Universidad de Santiago de Chile.

Facultad de Qumica y Biologa.

Tcnico universitario en anlisis qumico fsico.

Informe de laboratorio N3 y 4

Medios de Cultivo y Tcnicas de

Tincin

Laboratorio de Microbiologa.
Tcnico Universitario en Anlisis Qumico y Fsico
Integrantes: Eliseo Antigual
Mara Jos Muoz
Docente: Miguel Castro
Ayudante: Maximiliano Figueroa
Fecha: Abril 30 de 2015

Introduccin.

La amplia gama de bacterias existentes, hace necesario conocer de tcnicas

de cultivo y tincin que pueden orientarnos en el reconocimiento de un tipo
en particular de bacteria. La mayora de los microorganismos pueden
cultivarse en medios nutritivos para el estudio de sus propiedades. La
proliferacin de bacterias es el resultado de una interaccin entre diferentes
sustancias alimenticias, principios activos y factores fsicos (temperatura,
pH) que intervienen en su crecimiento (1)
Al momento de tener una muestra donde se requiere identificar una
determinada especie de bacteria, hay que definir en una primera instancia,
que medios de cultivo utilizar para el crecimiento de colonias bacteriana,
existes medios que son selectivos para un determinado tipo. Hay medios
nutritivos que permiten el crecimiento de todo tipo de microorganismos,
estos son utilizados para verificar la viabilidad de estas bacterias. Los
medios selectivos son muy utilizados cuando se trabaja con muestras que
provienen de reas que poseen una flora bacteriana abundante, y estos
permiten el crecimiento de cierto tipo de bacterias, dado por las
caractersticas del medio; por ejemplo el agar Mac Conkey, permite el
reconocimiento de bacterias que son Gram negativos, en este agar no
crecen bacterias Gram positivas. Y as como tambin existen medios que
son an ms especficos, donde adems de seleccionar son capaces de
diferenciar entre especies. (2)
Para microorganismos entricos, habituales del intestino de los animales y
humanos; y, en ciertos casos, son causantes de patologas graves, los
medios usados de modo habitual contienen ciertos colorantes e ingredientes
que inhiben crecimiento de microorganismo Gram positivos y permite la
propagacin de bacilos estricos Gram negativos, por ejemplo Mac Conkey.
(3)
Otras herramientas utilizadas a la hora de la identificacin de
microorganismo, como Escherichia coli y Basillus Subtilis utilizadas en este
estudio, corresponden a las tcnicas de tincin; las que nos permiten
observar al microscopio y en detalle determinar la presencia o ausencia de
ciertas caractersticas de algunas bacterias. Podemos comprobar si son
Gram (+) o (-) por medio de la tcnica de tincin Gram. Tambin existen
tcnicas en las que se puede observar la presencia de esporas, capsulas, o
simplemente saber la forma y agrupacin de la bacteria en estudio.

Objetivos:
General:

Caracterizar mediante medios de cultivo diferenciales y tinciones

para muestras de bacterias.

Especficos:

Aprender tcnicas de cultivo nutritivo y diferencial.

Manejar tcnicas de tincin bsicas.
Manejar tcnicas de tincin diferencial.
Conocer tcnicas de tincin estructural.

Metodologa
a) Medios de cultivo: De dos cepas, Escherichia coli y Basillus Subtillis,
se realiz dos siembras en medios distintos; con ayuda de un asa loop
se procedi a tomar una muestra de cada una y sembrar en una
placa, previamente dividida en dos secciones, una de agar LB y otra
de agar Mac Conkey.
Para una muestra de la Prctica anterior, Control de ambiente, se
eligi dos colonias al azar, y se procedi a sembrar en dos medios
distintos agar LB y agar Mac Conkey. Se dej incubar a 35 C por 48
horas.
b) Tcnicas de tincin:
Tincin con colorantes bsicos: se procedi a fijar las muestras,
depositando una gota de muestra sobre el portaobjeto y se sec con
ayuda del mechero, pasando el portaobjetos sin permitir que el vidrio
se sobrecaliente. Una vez fijada la muestra, se dejaron los
portaobjetos sobre la malla en el lavadero.
Colorante
Azul de metileno
Cristal violeta
Calbol-fucsina

Tiempo de accin
30 a 60 segundos
10 segundos
5 segundos

Para teir, se cubrieron las preparaciones con 4 a 6 gotas de colorantes, y

se mantuvo as por el tiempo especfica para cada uno. Luego se lav la
preparacin con agua destilada. Se secaron los portaobjetos con papel
absorbente, sin refregar, para no perder la muestra. Se terminaron de secar
cerca del mechero, tomando precaucin de que no se calentaran.
Se observ cada preparacin con el objetivo de inmersin (100x), se dibuj
las observaciones realizadas.

Tincin diferencial: Se prepar un frotis de los cultivos que fueron

proporcionados (E. coli, B. subtilis), adems de un control elegido por
nosotros. Se fijaron por medio de la aplicacin de calor. Se procedi a teir
la muestra con cristal violeta (4 6 gotas) por al menos 30 segundos. Se
lav con agua de una piseta. Se cubri con solucin de yodo (4 6 gotas) y
mantuvo por 30 segundos. Se lav con abundante agua. Luego se procedi
a decolorar con alcohol:cetona (3:1). Se lav con agua de manera
intermitente hasta que no se desprenda el colorante. Luego se tio con el
colorante de contraste, safranina, y se dej actuar por 30 segundos. Se lav
con agua y se sec suavemente con papel absorbente. Se termin de secar
en los alrededores del mechero, sin calentar la muestra. Se observ la
preparacin bajo el objetivo de inmersin (100x), sin olvidar el aceite de
inmersin.
Tincin estructural:
a. Tincin de endosporas: se prepar un frotis de Basillus Subtillis,
de la misma forma que las preparaciones anteriores. Se puso el
portaobjeto dentro de un bao mara. Se cubri con pequeos trozos
de papel absorbente, se saturo con la solucin de Verde de Malaquita
(solucin acuosa al 5%) y se continu calentando por 5 minutos.
Lavar con agua. Se realiz tincin de contraste con safranina por al
menos 30 segundos. Se lav con agua y se dej secar cerca del
mechero, procurando no calentar la muestra. Se examin con el
objetivo de inmersin. Y se dibuj lo observado.
b. Tincin de cpsulas: se prepar un frotis de Klebsiella
pneumoneae. Se dej caer una gota de tinta china sobre una esquina
del portaobjeto. Con ayuda de otro portaobjeto limpio puesto sobre la
gota de tinta china, para esparcir la gota sobre el portaobjeto con la
muestra. Se sec al mechero frotando con la muestra hacia arriba del
portaobjeto. Se tio con la solucin contraste, safranina, por al menos
30 segundos. Se lav con agua y se dej secar alrededor del mechero
sin calentar la muestra. Se observ con el objeto de inmersin y se
dibuj.

Resultados

Muestra

Observacione
s

Escherichia
Coli
Basillus
Subtilis
Agar LB

El medio LB permite
el crecimiento de una
amplia
gama
de
bacterias, este medio
es
utilizado
para
conocer la viabilidad
de las bacterias. Para
este caso fue posible
observar crecimiento
en ambos tipos. Para
Escherichia coli se
observ
colonias
aisladas, estas con
bordes redondeados,
tonalidad amarillenta,
y elevacin cncava.
No as para Basillus
Subtilis
donde
el
crecimiento fue de
manera
excesiva,bordes
irregulares.

Imagen

Escherichia
coli
Basillus
Subtilis
Agar Mac
Conkey

Bacterias
Control 1 y
2 en Agar
LB

Agar Mac Conkey es

un
medio
de
diferenciacin
selectivo
para
el
aislamiento
de
enterobacterias
y
otros bacilos Gram
negativos. En la placa
se
observ
el
crecimiento de E. coli,
adems la coloracin
del
agar
cambia
debido
a
la
fermentacin de la
lactosa, de un rojo
fuerte
a
un
rojo
plido. Colonias de
color amarillento.
Para ambos control se
observa crecimiento.
C 1 de color naranjo y
C2
de
un
tono
amarillento.
Ambos
presentan
bordes
regulares,
elevacin
cncava.
No
se
Observ
colonias aisladas para
ningn caso.

Control 1 y
2 Agar Mac
Conkey

Tincin

Para este cultivo, no

hubo crecimiento. Lo
que
nos
hizo
determinar en una
primera instancia que
ambos
tipos
bacterianos son Gram
Positivo, debido a que
este
medio
es
selectivo
para
bacterias de este tipo.

Observacione Imagen
s
Escherichia coli.

Azul te
metileno

Cristal
violeta

Con este medio de

tincin
bsico
fue
posible
observar
forma y agrupacin
bacteriana. Este tipo
celular presenta una
forma
de
bacilo
reducido en tamao.
Se
observaron
algunas agrupaciones
en forma de racimo y
formando duos.
No se pudo observar
detalles internos de la
bacteria.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)
La bacteria se tio
completo de violeta,
consiguiendo generar
un contraste con el
medio externo. La
forma de la bacteria
es
de
bacilos
pequeos.
Se
encuentran agrupados
en duos y racimos. No
fue posible observar
detalles interiores con
esta
tincin.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

CarbolFucsina

Gram

Las Bacterias fueron

teidas
de
color
rosado, se observan
agrupaciones
en
racimo, y forma de
bastn
pequeos.
Escherichia coli es
clasificada en textos
como un cocobacilo,
pues su tamao no es
suficiente
para
caracterizarlo
como
un bacilo.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)
Se
observan
cocobacilos o bacilos
rectos,
con
los
extremos
redondeados.
Se
tieron de rosado,
confirmando lo que se
haba observado en el
cultivo en medio agar
Mac Conkey., que es
una bacteria de tipo
Gram negativo.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Basillus Subtilis
Azul de
Metileno

Se
pudo
observar
detalladamente
la
forma de la bacteria,
corresponden
a
bacilos, donde existe
agrupacin formando
diplobacilos o cadena
de
bacilos
(estreptobacilos).
Son coloreadas azul
fuerte, por lo tanto el
colorante penetra de
forma uniforme en la
celular. No es posible
observar
detalles

internos de la clula.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Cristal
Violeta

Carbol
Fucsina

Se observ la muestra
teida
de
color
violeta, la clula se
ti completa con el
colorante, su forma es
de bacilo y fue posible
observar
duos
(diplobacilos)
y
cadenas de bacilos.
sta tcnica de tincin
permite solo crear un
contraste
con
el
medio externo.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)
Las clulas fueron
teidas por completo
con
el
colorante,
rosadas. Fue posible
observar en detalle
forma y agrupacin de
las bacterias. Bacillus
subtilis
presenta
forma
de
bastn
(bacilo) y se agrupa
en
cadenas
(estreptobacilos)
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Gram

Esporas

Este tipo de bacteria

es Gram positivo, por
este tipo de tincin
diferencial
se
observan
de
color
morado. As como en
el medio de cultivo
con Agar Mac Conkey
donde
no
hubo
crecimiento.
Se
observan
bacilos
alargados
con
extremos
redondeados,
y
agrupaciones
formando cadenas.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)
Fue posible observar
la
presencia
de
endosporas ubicadas
de forma central en la
bacteria. Estas son de
color verde por la
accin del colorante.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Control 1

Azul de
metileno

Cristal
Violeta

Carbol
Fucsina

Las
clulas
se
observaron
por
completo coloreadas
azul, no se pudo
apreciar detalles de
estructuras internas.
Present
forma
redondeada (coco) y
agrupaciones
en
racimo (estafilococos).
Con este tipo de
tincin no es posible
observar
detalles
internos.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)
La muestra se ti de
color violeta, solo es
posible
observar
forma y agrupacin de
las bacterias. Para
este tipo celular que
present
forma
redonda,
denominndose coco
y agrupacin en forma
de
racimo,
estafilococo.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)
El tratamiento de la
muestra
con
este
colorante bsico, nos
cre un contraste con
el medio externo, se
pudo detallar la forma
de la bacteria y su
agrupacin. Present
forma redondeada y
se agrupa en forma
de
racimos.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Gram

Este tipo de tincin

diferencial,
caracterizo a la clula
como Gram positivo,
ya que se ti de
morado. Aportando a
la
informacin
entregada
por
el
medio
de
cultivo
selectivo agar Mac
Conkey.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Esporas

Esta
bacteria,
desconocida,
separada de la prueba
de
control
de
ambiente,
present
endosporas. Las que
por medio de este tipo
de tincin se observan
de color verde y en
los extremos de la
clula. No es posible
observarlas en todas,
solo en una cantidad
reducida
de
la
muestra.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Cpsula

Para este tipo de

tincin estructural no
fue posible observar
la
presencia
de
cpsula para este tipo
de
bacteria
Gram
positiva. Donde se
observa la bacteria
teida
de
manera
uniforme.
De
esta
manera es posible
asegurar
que
no
cuenta con cpsula.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Klebsiella pneumoneae
Cpsula.

La muestra fue teida

con tinta china, la que
gener una tincin
negativa, puesto que
se ti el medio
externo, dejando el
interior de la clula
incoloro. Se genera
una
especia
de
espacio
entre
la
capsula
y
la
membrana, lo que
hizo posible asegurar
la
presencia
de
cpsula.
Observado
con
Objetivo de Inmersin
(100x)

Discusin
Dentro del marco de discusin se pueden enmarcar diferentes
aspectos importantes y fundamentales a considerar, en cuanto a lo que se
relaciona con los medios de cultivo utilizados. El medio LB permite
comprobar la viabilidad de las muestras, para todos los casos hubo
crecimiento, para el agar Mac Conkey los resultados obtenidos son
congruentes con su fundamento, puesto que este medio solo permite el
crecimiento de bacterias Gram negativos, tal y como se observ. Este medio
se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo,
aerobios y anaerobios facultativos. El agar Mac Conkey permite diferenciar
bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y
alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan
en el mismo. En el caso de la bacteria en estudio se comprob que esta era
viable y adems se determin que es Gram positiva. (2)(3)
Al observar los resultados de los mtodos de tincin utilizados es importante
destacar que la clave est dada en el momento de la fijacin de la muestra,
esta debe ser cuidadosa puesto que es un riesgo calentarla demasiado y
quemarla, por otro lado tambin existe un punto crtico al momento de
retirar el exceso del colorante con el agua, este debe ser lento y cuidadoso.
(1)

La diferencia entre las bacterias Gram positivas y negativas est dada por la
presencia de una pared de peptidoglicano, la que en bacterias Gram
positivas es gruesa, permitiendo que el colorante quede atrapado entre sus
cadenas y no se produzca la decoloracin en esa etapa de la tincin; no as
las bacterias Gram negativo donde esta pared de peptidoglicano es
delgada, por lo tanto el colorante se pierde en el proceso de decoloracin.
La tincin
estructural nos otorga ms datos, con respecto a las
caractersticas de las bacterias.
Con las observaciones realizadas no es posible dar un nombre especfico
para la bacteria en estudio, pero si se obtuvo datos caractersticos de esta.
Lo que con un estudio con mayor especificidad nos permitira llegar a
determinar que bacteria es exactamente.

Conclusin
Los medios de cultivos permiten a grandes rasgos diferenciar y
observar colonias bacterianas y caracterizarlas macroscpicamente.
Mediante los medios diferenciales podemos separar o distinguir entre unos
tipos de bacterias y otros.
Ahora bien si se desea buscar caractersticas microscpicas los mtodos de
tincin son los indicados, estos permiten diferenciar formas y agrupaciones
de las bacterias, adems de las tinciones especificas o diferenciales, como
por ejemplo la tincin de Gram que es una herramienta muy til en el
laboratorio de microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnostico
medico siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para
poder tener una correcta interpretacin de los datos que nos otorga la
diferenciacin de Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la
estructura de sus paredes celulares tendrn o no propiedades patolgicas
diferentes.

Los diferentes tipos de tincin estructuras nos entregan ms detalles de las

caractersticas celulares, es de importancia destacar que los mtodos
utilizados son simples, pero de suma importancia.

Referencias
(1) Vera, G. (1994) Introduccin a la Microbiologa (2da Ed.). Pginas 56 a
59. Editorial EUNED. Costa Rica.
(2) Gerard J. Tortora, Berdell R. Funke, Christine L. Case. (2007).
Introduccin a la Microbiologa (9a Ed.). Pginas 168 a 187. Editorial
Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
(3) Granados, R., Vilaverde, M.C.,(2003). Microbiologa, Tomo I
Bacteriologa. Caractersticas y clasificacin bacteriana. Virologa.
Caractersticas y tcnicas bioqumicas . (1ra Ed.). Pginas 226 a 246.
Editorial Paraninfo. Madrid, Espaa.