16S RRNA GEN SECUENCIACIN PARA BACTERIANA DE IDENTIFICACIN EN EL

LABORATORIO DE DIAGNSTICO: VENTAJAS, PELIGROS Y DIFICULTADES

J. Michael Janda and Sharon L. Abbott
El uso de 16S rRNA secuencias de genes para estudiar la filogenia y taxonoma bacteriana ha
sido de lejos el marcador gentico de limpieza ms comn utilizado por un nmero de razones.
Estas razones incluyen (i) su presencia en casi todas las bacterias, a menudo existente como una
familia multignica, o operones; (Ii) la funcin del gen 16S rRNA con el tiempo no ha cambiado,
lo que sugiere que los cambios de secuencia al azar son una medida ms precisa de tiempo
(evolucin); y (iii) el gen 16S rRNA (1500 pb) es lo suficientemente grande para los propsitos
Informtica (12). En 1980 en las listas aprobadas, 1791 nombres vlidos fueron reconocidos en el
rango de las especies. Hoy en da, este nmero se ha disparado a 8.168 especies, un aumento
del 456% (http://www.bacterio.cict.fr /number.html#total). La explosin en el nmero de taxones
reconocido es directamente atribuible a la facilidad en la realizacin de 16S rRNA estudios de
secuenciacin de genes en lugar de las manipulaciones ms complicados relacionados con la
investigacin de hibridacin ADN-ADN. Hibridacin ADN-ADN es inequvocamente el "estndar de
oro" para la nueva especie propuesta y para la asignacin definitiva de una cepa con
propiedades ambiguas a la unidad taxonmica correcta. Sobre la base de la cintica de
reasociacin de ADN-ADN, la definicin gentica de una especie es cuantificable, es decir, (i)
ca. ? 70% de relacin de ADN-ADN y (ii) 5 C o menos? Tm para la estabilidad de molculas de
heterodplex. Ensayos de hibridacin de ADN no son sin sus deficiencias, sin embargo, ser
mucho tiempo, mano de obra intensiva, y costoso de realizar. Hoy en da, cada vez son menos
los laboratorios de todo el mundo realizan tales ensayos, y muchos estudios que describen
nuevas especies se basan nicamente en la subunidad pequea (SSU) secuencias u otros datos
polifsicos.
A principios de 1990 los secuenciadores de ADN disponibilidad en trminos de costo,
metodologas y tecnologa mejoraron drsticamente, de tal manera que muchos centros ahora
pueden permitirse tales instrumentos. En 1994, Stackebrandt y Goebel (15) resumen la aparicin
de la tecnologa de secuencia SSU y su potencial utilidad en la definicin de una especie. Aunque
se ha demostrado que el 16S rRNA de datos de secuencias de genes en una cepa individuo con
un vecino ms cercano que presenta una puntuacin de similitud de? 97% representa una nueva
especie, el sentido de la similitud de resultados? 97% no es tan clara (13). Este ltimo valor
puede representar una nueva especie o, en su defecto, indicar la agrupacin dentro de un taxn
previamente definido. Tradicionalmente se han requerido estudios de hibridacin ADN-ADN para
proporcionar respuestas definitivas a tales preguntas. Mientras 16S rRNA de datos de secuencias
de genes pueden ser utilizados para una multiplicidad de propsitos, a diferencia del ADN de
hibridacin (? 70% reasociacin) no hay "valores umbrales" definidas (por ejemplo, el 98,5% de
similitud) por encima del cual hay un acuerdo universal de lo que constituye definitivo y
identificacin concluyente al rango de especies.
IDENTIFICACIN bacteriano utilizando SECUENCIA rRNA 16S
Bacterias no identificadas o aislados con perfiles ambiguos. Uno de los usos potenciales
ms atractivos de 16S rRNA secuencias de genes informtica es proporcionar gnero y la
identificacin de especies para los aislamientos que no encajan en los perfiles bioqumicos
reconocidos, para las cepas que generan slo una "baja probabilidad" o identificacin
"aceptable", de acuerdo a los sistemas comerciales, o para los grupos taxonmicos que rara vez
se asocia con las enfermedades infecciosas humanas. Los resultados acumulados de un nmero

limitado de estudios hasta la fecha sugieren que la secuenciacin del gen 16S rRNA proporciona
la identificacin del gnero en la mayora de los casos (? 90%), pero no tanto en lo que respecta
a las especies (de 65 a 83%), con 1 a 14% de la aislamientos restantes no identificado despus
de la prueba (5, 11, 17). Las dificultades encontradas para obtener una identificacin de gneros
y especies incluyen el reconocimiento de la novela taxones, muy pocas secuencias depositadas
en las bases de datos de nucletidos, especies compartiendo 16S similares y / o idnticas rRNA
secuencias, o problemas de nomenclatura que surgen de mltiples genomovares asignadas a
una sola especie o complejos.
Aislamientos de rutina. Las encuestas han estudiado la viabilidad de identificar los aislados
clnicos de rutina o grupos especficos de bacterias de importancia mdica utilizando SSU datos
de secuencias de genes. En cada uno de estos estudios, SSU secuencia de datos ha sido
comparado con los resultados de identificacin obtenidos ya sea en formatos de ensayo
convencionales o comerciales (Tabla 1). Un par de observaciones generales se puede hacer de
estas investigaciones, a saber, (i) un mayor porcentaje de identificacin de especies se
obtuvieron utilizando los resultados de la secuencia SSU que con cualquiera de los mtodos
convencionales o comerciales y (ii) la mayora de los estudios, con la excepcin de un estudio
realizado por Fontana et al. (6), han encontrado que 16S produjo tasas de identificacin de
especies de 62 a 91%. En el estudio de Fontana et al. (6) el valor ms cercano de la base de
datos MicroSeq 500 se consider la identificacin no importa lo que fue la puntuacin distancia.
Para las bacterias que son difciles de crecer o identificar las tasas de identificacin fueron
menores con la secuenciacin del 16S rRNA (62 al 83%) que los valores tradicionalmente
aceptables en el laboratorio clnico (es decir,? 90%) (12). Problemas de nuevo giraron en torno a
las bases de datos y grupos completos y precisos que no son fcilmente distinguibles por 16S
rRNA secuenciacin de genes (2, 8).
CUESTIONES
Se desprende de la informacin que se indica en la Tabla 1 que 16S rRNA informacin de la
secuencia del gen tiene un papel cada vez mayor en la identificacin de las bacterias en
entornos de salud clnicos o pblicas. Sin embargo, los datos tambin muestran claramente que
no es infalible y aplicable en todos y cada situacin.
Nomenclatura bacteriana en relacin a 16S rRNA secuenciacin de genes. Hubo ms de
1.700 especies de las 1.980 listas aprobadas, pero esta lista no implica que todos estos taxones
son vlidos. Muchos nombres incluidos son anteriores a los estudios de hibridacin ADN-ADN
moderno y sin duda las investigaciones filogenticas. Por lo tanto, las cepas de tipo para muchas
especies pueden no reflejar con exactitud la totalidad de la composicin genmica de los
nomenspecies, y este tipo de situaciones tienen un impacto directo en los estudios SSU con
referencia a la identificacin microbiana. Existen algunas especies bacterianas como
"phenospecies" o "complejos", es decir, ms de un genomovar (grupo ADN) existe dentro de esa
especie y no pueden separarse fenotpicamente. Ejemplos de este tipo de situaciones incluyen
Enterobacter cloacae (al menos 7 genomovares originalmente), Pseudomonas stutzeri (18
genomovares originalmente), y el gnero Acinetobacter (22 genomovares originalmente).
Resolucin de 16S rRNA secuenciacin de genes. Aunque 16S rRNA secuenciacin de
genes es muy til en lo que respecta a la clasificacin bacteriana, tiene baja potencia
filogentico a nivel de especie y un poder de discriminacin para algunos gneros (2, 11), y los
estudios de parentesco de ADN son necesarias para proporcionar la resolucin absoluta a estos
problemas taxonmicos . El gnero Bacillus es un buen ejemplo de esto. Las cepas tipo de B.

globisporus y B. psychrophilus comparten? 99,5% de similitud de secuencia con respecto a sus

genes 16S rRNA, y sin embargo, en la exposicin de nivel de ADN slo el 23 al 50% en relacin
reacciones de hibridacin recprocas (7). En nuestro laboratorio hemos encontrado que las cepas
de tipo de especies Edwardsiella exhiben 99,35-99,81% de similitud entre s, y sin embargo,
estas tres especies son claramente distinguibles bioqumicamente y por homologa de ADN (28 a
50% de relacin). Estos ejemplos indican que SSU secuencia similitud incluso a un nivel muy alto
no en todos los casos implican la identidad o la precisin de las identificaciones microbianos.
Muchos investigadores han encontrado problemas de resolucin en el gnero y / o nivel de
especie con 16S rRNA datos de secuenciacin de genes (Tabla 2). Estos grupos incluyen (no
exclusivamente), la familia Enterobacteriaceae (en particular, Enterobacter y Pantoea),
micobacterias de crecimiento rpido, el Acinetobacter baumannii-A. complejo calcoaceticus,
Achromobacter, Stenotrophomonas y Actinomyces. Algunos de estos problemas estn
relacionados con la nomenclatura y taxonoma bacteriana, mientras que otros estn relacionados
con diferentes temas citados a continuacin.
Un problema adicional con respecto a la resolucin de 16S rRNA secuenciacin de genes se
refiere a la secuencia de identidad o puntuaciones muy altas de similitud. Los informes han
documentado 16S rRNA similitud de secuencias de genes o de identidad para el grupo
Streptococcus mitis y otros no fermentadores (Tabla 2). En tales casos 16S rRNA de datos de
secuencias de genes no pueden proporcionar una respuesta definitiva ya que no puede distinguir
entre las especies recientemente divergentes (13, 16). En otros casos, la diferencia entre la
coincidencia ms cercana y al lado ms cercano a la cepa desconocida es? 0,5% de divergencia
(? 99,5% de similitud). En estas circunstancias, tales diferencias pequeas no pueden justifica la
eleccin de la medida ms prxima como una identificacin definitiva, aunque en algunos
estudios, esto es exactamente lo que se hizo (6).
Bases de datos de nucletidos pblicos y privados. La utilidad de 16S rRNA secuenciacin
de genes como una herramienta en la identificacin microbiana depende de dos elementos
clave, la deposicin de secuencias completas de nucletidos ambiguos en bases de datos
pblicas o privadas y la aplicacin de la "etiqueta" correcta a cada secuencia. Hace aos la
calidad general de las secuencias de nucletidos depositados en bases de datos pblicas era
cuestionable, ya que muchas deposiciones eran de mala calidad (9, 13). Gran parte de esta
informacin errnea que estaba originalmente presente en dichas bases de datos se cree que
han sido corregidas; Sin embargo, un reciente estudio multicntrico del Reino Unido (1) estima
conservadoramente que por lo menos el 5% de las 1.399 secuencias buscado tena errores
sustanciales asociados a ellos que van desde quimeras (64%) a la secuencia de errores o
anomalas (35%). Un estudio de 1995 por Clayton et al. (4) tambin revel que al menos el 26%
de 16S rRNA secuencia de pares de genes (dos secuencias depositadas para la misma especie)
en Gen-Bank tena? 1% de errores de secuenciacin aleatoria y, de ellos, casi la mitad tena? 2%
de errores de secuenciacin aleatoria .
La identificacin de especies definicin utilizando rRNA 16S de datos de secuencias de
genes. Desafortunadamente, no existe una definicin universal para la identificacin de
especies a travs de 16S rRNA secuenciacin de genes, y los autores varan ampliamente en su
uso de criterios aceptables para el establecimiento de un partido de "especies" (Tabla 1). En
ninguno de estos estudios hace la definicin de una especie "partido" nunca supere el 99% de
similitud (? 1% de divergencia). Sobre la base de los datos enumerados anteriormente, incluso
este valor umbral puede no ser suficiente en todos los casos para garantizar una identificacin
precisa. En el caso de Aeromonas veronii el genoma puede contener hasta seis copias del gen
16S rRNA que difieren hasta en un 1,5% entre s. Esto implica la heterogeneidad intragenomic

del gen 16S rRNA entre Aeromonas y excluira el uso de esta tecnologa por s sola para la
identificacin de especies. Los datos colectivos descritos anteriormente fuertemente sugieren
que las identificaciones microbianos utilizando 16S rRNA puntuaciones distancia de? 1% no son
satisfactorios para un laboratorio de referencia de la salud pblica o de diagnstico.
Cuestiones diversas. Un nmero de otras cuestiones relacionadas con la secuenciacin de
genes SSU merecen una breve mencin. Estos incluyen el nmero de ambigedades de posicin,
secuencia de las lagunas, y el uso de vaco y / o programas nongapped con respecto a la
evaluacin y anlisis de la secuencia. Otras preocupaciones implican aislar pureza, los mtodos
de extraccin de ADN, y la posible formacin molcula quimrica (9, 16, 17). Todos estos
problemas hasta cierto punto afectan identificaciones finales.
POSIBLES SOLUCIONES
El uso de 16S rRNA secuenciacin de genes en el laboratorio clnico se est convirtiendo en lugar
comn para la identificacin de bacterias no identificadas bioqumicamente o para proporcionar
identificaciones de referencia para las cepas inusuales. Aunque algunos investigadores nunca lo
hara pregunta utilizando una identificacin molecular sobre una convencional, 16S rRNA
secuenciacin de genes no es infalible, y ejemplos de tales identificaciones errneas se han
publicado (3). Aunque est claro que la secuenciacin SSU juega un papel importante en la
identificacin de los aislamientos desconocidos o aquellos con perfiles bioqumicos ambiguos, es
menos claro lo que el papel es en otras situaciones. Una cuestin intrigante refiere cmo es
exacto es nuestra identificacin rutinaria de especies muy comunes utilizando metodologas
convencionales o sistemas comerciales. A pesar de que se considera generalmente que estas
identificaciones son muy precisas, ahora tenemos un mecanismo ms conveniente y preciso
para el control de estas identificaciones en una base molecular. Tales estudios deben ser
realizados y publicados.
El uso de 16S rRNA secuenciacin de genes microbianos para identificaciones definitivas y para
su publicacin requiere un conjunto armnico de directrices para la interpretacin de los datos
de secuencia que debe aplicarse para que los resultados de un estudio se puedan comparar con
precisin a otro. En 2000, Drancourt et al. (5) hecho varias recomendaciones relativas a los
criterios propuestos para 16S rRNA secuenciacin de genes como mtodo de referencia para la
identificacin de bacterias. Apoyamos las directrices del Drancourt para incluir 16S rRNA
secuencias de genes completos siempre que sea posible y, en particular, para grupos tales como
especies de Campylobacter que absolutamente lo requieran para identificaciones de especies
precisos. Tabla 3 se expande en estas recomendaciones para su uso en el diagnstico ajuste.
Est claro que el uso apropiado de esta tecnologa requiere la adopcin de normas similares a las
previamente definidas para la hibridacin ADN-ADN. Debido a que la adaptacin del 16S rRNA
secuenciacin de genes como una herramienta en la identificacin de especies es un fenmeno
relativamente nuevo en la mayora de los laboratorios clnicos, tales normas lo ms probable
siguen evolucionando con el tiempo. Adems, el uso de las tecnologas de microarraybased con
16S u otros objetivos de limpieza de genes en el futuro puede proporcionar una plataforma
mucho ms sensible y definitiva para la identificacin de especies moleculares en el futuro.
TABLA 1. 16S identificacin de especies para los aislamientos de rutina.
TABLA 2. Ejemplos seleccionados de los gneros y especies con problemas de identificacin
bacteriana utilizando 16S Rrna para secuenciacin de genes.

TABLA 3. Directrices recomendadas para uso de 16S rRNA secuenciacin de genes para la
identificacin microbiana.
Cepa a ser secuenciado .............................................. ................Fentica perfil de la cepa no es
conocido por grupo general a presentar dificultades para la identificacin por anlisis de genes
16S rRNA (Tabla 2) Para las cepas, tales como los de la Tabla 2 que requieren identificacin
molecular, se requiere otra limpieza de genes (por ejemplo, rpoB)
16S rRNA secuenciacin de genes .............................................. ....... mnima: 500-525 pb
secuencia; ideales: 1300 a 1500 pb secuenciado < 1% ambigedades de posicin
Criterios para la identificacin de especies ............................................ mnima: > 99% de
similitud de secuencia; ideales: > 99.5% partido Secuencia de similitud de secuencia es escribir
cepa o referencia cepa de especie que ha sido objeto de estudios de ADN relacin Para los
partidos con las puntuaciones de < 0.5% a la siguiente especie ms cercanos, otras propiedades,
incluyendo fenotipo, se debe considerar en la final la identificacin de especies.