnja s
kombinacijom enzima EcoR1 i HindIII daje fragmente od 0,5 kb, 1 kb i 2,5 kb. Nacrtajte
restrikcijsku kartu toga fragmenta (DNA molekule) i unesite poloaje mjesta prepoznavanja
za EcoRI i HindIII.
11. Koliko e kopija nekoga gena nastati nakon 10 i 30 ciklusa umnoavanja lananom
reakcijom polimeraze ukoliko reakciju zaponemo s molekulom DNA iz jednog jedinog
spermija?
12. Klonirali ste cDNA nepoznate funkcije. Na koji nain moete eksperimentalno utvrditi
unutarstanini smjetaj proteina to ga kodira ta cDNA?
13. elite odrediti koje su aminokiseline vane za katalitiku aktivnost nekog enzima.
Pretpostavivi da vam je na raspolaganju cDNA klon, predloite eksperimentalnu strategiju
koju biste primijenili.

www.perpetuum-lab.com

27

Literaturni navodi i dodatna literatura

www.perpetuum-lab.com

28

Kljuni pokus
Pretpostavka DNA provirusa
"Nature of the Provirus of Rous Sarcoma"
Howard M. Temin
McArdle Laboratory, University of Wisconsin, Madison, WI
National Cancer Institute Monographs, Vol 17, 1964, pages 557-570
Kontekst
Rousov sarkoma virus (RSV) prvi je opisani virus koji moe uzrokovati tumore, te je posluio
kao eksperimentalni model za istraivanje molekularne biologije tumora. Howard Temin
ukljuio se u istraivanje ovog podruja kada je kao posljediplomand 1958. razvio
metodu transformacije normalnih stanica u kulturi u tumorske pomou infekcije
Rousovim sarkoma virusom. Uvoenje ove kvantitativne in vitro metode omoguilo je
daljnja istraivanja transformacije stanica i umnaanja virusa. Provodei spomenute
eksperimente, Temin je doao do serije neoekivanih opaanja koja su upuivala da je
replikacija RSV virusa bazino razliita od replikacije ostalih RNA virusa. Temin je
pretpostavio da se RNA virusa prepisuje u DNA u inficiranim stanicama to se u to
vrijeme izravno sukobljavalo s ope prihvaenom sredinjom dogmom molekularne
biologije (pretpostavka DNA provirusa).
Eksperimenti
Pretpostavka DNA provirusa zasnovana je na nekoliko razliitih tipova eksperimentalnih
dokaza. Ispitivanja stanica inficiranih mutiranim RSV pokazala su da su neka svojstva tih
stanica odreena genetikom informacijom virusa. Ova se informacija uvijek prenosila na
stanice keri nakon diobe stanica, ak i ukoliko nije dolazilo do umnoavanja virusa. Na
osnovi toga opaanja Temin je zakljuio da virusni genom postoji u stanicama u
stabilnom obliku koji je mogue naslijediti, te ga je nazvao provirusom.
Dokazi da je provirus zaista DNA izvedeni su iz eksperimenata koji su koristili metabolike
inhibitore. Pronaeno je da aktinomicin D, koji inhibira sintezu RNA na osnovi DNA
kalupa, onemoguuje proizvodnju virusa u stanicama inficiranim RSV-om (vidi sliku). S
druge strane, inhibitori sinteze DNA blokirali su rane stadije infekcije stanice virusom.
inilo se da je u ranim stadijima infekcije potrebna sinteza DNA, a da je DNA upravljana
sinteza RNA potrebna u kasnijim stadijima za proizvodnju novih virusnih estica. Na
temelju ovih opaanja pretpostavilo se da je provirus DNA kopija viralnoga RNA
genoma. Temin je pokuao dodatno dokazati ovu pretpostavku koristei hibridizaciju
nukleinskih kiselina za detekciju virusnih sekvenci u DNA inficiranih stanica. Ipak,
osjetljivost tehnika koje su mu bile na raspolaganju nije bila dostatna i rezultati nisu bili
uvjerljivi.

www.perpetuum-lab.com

29

Uinak
Teminova pretpostavka da se RSV umnoava prijenosom informacije s RNA na DNA u
osnovi je predloena na temelju genetikih eksperimenata i uinaka metabolikih
inhibitora, a kosila se s opeprihvaenom sredinjom dogmom molekularne biologije. U
tom kontekstu, ne samo da nije bila prihvaena u znanstvenoj zajednici, ve je bila
izloena opem odbijanju, gotovo podsmijehu. Termin je ipak ustrajao i tijekom 1960-ih
nastavio prikupljati eksperimentalne dokaze koji bi potkrijepili njegovu pretpostavku. Ti
su napori kulminirali 1970. godine kad su Temin i Satoshi Mizutani (u isto vrijeme kad i
David Baltimore) otkrili virusni enzim, danas poznat kao reverzna-transkriptaza, koji
sintetizira DNA na osnovi RNA kalupa. To je bio nedvojbeni biokemijski dokaz da je
tijek genetike informacije mogue i obrnuti i da sredinju dogmu treba modificirati.
U svom radu objavljenom 1970. godine Temin je zakljuio da njegovi rezultati "predstavljaju
snaan dokaz da je pretpostavka DNA provirusa tona i da RNA tumorski virusi imaju DNA
genom kad su u stanicama, a RNA genom kad su u virusnim esticama. Ovaj rezultat imao bi
znaajne implikacije na teoriju virusne kancerogeneze, a moda i na teorije prijenosa
informacije u drugim biolokim sustavima." Kao to je Temin i predvidio, otkrie RNA
upravljane DNA sinteze dovelo je do znaajnoga napretka naeg razumijevanja tumora,
humanih retrovirusa i preureivanja gena. Enzim reverzna-transkriptaza omoguio je
kloniranje cDNA, te je stoga imao uinak na praktino sva podruja suvremene stanine i
molekularne biologije.
Slika:
Uinak aktinomicina D na replikaciju RSV. Stanice inficirane RSV-om uzgajane su u kulturi u
prisutnosti navedenih koncentracija aktinomicina tijekom 8 sati nakon ega je
aktinomicin D uklonjen te je analizirana koliina nastalog virusa.
Produkcija virusa (postotak poetne kontrolne brzine)
Prisutan aktinomicin D
sati

www.perpetuum-lab.com

30

Molekularna medicina
HIV i AIDS
Bolest
Sindrom steene imunodeficijencije (AIDS, engl. acquired immune deficiency syndrome) je
nova bolest koja je prvi puta opisana 1981. godine. Do danas se razvila u pandemiju s
vie od 50 milijuna inficiranih ljudi irom svijeta od kojih je priblino 20 milijuna umrlo
od AIDS-a. Klinika manifestacija AIDS-a poglavito je posljedica nemogunosti
imunosustava da normalno funkcionira. U nedostatku normalne imunosti pacijenti
oboljeli od AIDS-a podloni su oportunistikim infekcijama (virusa, bakterija, gljivica i
protozoa) na koje bi zdrava osoba bila otporna. Ljudi s AIDS-om takoer esto
obolijevaju od odreenih vrsta tumora, posebice limfoma i Kaposijeva sarkoma, no za
najvei dio smrtnosti ipak su odgovorne oportunistike infekcije.
Molekularna i stanina osnova
AIDS je uzrokovan retrovirusom (virus humane imunodeficijencije, HIV, engl. human
imunodeficiency virus) to su ga 1983. godine otkrili istraivaki timovi Roberta Galloa i
Luca Montagniera. HIV primarno inficira specifinu skupinu limfocita (T4 limfocite) koji
su potrebni za normalni imunoodgovor. Za razliku od brojnih drugih retrovirusa, kao to
je primjerice Rousov sarkoma virus, HIV ne uzrokuje transformaciju inficiranih stanica u
tumorske stanice. Umjesto toga, HIV s vremenom ubija stanicu u kojoj se replicira to
rezultira smanjenjem broja T4 limfocita, te krahom imunoodgovora inficiranih osoba.
Posljedica nedostatnog imunoodgovora su oportunistike infekcije i tumori koji
predstavljaju kliniku manifestaciju AIDS-a.
Prevencija i tretman
Do danas je jedini nain prevencije AIDS-a izbjegavanje infekcije HIV-om. HIV je vrlo krhki
virus koji izvan tijela brzo gubi infektivnost, te stoga ne moe biti prenesen uobiajenim
kontaktom s inficiranom osobom. Tri su naina na koji se prenosi: spolnim kontaktom,
kontaminiranim derivatima krvi i s majke na dijete tijekom trudnoe ili dojenja. Nakon
otkria HIV-a razvijeni su testovi koji su osigurali da faktori zgruavanja i zaliha krvi koji se
koriste za transfuziju budu bezopasni za primatelje. Prevencija infekcije HIV-om ostalim
nainima trenutno ovisi o osobnom angamanu na minimalizaciji rizika infekcije. Pod time se
podrazumijeva pridravanje pravila sigurnog seksa, te izbjegavanje izmjenjivanja igala za
intravenoznu primjenu droga.
Otkrie HIV virusa kao uzronika AIDS-a otvorilo je nove mogunosti prevencije i tretmana.
Aktivno se radi na razvoju cjepiva koje bi onemoguilo infekciju HIV-om, no tome znaajnu
prepreku predstavljaju neka bioloka svojstva HIV virusa. Alternativni pristup su lijekovi koji
onemoguuju replikaciju virusa na taj nain da inhibiraju reverznu-transkriptazu ili proteazu
HIV-a. Kombinacije takvih lijekova danas mogu produljiti ivot oboljelih, no nuno je
potreban daljnji rad na razvoju novih lijekova koji e biti ne samo uinkovitiji, ve i jeftiniji i
praktiniji za primjenu u zemljama u razvoju.
Slika
Pretrana elektronska mikrofotografija HIV virusa koji "pupa" iz T limfocita (Cecil Fox/Photo
Researches, Inc)

www.perpetuum-lab.com

31

Tablica 3.1. Genetiki kod.

prvo mjesto

drugo mjesto

www.perpetuum-lab.com

tree mjesto

32

Tablica 3.2. Mjesta prepoznavanja nekih restrikcijskih endonukleaza.

enzima

izvor

mjesto prepoznavanjab

Imena restrikcijskih enzima izvode se iz imena organizma iz kojih su izolirani i rednoga

broja koji omoguuje razlikovanje razliitih enzima izoliranih iz istog organizma
(primjerice HpaI i HpaII dva razliita enzima izolirana iz bakterije Haemophilus
parainfluenzae).

Mjesta prepoznavanja prikazana su samo kao slijed nukleotida jednoga lanca dvolanane
DNA. "N" predstavlja bilo koju bazu.

www.perpetuum-lab.com

33

Tablica 3.3. Vektori za kloniranje velikih fragmenata DNA.

Vektor

Veliina fragmenta (kb)

Stanica domain

Kozmidi
Bakteriofag P1
P1 umjetni kromosomi (PAC)
Bakterijski umjetni kromosomi (BAC)
Umjetni kromosomi kvasca (YAC)

www.perpetuum-lab.com

34

Slika 3.1 Nasljeivanje dominantnih i recesivnih gena.

Roditeljski sojevi
Gamete
F1 generacija
Gamete
F2 generacija
Svaki roditeljski soj graka sadrava po dvije kopije (alela) gena koji odreuje boju sjemenke
(npr. uta (Y) ili zelena (y) boja sjemenke).
Roditelji stvaraju spolne stanice (gamete) od kojih svaka sadrava po jednu kopiju gena (ili po
jedan alel odreenoga gena). Dvije se gamete spajaju u novi organizam koji ini hibridno F1
potomstvo.
Budui da je Y dominantan alel, sve F1 biljke imat e ute sjemenke.
Krianjem dviju biljaka potomaka F1 generacije nastaje F2 generacija s karakteristinim 3 : 1
omjerom dominantnog (uto) i recesivnog (zeleno) fenotipa.

www.perpetuum-lab.com

35

Slika 3.2. Kromosomi u mejozi i oplodnja.

Prikazana su dva para kromosoma hipotetikog organizma.
muki roditelj

enski roditelj

diploidan
mejoza
spermij

jajna stanica
oplodnja

haploidan
embrio
diploidan
Diploidna stanica sadrava po dvije kopije svakoga kromosoma (homologni kromosomi
jednog kromosomskog para)
Mejozom nastaju haploidne gamete koje sadravaju samo po jedan kromosom svakoga para
Oplodnjom nastaje diploidni embrio koji sadrava kromosome obaju roditelja (po dva
kromosoma svakoga para)

www.perpetuum-lab.com

36

Slika 3.3. Razdvajanje (segregacija) i vezanost gena.

(A) Razdvajanje dva hipotetika gena za oblik (A/a = etvrtast/okrugao) i boju (B/b =
crveno/plavo) smjetenih na razliitim kromosomima. (B) Nasljeivanje gena smjetenih na
istom kromosomu (vezani geni).
(A) Razdvajanje dva hipotetika gena smjetena na dva razliita kromosoma (A/a =
etvrtast/okrugao i B/b = crveno/plavo)
Roditeljski soj
Gamete
F1 generacija
gamete
F2 generacija
(*** okvir 1)
Budui da se kromosomi neovisno razdvajaju tijekom mejoze, F1 generacija stvara etiri
razliita tipa gameta.
(*** okvir 2)
Stoga F2 generacija dolazi u etiri prepoznatljiva fenotipa: etvrtast crveni, etvrtast plavi,
okrugli crveni i okrugli plavi, u omjeru 9 : 3 : 3 : 1.
(B) Vezanost dvaju gena smjetenih na istom kromosomu
Roditeljski soj
Gamete
F1 generacija
gamete
F2 generacija
(*** okvir 1)
Budui da se oba gena nalaze na istom kromosomu, tijekom mejoze ne dolazi do njihovoga
meusobnog razdvajanja, ve oni zajedno odlaze u istu gametu s kromosomom koji ih nosi pa
stoga F1 generacija stvara samo dva razliita tipa gameta.
(*** okvir 2)
F2 generacija dolazi u samo dva fenotipa: etvrtasti crveni i okrugli plavi, u omjeru 3 : 1 koji
je svojstven nasljeivanju samo jednoga gena.

www.perpetuum-lab.com

37

Slika 3.4. Prijenos genetike informacije pomou DNA.

DNA je izolirana iz patogenog soja bakterije Pneumococcus koji je okruen kapsulom i tvori
glatke kolonije (S, engl. smooth). Dodatak DNA proiene iz S soja u kulturu nepatogenih
bakterija koje ne tvoje kapsulu (R, engl. i) dovodi do stvaranja S kolonija. Zakljuak je da
proiena DNA sadrava genetiku informaciju odgovornu za transformaciju R soja u S soj
bakterija.

Patogena S bakterija

Nepatogena R bakterija

DNA
kapsula
proistiti DNA
dodati proienu DNA S soja
bakterijama R soja

S bakterija

www.perpetuum-lab.com

38

Slika 3.5. Struktura molekule DNA.

DNA je dvostruka uzvojnica s bazama na unutarnjoj i eerno-fosfatnom okosnicom na
vanjskoj strani molekule.
Baze na suprotnim lancima povezuju se vodikovim vezama izmeu adenina (A) i timina (T),
te izmeu gvanina (G) i citozina (C). Dva lanca u molekuli DNA su antiparalelni (usmjereni
su u suprotnim smjerovima odreenim slobodnim 5' odnosno 3' skupinama deoksiriboze).
5' kraj
3' kraj
eer
eer
eer
eer
3' kraj

5' kraj

www.perpetuum-lab.com

39

Slika 3.6. Semikonzervativna replikacija DNA.

Dva se lanca roditeljske DNA razdvajaju i svaki od njih slui kao kalup za sintezu po jednoga
novoga lanca. Na taj nain nastaju dvije nove, potpuno identine molekule DNA. Slijed
nukleotida u novonastalim lancima DNA odreen je komplementarnim sparivanjem baza.
stari lanac DNA
novi lanac DNA

www.perpetuum-lab.com

40

Slika 3.7. Eksperimentalni dokaz semikonzervativne replikacije DNA.

Bakterije uzgajane u mediju koji je sadravao normalni izotop duika (14N) prenesene su u
medij koji sadrava teki izotop duika (15N) te su tu uzgajane tijekom nekoliko generacija.
Zatim su prenesene ponovo u medij s 14N duikom i uzgajane tijekom dodatne generacije.
DNA izolirana iz tih bakterija analizirana je ravnotenim ultracentrifugiranjem u otopini
CsCl. Izloen velikom gravitacijskom polju CsCl sedimentira i tvori gradijent gustoe, a
molekule DNA tvore vrpcu na poloaju gdje je njihova gustoa jednaka gustoi otopine CsCl.
DNA bakterija prenesenih iz 15N medija u 14N medij tijekom vremena koje je omoguilo samo
jednu dodatnu replikaciju tvori vrpcu ija je gustoa izmeu gustoa 15N DNA i 14N DNA, to
upuuje na to da se radi o hibridnoj molekuli koja se sastoji od jednoga tekog i jednoga lakog
lanca.
Bakterije uzgajane u
14
N mediju

Bakterije uzgajane u
15
N mediju

Prijenos u 14N medije za jednu

diobu

E. coli
izolat DNA

izolat DNA

izolat DNA

centrifugirati u
otopini CsCl

centrifugirati u
otopini CsCl

centrifugirati u
otopini CsCl

rastua
gustoa

rastua
gustoa

lagana DNA
rastua
gustoa

hibridna DNA
teka DNA

www.perpetuum-lab.com

41

Slika 3.8. Kolinearnost gena i proteina.

Serija mutacija (strelice) kartirana je u genu bakterije E. coli koji kodira triptofan-sintetazu
(gornji red). Promjene aminokiselina koje su rezultirale iz svake od tih mutacija utvrene su
analizom slijeda aminokiselina u proteinima mutiranih bakterija (donji red). Ova ispitivanja
pokazala su da redoslijed mutacija u DNA odgovara redoslijedu promijenjenih aminokiselina
u proteinu to ga taj gen kodira.
Mutacije
DNA
Normalni protein
Zamjena aminokiseline kao
posljedica mutacije

www.perpetuum-lab.com

42

Slika 3.9. Sinteza molekule RNA iz molekule DNA.

Dva se lanca molekule DNA razmotavaju, a jedan od njih se koristi kao kalup za sintezu
komplementarnoga lanca molekule RNA.

www.perpetuum-lab.com

43

Slika 3.10. Funkcija transportne RNA (tRNA).

tRNA djeluje kao adaptor u sintezi proteina. Svaka aminokiselina (primjerice histidin) vee se
na 3' kraj specifine tRNA pomou odgovarajueg enzima (aminoacil-tRNA-sintetaze).
"Nabijena" tRNA tada se povezuje s molekulom mRNA koja slui kao kalup na osnovi
komplementarnog sparivanja baza.

Histidil-tRNA-sintetaza
"Nabijena" tRNAHis
Komplementarno sparivanje baza

www.perpetuum-lab.com

44

Slika 3.11. Genetiki dokaz tripletnoga koda.

Serija mutacija koje se sastoje od adicije jednoga, dva ili tri nukleotida ispitivane su u rII genu
bakteriofaga T4. Adicija jednoga ili dva nukleotida mijenja okvir itanja ostatka gena, te su
stoga sve sljedee aminokiseline pogrene i daju nefunkcionalni protein koji rezultira
mutiranim fenotipom faga. S druge strane, adicija tri nukleotida mijenja samo jednu
aminokiselinu. Okvir itanja ostatka gena je normalan pa e i protein to ga kodira taj gen biti
funkcionalan, a fag e imati normalni fenotip (divlji tip faga = WT).
normalni gen
aktivni protein WT fag

aminokiselina

+1 nukleotid
aminokiselina

neaktivni protein rII mutant

+2 nukleotida

aminokiselina

neaktivni protein rII mutant

+3 nukleotida

aminokiselina

aktivni protein WT fag

www.perpetuum-lab.com

45

Slika 3.12. Triplet UUU kodira fenilalanin.

In vitro prevoenje sintetike RNA koja se sastoji od ponavljajuih uracila (poli-U kalup)
rezultira sintezom polipeptida koji se sastoji samo od fenilalanina.
poli-U kalup
ribosomi
aminokiseline
tRNA
aminoacil-tRNA-sintetaze

in vitro
prevoenje

polipeptid

www.perpetuum-lab.com

46

Slika 3.13. Obrnuto prepisivanje i replikacija retrovirusa

Retrovirusi sadravaju RNA genome u svojim virusnim esticama. Tijekom infekcije stanice
domaina retrovirus sintetizira DNA kopiju svoga RNA genoma pomou enzima reverznetranskriptaze. Virusna DNA tada se ugrauje u kromosomsku DNA domaina i tvori DNA
provirus koji se prepisuje kako bi stvorio RNA potrebnu za nastanak novih virusnih estica.
Retrovirusna estica
RNA genom
Infekcija virusom

Obrnuto prepisivanje
Ugradnja virusne DNA
DNA provirus

Nove virusne estice

www.perpetuum-lab.com

47

Slika 3.14. Razgradnja DNA enzimom EcoRI i gel-elektroforeza.

Enzim EcoRI kida DNA na pet mjesta (strelice) ime nastaje est fragmenata. Ti se
fragmenti razdvajaju elektroforezom u agaroznom gelu. Fragmenti DNA putuju prema
pozitivnoj elektrodi s tim da se manji fragmenti kreu bre, a vei sporije. Nakon
elektroforeze, DNA se boji fluorescentnom bojom i fotografira. Prikazana je veliina
fragmenata DNA.
EcoRI razgradnja

gel elektroforeza
() elektroda

putovanje
DNA
(+) elektroda
fotografija
gela

www.perpetuum-lab.com

48

Slika 3.15. Restrikcijske karte DNA bakteriofaga i adenovirusa.

Poloaj mjesta kidanja DNA bakteriofaga E. coli (48,5 kb) i humanog adenovirusa 2 (35,9
kb) enzimima BamHI, EcoRI i HindIII.

www.perpetuum-lab.com

49

Slika 3.16. Proizvodnja rekombinantnih molekula DNA.

Fragment humane DNA ugraen je u DNA vektor. Takva rekombinantna molekula zatim se
unosi u E. coli gdje se umnoava i stvara rekombinantno potomstvo bakteriofaga koje
sadrava umetnuti fragment humane DNA.
fragment humane DNA

vektor

spajanje fragmenta humane DNA i vektora

rekombinantna molekula
unoenje u E. coli

replikacija DNA

bakteriofagi koji sadravaju

proizvedenu rekombinantnu DNA

www.perpetuum-lab.com

50

Slika 3.17. Povezivanje molekula DNA.

Vektor i fragment DNA koji treba ugraditi razgrauju se istom restrikcijskom endonukleazom
(primjerice EcoRI) koja kida DNA ostavljajui produene jednolanane ljepljive krajeve.
DNA vektora i fragmenta koji se ugrauju prvo se povezuju komplementarnim sparivanjem
baza, a zatim djelovanjem DNA ligaze nastaju kovalentne veze koje stabiliziraju
rekombinantnu molekulu.
Fragment DNA koji se ugrauje

DNA vektora

Kidanje pomou EcoRI

Kidanje pomou EcoRI

Kidanjem pomou EcoRI

nastaju ljepljivi krajevi
jednolanane DNA

Komplemenarno
sparivanje baza

Povezivanje DNA ligazom

Rekombinantna molekula

www.perpetuum-lab.com

51

Slika 3.18. Kloniranje cDNA.

cDNA kopije RNA molekule pripravljaju se obrnutim prepisivanjem pomou enzima
reverzne-transkriptaze
Oligonukleotidne spojnice koje sadravaju mjesta prepoznavanja za restrikcijske
endonukleaze dodaju se na krajeve cDNA
cDNA se ugrauje u odgovarajui vektor
cDNA klon

www.perpetuum-lab.com

52

Slika 3.19. Kloniranje u vektorima bakteriofaga .

Vektor sadrava restrikcijsko mjesto (primjerice mjesto prepoznavanja EcoRI) za ugradnju
klonirane DNA. Osim toga, na oba kraja DNA vektora nalaze se cos mjesta (kohezivni
krajevi) koji su potrebni za ugradnju DNA u estice faga. Umetak DNA (primjerice humane
DNA) spaja se s vektorom, a takva se rekombinantna DNA ugrauje u estice faga
mijeanjem s proteinima bakteriofaga. Takvim se rekombinantnim bakteriofagima zatim
inficira E. coli. Svaki rekombinantni fag nosi po jedan specifini umetak klonirane DNA i
tvori odvojeni plak na bakterijskoj kulturi. Iz takvog je pojedinog plaka mogue izolirati i u
velikoj koliini umnoiti potomstvo faga koje sadrava kopije umetnute molekule DNA.
Fragmenti DNA ovjeka
cos

EcoRI

cos

vektor
Razgradnja pomou
EcoRI i ligacija
cos

cos
Pakiranje u estice faga

Rekombinantni fagi

Inficiranje bakterije E. coli

Bakterijska livada
Svaki rekombinantni fag
tvori odvojeni plak
Plak faga

www.perpetuum-lab.com

53

Slika 3.20. Kloniranje u plazmidne vektore.

Vektor je mala kruna molekula koja sadrava ishodite replikacije (ori), gen koji nosi
rezistenciju na ampicilin (Ampr) i restrikcijsko mjesto (primjerice EcoRI) u koje je mogue
ugraditi stranu DNA. Fragment strane DNA ugrauje se u vektor i rekombinantnim se
plazmidima transformira bakterija E. coli. Bakterije se nasauju na medij koji sadrava
ampicilin na kojem kolonije stvaraju samo one bakterije koje sadravaju plazmidnu DNA
zbog koje su postale rezistentne na ampicilin. Klonove bakterija koji sadravaju pojedine
plazmide mogue je izolirati i umnoiti u velikoj koliini radi izolacije rekombinantnih
plazmida.
Fragmenti DNA za ugradnju
umetak strane DNA

razgradnja s EcoRI i ligacija

rekombinantni
plazmid

Plazmidni
vektor
Transformacija E. coli s
rekombinantnim plazmidima

Nasaivanje bakterija na
medij s ampicilinom
Kolonije bakterija koje su
rezistentne na ampicilin

Medij koji sadrava

ampicilin
izolacija pojedinane kolonije

DNA E. coli
Bakterija koja sadrava
rekombinantni plazmid

www.perpetuum-lab.com

54

Slika 3.21. Sekvenciranje DNA Sangerovom metodom.

Dideoksinukleotidi kojima nedostaje OH skupina i na 3' i na 2' poloaju deoksiriboze koriste
se za prekidanja sinteze DNA na specifinim bazama. Te se molekule normalno ugrauju u
rastue lance DNA. Budui da im nedostaje 3' OH skupina, na njih nije mogue povezati
sljedei nukleotid pa na tom mjestu prestaje daljnja sinteza DNA. Sinteza DNA zapoinje
radioaktivno obiljeenom poetnicom. Provode se etiri neovisne reakcije od kojih svaka
osim etiri normalna deoksinukleotida sadrava i manju koliinu jednog od
dideoksinukleotida. Svaka od etiriju reakcija rezultirati e serijom molekula DNA koje
zapoinju radioaktivno obiljeenom poetnicom, a zavravaju dideoksinukleotidom
ugraenim na mjesto odreene normalne baze. Produkti reakcija tada se razdvoje
elektroforezom i analiziraju autoradiografijom kako bi se odredio slijed nukleotida.
Radioaktivna poetnica

Sinteza DNA u prisutnosti

dideoksinukleotida koji zaustavljaju
sintezu

Elektroforeza
Autoradiografija

Putovanje
fragmenata
Slijed nukleotida
u komplementarnom
lancu

2', 3' - dideoksinukleotid

www.perpetuum-lab.com

55

Slika 3.22. Automatizirano sekvenciranje DNA.

Provode se etiri odvojene reakcije sekvenciranja od kojih svaka sadrava poetnicu
obiljeenu specifinim fluorescentnim biljegom i jedan od dideoksinukleotida koji e
prekinuti sintezu lanca DNA. Reakcijski produkti se tada mijeaju i analiziraju gelelektroforezom. Kako lanci DNA putuju kroz gel, nailaze na lasersku zraku koja pobuuje
fluorescentni biljeg. Emitiranu fluorescentnu svjetlost detektira fotomultiplikator povezan s
raunalom koje prikuplja i analizira podatke.
Jednolanana DNA koju treba sekvencirati
Reakcija sekvenciranja koristi poetnice obiljeene
razliitim fluorescentnim biljezima za svaki
dideoksinukleotid

Spojiti produkte
Elektroforeza

putovanje
fragmenata

Laserska zraka

Fotomultiplikator

Fluorescencija
Raunalo

www.perpetuum-lab.com

56

Slika 3.23. Ekspresija kloniranih gena u bakterijama.

Ekspresijski vektori sadravaju promotore (pro), koji potiu prevoenje umetnutog fragmenta
DNA, te redoslijede potrebne za vezanje mRNA na bakterijske ribosome (Shine-Delgarnov
[SD] slijed). Eukariotska cDNA umetnuta pokraj tih sekvenci uinkovito se eksprimira u E.
coli to rezultira proizvodnjom eukariotskih proteina u transformiranim bakterijama.
Bakterijski promotor i
sekvenca za vezanje ribosoma
Mjesto za kloniranje
Ekspresijski
vektor

Ugradnja eukariotske DNA

cDNA umetak

Transformacija E. coli

Proizvodnja eukariotskog proteina

www.perpetuum-lab.com

57

Slika 3.24. Umnoavanje DNA lananom reakcijom polimeraze.

Dio DNA koji treba umnoiti omeen je s dva slijeda nukleotida s kojima zapoinje sinteza.
Poetnu dvolananu DNA zagrijavamo da bismo razdvojili lance, a zatim je hladimo kako bi
se poetnice (najee oligonukleotidi od 15 do 20 baza) vezale na svaki od tih lanaca.
Poevi od poetnica, DNA-polimeraza izolirana iz bakterije Thermus aquaticus (Taqpolimeraza) sintetizira nove lance DNA to dovodi do stvaranja dviju novih dvolananih
molekula DNA. Ovaj je proces mogue viestruko ponavljati to rezultira udvostruenjem
broja molekula DNA nakon svakoga ciklusa.
Poetna DNA

Zagrijavanje na 95 C
Razdvajanje lanaca molekule DNA
55 C
Vezanje poetnica na lance DNA kalupa
Poetnica 1
Poetnica 2
72 C
Produenje lanaca DNA Taq-polimerazom
Dvije nove molekule DNA
Dvije nove molekule DNA

Dvije nove molekule DNA

www.perpetuum-lab.com

58

Slika 3.25. Detekcija molekula DNA hibridizacijom nukleinskih kiselina.

Hibridizacijom s radioaktivno obiljeenom DNA sondom mogue je detektirati specifine
sljedove nukleotida u ukupnoj staninoj DNA. DNA se denaturira zagrijavanjem na 95 C
ime dobivamo jednolanane molekule. Nakon denaturacije se molekulama DNA dodaje
radioaktivno obiljeena sonda te se takva smjesa molekula inkubira na 65 C. Time se
omoguuje da se specifini sljedovi baza u denaturiranim molekulama DNA spoje sa
sljedovima baza u DNA sondi (hibridizacija DNA molekula) na temelju komplementarnosti.
Detekcijom mjesta hibridizacije radioaktivno obiljeene sonde s molekulom DNA detektirali
smo specifinu sekvencu DNA u cjelokupnoj staninoj DNA.
Smjesa razliitih dvolananih molekula
prisutnih u ukupnoj staninoj DNA
95 C
Denaturacija

Lanci se
razdvajaju
Dodati radioaktivno obiljeenu sondu
koja je komplementarna specifinim
sekvencama u staninoj DNA
65 C
Renaturacija
Radioaktivna sonda hibridizira s
komplementarnim sekvencama u
staninoj DNA

www.perpetuum-lab.com

59

Slika. 2.26 Southern blot.

Fragmenti DNA nastali razgradnjom restrikcijskim endonukleazama razdvoje se gelelektroforezom, a specifini se fragmenti DNA identificiraju hibridizacijom s odgovarajuom
sondom.
DNA se razgrauje
restrikcijskom endonukleazom

Nastali se fragmenti razdvajaju

prema veliini gel-elektroforezom
putovanje

Papirnati runici
Membrana
Gel
Spuva
Otopina soli
DNA se denaturira i prenosi na
membranu noena otopinom soli
koja prolazi kroz gel
fragmenti DNA

Film osjetljiv na X-zrake

Membrana
Membrana se inkubira s radioaktivnom sondom koja se vee na komplementarne molekule
DNA
Sonda vezana na membranu detektira se autoradiografijom, a mjesto vezanja sonde otkriva
traene fragmente DNA

www.perpetuum-lab.com

60

Slika. 3.27 DNA mikroipovi.

(A) Primjer usporedne analize ekspresije gena u tumorskim i normalnim stanicama. mRNA
izolirana iz normalnih i tumorskih stanica koristi se kao kalup za sintezu cDNA sondi koje se
zatim obiljeavaju razliitim fluorescentnim bojama (primjerice crveni fluorescentni biljeg za
tumorske stanice i zeleni za normalne stanice). Dvije razliite cDNA sonde tada se mijeaju i
hibridiziraju s DNA mikroipa. Na mikroipu se nalaze tokice s oligonukleotidima koje
predstavljaju 10.000 ili vie humanih gena. Relativna ekspresija svakoga gena u tumorskoj
stanici u odnosu na njegovu ekspresiju u normalnoj stanici oslikana je omjerom crvene i
zelene fluorescencije na odgovarajuim poloajima u DNA mikroipa. (B) Fotografija dijela
DNA mikroipa.
(A)

Tumorska stanica

Normalna stanica

mRNA
cDNA
Mijeanje i hibridizacija cDNA sondi
DNA mikroip
Oitavanje laserom

www.perpetuum-lab.com

61

Slika 3.28. Fluorescentna in situ hibridizacija.

In situ hibridizacija fluorescentno obiljeenih sondi na kromosome ovjeka. Svaki od 24
kromosoma obiljeen je razliitom bojom jer za svaki humani kromosom postoji kromosom
specifina sonda. (Ljubaznou Thomasa Reida i Heseda Padilla-Nasha, National Cancer
Institute, SAD)

www.perpetuum-lab.com

62

Slika 3.29. Western blot.

Proteini se razdvajaju prema veliini SDS-poliakrilamidnom gel-elektroforezom i prenose s
gela na membranu. Membrana se inkubira s protutijelima koja prepoznaju protein koji nas
zanima, a vezana protutijela mogue je detektirati raznim metodama, primjerice
radioaktivnom sondom koja se vee na protutijelo.
Smjesa proteina
Gel-elektroforeza (SDS-PAGE)
Putovanje

Prijenos na membranu

Vrpce proteina

Inkubacija membrane s protutijelima

koja prepoznaju eljeni protein
Protutijela

Protutijelo vezano na specifini protein

Detekcija vezanih protutijela radioaktivnou ili specifinim bojenjem

www.perpetuum-lab.com

63

Slika 3.30. Imunoprecipitacija.

Radioaktivno obiljeeni proteini inkubiraju se s protutijelima koja tvore komplekse s
proteinima koje prepoznaju (antigen). Kompleksi protutijelo-antigen prikupljaju se na
zrncima koja veu protutijela. Zrnca se zatim zakuhaju kako bi se kompleks protutijeloantigen razdvojio, a osloboeni proteini analiziraju se SDS-poliakrilamidnom gelelektroforezom. Radioaktivno obiljeene proteine koji su imunoprecipitirali detektiramo
autoradiografijom.
Smjesa radioaktivno obiljeenih proteina
Inkubacija s protutijelima koja prepoznaju eljeni protein
Protutijela
Protutijela veu specifini protein
Prikupiti kompleks protutijelo-antigen zrncima koja veu protutijela
Kompleks protutijelo-antigen vezan na zrnca
Razdvojiti kompleks zakuhavanjem
Gel-elektroforeza
Putovanje
Detekcija radioaktivno obiljeenih proteina autoradiografijom

www.perpetuum-lab.com

64

Slika 3.31. Pretraivanje rekombinantne knjinice hibridizacijom.

Fragmenti stanine DNA klonirani su u vektor bakteriofaga i ugraeni u estice faga. Tako
nastalom zbirkom rekombinantnih faga koji sadravaju razliite umetke stanine DNA
inficiraju se bakterije i kultura se prekriva membranom. Dio faga iz svakoga plaka prenosi se
na membranu koja se zatim hibridizira s radioaktivno obiljeenom sondom kako bi se
identificirao plak u kojem se nalaze fagi nositelji eljenoga gena. Te je fage tada mogue
izolirati iz originalne ploice s bakterijskom kulturom.
Fragmenti stanine DNA
Ugradnja u vektor
Ugradnja vektora u estice faga
Rekombinantni fagi koji nose razliite
fragmente stanine DNA
Inficiranje E. coli fagima
Svaki rekombinantni fag tvori plak
Plakovi faga
Prijenos na membranu
Radioaktivno obiljeena DNA sonda
Hibridizacija sa specifinom sondom
Ispiranje membrane i autoradiografija
Film osjetljiv na X-zrake
Rekombinantni fag koji sadrava eljeni
fragment stanine DNA

www.perpetuum-lab.com

65

Slika 3.32 Kloniranje gena kvasca.

(A) Kvaev vektor. Vektor sadrava bakterijsko ishodite replikacije (ori) i gen za
rezistenciju na ampicilin (Ampr) potrebne za njegovu propagaciju u bakteriji E. coli. Osim
toga, vektor sadrava kvaevo ishodite replikacije i gen biljeg (LEU2) koji omoguuje
selekciju transformiranih kvasaca. Gen LEU2 kodira enzim potreban za sintezu aminokiseline
leucina, te je transformante soja kvasca kojemu nedostaje ovaj gen mogue izabrati na osnovi
stjecanja sposobnosti rasta na podlozi u kojoj nedostaje leucin.
(B) Izolacija gena kvasca. Traeni gen identificiran je mutacijom osjetljivom na temperaturu
koja omoguuje kvascu da raste na 25 C, ali ne i na 37 C. Radi izolacije klona eljenoga
gena, kvasci osjetljivi na temperaturu transformirani su knjinicom plazmida koja sadrava
gene cjelokupnog kvaevoga genoma. Svi kvasci transformirani plazmidnom DNA rastu na
mediju kojem nedostaje leucin i te na temperaturi od 25C, no samo oni kvasci transformirani
plazmidom koji nosi normalnu kopiju traenoga gena imaju sposobnost rasta na temperaturi
od 37 C. eljeni plazmid mogue je izolirati iz kvasaca koji tvore kolonije na nepermisivnoj
temperaturi.
(A)
LEU2

Kvaev ori

Umetak kvaeve DNA

E. coli ori

Ampr

(B)
Kvasac osjetljiv na temperaturu
Plazmidna knjinica kvasca
Razliiti umetci kvaeve DNA
Transformacija
Izbor transformiranih kvasaca
na osnovi sposobnosti rasta na mediju
u kojem nedostaje leucin

Rastu sve bakterijske stanice

koje sadravaju plazmide
plazmid

Rastu samo one bakterijske

stanice koje sadravaju
s normalnom kopijom gena
osjetljivog na temperaturu

25 C

37 C
Izolacija plazmida koji
nosi traeni gen

www.perpetuum-lab.com

66

Slika 3.33. Unoenje DNA u ivotinjske stanice.

Eukariotski gen klonira se u plazmid koji mora imati i odgovarajui gen za selekciju. Takav
gen nosi rezistenciju na odreeni inhibitor rasta to omoguuje selekciju ivotinjskih stanica u
kulturi. Plazmidna DNA unosi se i eksprimira nekoliko dana u velikom broju stanica
(prolazna ekspresija). Stabilno transformirane stanice, kod kojih je plazmidna DNA ugraena
u kromosomsku DNA, mogue je izdvojiti na osnovi sposobnosti rasta u mediju koji sadrava
inhibitor rasta.
Gen koji nas zanima
Plazmidna DNA
Ampr
Unos DNA u stanice u kulturi
ori

Gen odgovoran za rezistenciju stanica

na inhibitor rasta
Velik broj stanica unosi i
prolazno eksprimira plazmidnu DNA
Selekcija u mediju koji sadrava
inhibitor rasta
Samo stabilno transformirane stanice
tvore kolonije
Sekvence plazmidne DNA
Stabilno transformirane stanice sadravaju plazmidnu DNA
ugraenu u kromosomsku DNA

www.perpetuum-lab.com

67

Slika 3.34 Retrovirusni vektori

Vektor se sastoji od retrovirusnih sekvenci kloniranih u plazmid koji se moe umnaati u E.
coli. Strane DNA umeu se unutar virusnih sekvenci te se takvi rekombinantni plazmidi
izoliraju u bakterijama. Rekombinantnom DNA transfektiraju se ivotinjske stanice u kulturi.
Samo u mali broj transfektiranih stanica ui e rekombinantna DNA i proizvesti rekombinante
retrovirusne estice. Takvim se rekombinantnim virusima mogu uinkovito transfektirati nove
stanice u kojima e se virusni genom, nositelj eljenih gena, ugraditi u kromosomsku DNA
kao provirus.
Mjesto kloniranja
Plazmidna DNA
Ampr

Retrovirusne sekvence
ori
umetanje fragmenata DNA
izolacija rekombinantnoga plazmida u E. coli
Umetak DNA

Unoenje fragmenata DNA u stanice sisavaca transfekcijom

Nekoliko stanica unosi DNA i
proizvodi rekombinantne virusne estice
Stanice u koje je ula rekombinantna DNA proizvode
retrovirusne estice
Retrovirusne estice nose eljene fragmente DNA
Uinkovita infekcija bakterijskih stanica i ekspresija gena u novim
stanicama
Rekombinantni
provirus
RNA
Protein

www.perpetuum-lab.com

68

Slika 3.35. Proizvodnja transgeninih mieva.

Strana se DNA mikroinjektira u pronukleus oploene mije jajne stanice (oploena jajna
stanica sadrava dva pronukleusa; jedan iz jajne stanice i jedan iz spermija). Takva se jajna
stanica zatim prenosi u surogat majke gdje se razvija. Dio potomstva imat e stranu DNA
ugraenu u svoj genom (transgenino potomstvo).
Mikroinjektiranje plazmidne DNA u
pronukleus oploene jajne stanice
Plazmidna DNA
Pronukleusi
Prijenos embrija u surogat majke
Embriji
Potomstvo
Transgenini mievi

www.perpetuum-lab.com

69

Slika 3.36. Unoenje gena u mia putem embrionalnih matinih stanica.

Embrionalne matine (EM) stanice su kulture stanica izvedene iz ranih mijih embrija
(blastocista). U kulturi in vitro, u EM stanice mogue je unijeti stranu DNA i izolirati stabilno
transfektirane stanice. Takve transformirane EM stanice se zatim injektiraju u blastocistu
primatelja gdje sudjeluju u normalnom razvoju embrija. Neki od mieva koji e se razviti
nakon prijenosa injektiranih embrija u surogat majke sadravat e osim normalnih stanica i
stanice koje su se razvile iz transformiranih EM stanica. Kako su ti mievi mjeavina dvaju
razliitih tipova stanica, kaemo da su kimerni. Krianjem kimernih mieva, u kojima su
transformirane EM stanice ugraene u spolne stanice, nastat e potomstvo koje nosi
transfektirane gene.
Biljeg rezistencije na inhibitor rasta
Blastocista
Plazmidna DNA
Unoenje u embrionalne
matine (EM) stanice u kulturi
Gen koji nas zanima
EM stanice koje nose plazmidne
sekvence ugraene u kromosomsku DNA

Injektiranje transformiranih EM stanica u miju blastocistu

EM stanice
Blastocista
Prijenos u surogat majku

Kimerno potomstvo
Krianje kimernoga s normalnim miem
Nastanak potomstva koje je
naslijedilo transfektirani gen od EM stanica

www.perpetuum-lab.com

70

Slika 3.37. Unoenje gena u biljne stanice pomou Ti plazmida.

Ti plazmid sadrava T regiju na molekuli DNA koja se prenosi u inficirane biljne stanice te
gene virulencije (vir) koji sudjeluju u prijenosu T DNA. U Ti plazmidnim vektorima strana se
DNA umee u T regiju. Rekombinantni se plazmid zatim unosi u bakteriju Agrobacterium
tumefaciens kojom se inficiraju stanice u kulturi. T regija plazmida (koja nosi umetnutu stranu
DNA) prenosi se u biljne stanice i ugrauje u kromosomsku DNA. Na taj nain iz
transformiranih stanica moemo uzgojiti transgeninu biljku.
T regija
Mjesto za kloniranje
Ti plazmid
vir
Umetanje strane DNA u T regiju
DNA umetak
Rekombinantni
plazmid
vir
Unoenje rekombinantnoga plazmida u bakteriju Agrobacterium tumefaciens
Infekcija biljnih stanica
Integracija T DNA
u kromosomsku DNA
Regeneracija transgenine biljke

www.perpetuum-lab.com

71

Slika 3.38. Mutageneza pomou sintetikih oligonukleotida.

Oligonukleotid koji sadrava eljenu promjenu baze koristi se za sintezu plazmidne DNA, a
novosintetizirana molekula cirkularizira se pomou DNA ligaze. Ovim postupkom nastaje
plazmid koji u jednom lancu sadrava normalnu, a u drugom mutiranu bazu. Replikacijom
plazmidne DNA unutar transformiranih bakterija E. coli nastaje smjesa normalnoga i
mutiranoga plazmida.
Gen koji nas zanima
Poetni plazmid
Denaturacija i hibridizacija s mutiranim oligonukleotidom
Sinteza DNA i ligacija
Plazmid koji sadrava nepravilno sparene baze na mjestu mutacije

Poetni plazmid
Transformacija E. coli
Izolacija plazmida nakon
replikacije

Mutant

www.perpetuum-lab.com

72

Slika 3.39. Inaktivacija gena homolognom rekombinacijom.

Mutirana kopija kloniranoga gena unosi se u stanicu. Normalna kopija gena tada se moe
zamijeniti mutiranom kopijom mehanizmom homologne rekombinacije ime nastaje stanica
koja nosi eljenu mutaciju u kromosomskoj DNA.
Stanica koja nosi normalnu kopiju gena

Unos mutirane kopije gena u stanice

Klonirana mutirana
kopija gena
Mutirana DNA rekombinira se s
normalnom kromosomskom kopijom gena
Homologna rekombinacija
Stanice koje nose mutirani gen na mjestu
normalne kopije

www.perpetuum-lab.com

73

Slika 3.40. Inhibicija ekspresije gena protusmislenom RNA ili DNA.

Protusmislena RNA ili jednolanana DNA komplementarna je s molekulom mRNA gena koji
nas zanima, te ona stoga tvori hibride s ciljnom mRNA to blokira prepisivanje mRNA u
protein i rezultira razgradnjom mRNA.
mRNA
protein
Unoenje protusmislene
RNA ili DNA
Protusmislena RNA ili DNA hibridizira s normalnom mRNA.
Sinteza proteina je zaustavljena.

www.perpetuum-lab.com

74

Slika 3.41. RNA interferencija.

Kratke dvolanane molekule RNA povezuju se s ribonukleazom. Razmotavanje dvolanane
RNA i hibridizacija s homolognom mRNA usmjerava nukleazu na mRNA to dovodi do
njezine razgradnje.
Kratka dvolanana RNA
Povezivanje s nukleazom

Razmotavanje
Hibridizacija s ciljnom mRNA

Razgradnja

www.perpetuum-lab.com

75

Slika 3.42. Izravna inhibicija funkcije proteina.

Mikroinjektirana protutijela veu se na proteine u stanicama i inhibiraju njihovu normalnu
funkciju. Osim toga, neki mutirani proteini ometaju funkciju normalnih kopija proteina,
primjerice, kompetirajui s njima za vezanje na ciljne molekule
mRNA
Protein
Protein se vee s ciljnom molekulom u
stanici i obavlja svoju normalnu funkciju
Protutijelo koje prepoznaje
protein koji nas zanima

Inhibitorni mutirani protein

Vezanje protutijela blokira

normalnu funkciju proteina

Mutirani protein blokira djelovanje

normalnoga proteina time to tvori
neaktivne komplekse s ciljnom
molekulom

www.perpetuum-lab.com

76