PRAKTIKUM KIMIA FARMASI ANALISIS II

VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR PARACETAMOL

DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

Rini Anggraeni P
P17335112036
Farmasi IIB

JURUSAN FARMASI POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG

2013-2014

PRAKTIKUM KIMIA FARMASI ANALISIS II

VALIDASI METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR PARACETAMOL
DENGAN MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS

I.

TUJUAN
1. Agar mahasiswa dapat memahami Uji Akurasi dalam proses validasi analisis
penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
2. Agar mahasiswa dapat memahami Uji Presisi dalam proses validasi analisis
penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
3. Agar mahasiswa dapat memahami Uji Linieritas dalam proses validasi analisis
penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
4. Agar mahasiswa dapat memahami Uji LOD & LOQ dalam proses validasi analisis
penetapan kadar Paracetamol dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.

II.

PENDAHULUAN
Tujuan utama yang harus dicapai dari suatu kegiatan analisis kimia adalah
dihasilkannya data uji yang valid. Secara sederhana hasil uji yang valid dapat
digambarkan sebagai hasil uji yang mempunyai akurasi (accuracy) dan presisi
(precission) yang baik.
Menurut ISO/IEC, Validasi diartikan sebagai kegiatan konfirmasi melalui pengujian
dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu maksud
khusus harus terpenuhi.
Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi kerja suatu
metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin keakuratan dan kedapat
ulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi risiko penyimpangan yang mungkin
timbul.
Terdapat 8 parameter validasi metode analisis yakni spesifisitas, ketelitian,
ketepatan, linieritas, kisaran, limit deteksi, limit kuantitasi, ketangguhan, sedangkan
parameter yang harus dipenuhi untuk validasi metode analisis produk obat-obatan
meliputi spesifisitas, linieritas, kisaran, limit deteksi, limit kuantisasi, ketelitian dan
ketepatan.
Paracetamol merupakan zat aktif pada obat yang banyak digunakan dan
dimanfaatkan sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol tergolong kedalam
kelompok besar antiinflamasi nonsteroid (Non Steroid Antiinflamatory Drugs/NSAIDS)

Dalam Farmakope Indonesia Edisi IV (Hal:649-650), Parasetamol mempunyai

beberapa sinonim yakni Parasetamolum, Asetaminofen, dan 4-hidroksiasetanilida.
Dengan rumus kimia C8H9NO2 dan berat molekul 151,16, senyawa ini berwujud serbuk
hablur berwarna putih, tidak berbau dengan rasa sedikit pahit. Paracetamol bersifat
mudah larut dalam etanol, air mendidih dan dalam NaOH 1N.
III.

HASIL PENGAMATAN dan PEMBAHASAN

1. Uji Akurasi
Akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan
kadar analit yang sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali
(recovery) analit yang ditambahkan.
Uji ini dilakukan kepada contoh yang diperkaya (spike) dengan sejumlah analit yang
diketahui kuantitasnya. Spike adalah matriks contoh yang mengandung suatu kisaran
analit. Diharapkan nilai recovery yang dihasilkan mendekati 100%. Pengujian ini
bertujuan

untuk

mengetahui

adanya

kesalahan

sisematik.

Untuk

syarat

rentang recovery yang diterima tergantung dari jumlah analit yang akan diukur.
Analit pada matriks sampel (%)
100
>10
>1
>0,1
0,01
0,001
0,0001 (1 ppm)
0,00001 (100 ppb)
0,000001 (10 ppb)
0,0000001 (1 ppb )
Sumber : Harmita, 2004

Rata-rata yang diperoleh (%)

98-102
98-102
97-103
95-105
90-107
90-107
80-110
80-110
60-115
40-120

Prosedur Kerja:
Akurasi dievaluasi dengan metode penambahan baku (standard addition method),
dengan membuat 3 konsentrasi dengan rentang spesifik 80, 100 dan 120%, dengan 3
replikasi dan setiap rentang spesifik mengandung 70% sampel dan 30% baku
pembanding.

Sampel ditimbang dengan bobot setara 336, 420, dan 504 mg parasetamol
kemudian diekstraksi sebanyak 3 kali dan volumenya dicukupkan dengan etanol secara
berturut-turut hingga 100,0 mL; 100,0 mL dan 100,0 mL sehingga diperoleh total 9 hasil
ekstraksi. Tiap hasil ekstraksi dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur 10 mL, ditambah
etanol hingga 10 mL, lalu dipipet sebanyak 1 mL dan diencerkan hingga 10 mL, dipipet
lagi 1 mL dan diencerkan kembali hingga 10 mL. Larutan terakhir ini diukur serapannya
pada panjang gelombang 245 nm.

Rentang
spesifik
(%)

Replik
asi

80

100

120

1
2
3
1
2
3
1
2
3

Konsentrasi (ppm)
Sampel
(ppm)

Baku
(ppm)

Sampel
+ baku

% recovery

3,3463
3,2607
3,2887
4,0782
4,0138
3,9959
4,9008
4,9051
4,8987

1,44
1,44
1,44
1,8
1,8
1,8
2,16
2,16
2,16

4,693
4,5866
4,6084
5,6774
5,6208
5,6177
6,7678
6,99
6,6309

93,52
92,08
91,65
88,84
89,28
90,10
86,44
96,52
80,19

Rata-rata
SYARAT
KESIMPULAN

89,85

80-110
AKURASI BAIK

Pembahasan :
Dari hasil pengujian akurasi didapat nilai rentang recovery sebesar 80,19%
96,52%. Nilai rentang recovery ini memenuhi persyaratan persen recovery, yakni
sebesar 80 110%. Hal ini menunjukkan bahwa penetapan kadar Parasetamol dengan
menggunakan Spektrofotometri UV-VIS memiliki akurasi yang baik.

2. Uji Presisi
Uji presisi adalah uji yang dilakukan untuk menentukan kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang-ulang pada sampel yang diambil dari campuran yang
homogen.
Ada tiga jenis presisi yaitu repeatability (keterulangan), presisi antara, dan
reprodusibitas (ketertiruan).
a. Repeatabiliy (keterulangan)
Keterulangan adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang
sama untuk beberapa sampel yang kadarnya sama yang dilakukan oleh satu
orang analis pada waktu terhadap beberapa sampel yang sama. Keterulangan
diukur terhadap 6 jenis sampel dengan konsentrasi yang sama (100% dari
konsentrasi actual) atau 3 jenis sampel dengan konsentrasi 80, 100, 120% dari
konsentrasi actual yang ditetapkan masing-masing tiga kali (triplikasi).
b. Presisi antara
Presisi antara adalah pengukuran kinerja metode dimana sampel-sampel diuji
dan dibandingkan dilakukan oleh analis yang berbeda. Menggunakan peralatan
berbeda dan pada hari yang berbeda. Presisi antara tidak perlu diuji jika kajian
reprodusibilitas telah dilakukan.
c. Reprodusibilitas (ketertiruan)
Uji ketertiruan adalah pengujian presisi yang terakhir dan tuntas. Reprodusibilitas
diuji dengan cara menyiapkan sampel yang homogeny dan stabil, lalu diuji oleh
beberapa laboratorium (studi kolaboratif). Hasil ini akan memperlihatkan adanya
galat acak yang disebabkan oleh sampel dan laboratorium, serta galat
sistematik. Datanya diolah dengan uji ANOVA.

Penetapan Kadar Sampel

Dua puluh tablet merek dagang ditimbang satu persatu dan dihitung bobot rataratanya. Tablet diserbukkan lalu ditimbang seksama 472,0 mg, dimasukkan ke dalam
gelas Erlenmeyer yang berisi 25 mL etanol, dikocok, lalu disaring, diulangi sebanyak 3
kali, kemudian dicukupkan volumenya hingga 100 mL. Dari larutan tersebut dipipet 1 mL
ke dalam labu tentukur 10 mL, ditambah etanol hingga 10 mL, kemudian dipipet
sebanyak 1 mL dan diencerkan hingga 10 mL, dipipet lagi 1 mL dan diencerkan kembali
hingga 10 mL, lalu diukur serapannya pada gelombang 245 nm.
Data Kadar Sampel dan Absorbansi Sampel
Bobot setara
(mg)

Replikasi

Absorban
si Sampel

Konsentra
si Sampel

Konsentrasi
Standar

Absorbansi
Standar

Kadar
Sampel (%)

(ppm)
1
2
3
1
2
3
1
2
3

80

100

120

0,30986
0,30167
0,30435
0,37991
0,37375
0,37204
0,45865
0,45906
0,45844

3,3463
3,2607
3,2887
4,0782
4,0138
3,9959
4,9008
4,9051
4,8987

(ppm)

0,55362

Hasil Pengujian Kadar Parasetamol Dengan Uji Presisi

Pengulangan
ke1
2
3
4
5
6
7
8
9

Kadar
Parasetam
ol (%)
100,36
100,27
100,30
100,96
100,92
100,91
101,43
101,43
101,42

xi-x

(xi-x)2

-0,53
-0,62
-0,59
0,07
0,03
0,02
0,54
0,54
0,53

0,2797
0,3830
0,3468
0,0051
0,0010
0,0004
0,2928
0,2928
0,2821

(xi-x)2

1,8837

(xi-x)2/(n-1)

0,235461111

Rata-rata (x)
100,89
SD
0,4852
RSD
0,0048
CV
(pengukuran)
0,4810
C (10^-6)
0,0001
log C
-3,9962
CV Horwitz
5,2730
Syarat
CV PENGUKURAN < CV HORWITZ
Kesimpulan
PRESISI BAIK
Rumus-rumus Yang Digunakan:

100,36
100,27
100,30
100,96
100,92
100,91
101,43
101,43
101,42

Pembahasan :
Parameter yang digunakan untuk menyatakan presisi adalah simpangan baku (SD),
simpangan baku relative (RSD), dan koefisien variansi (CV). Dalam uji presisi ini, presisi
dikatakan baik apabila CV pengukuran < CV Horwitz. Dari data pengukuran diatas
diketahui CV pengukuran adalah 0,4810 dan CV Horwitz yang telah dihitung dengan rumus
: 0,66 x 2(1-0,5 log C) didapat sebesar 5,2730. Sehingga nilai CV pengukuran lebih kecil dari
nilai CV Horwitz. Maka, dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang dilakukan memiliki
presisi yang baik karena sudah memenuhi persyaratan tersebut.

3. Uji Linieritas
Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas suatu metode merupakan ukuran
seberapa baik kurva kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan
konsentrasi (x). linieritas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada
konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan
metode kuadrat terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope),
intersep, dan koefisien korelasinya.
Parameter ini harus di uji untuk analisa uji yang menggunakan perbandingan
(perbandingan dengan standar). Batas keberterimaan yang dikehendaki adalah r =

0.995. Kurva kalibrasi harus linier karena jika kurva kalibrasi sudah tidak linier lagi, maka
kesalahan hasil dalam analisa uji perbandingan semakin besar.
Prosedur dari uji Linieritas adalah sebagai berikut:
Pembuatan Larutan Baku
Parasetamol (p.a.) ditimbang teliti sebanyak 60 mg, dimasukkan ke dalam labu tentukur
10,0 mL, ditambah etanol hingga 10 mL, lalu dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur 10 mL,
dan ditambah etanol hingga 10 mL.
Pembuatan Kurva Baku
Sebanyak 50 mg parasetamol (p.a.) yang ditimbang teliti dimasukkan ke dalam labu
tentukur 50 mL, ditambah etanol hingga 50 mL, lalu dipipet 1 mL ke dalam labu tentukur
10 mL, ditambah dengan etanol hingga 10 mL, dipipet sebanyak 5 mL dan diencerkan
hingga 50 mL, kemudian dipipet kembali sebanyak 1, 2, 3, 4, 5, 6 dan 7 mL, masingmasing dicukupkan volumenya dengan etanol hingga 10 mL. Serapan masing-masing
diukur pada gelombang 245 nm.

Hasil Absorbansi Untuk Uji Linieritas :

No

Konsentrasi
(ppm) (x)

Absorbansi (y)

1
2
3
4
5
6
7

1
2
3
4
5
6
7

0,0198
0,1876
0,2765
0,3869
0,4617
0,5771
0,6982

28

2,6078

Rata-rata
Intersep
(a)
Slope (b)
r (square)
r

0,372542857

xy
0,0198
0,3752
0,8295
1,5476
2,3085
3,4626
4,8874
13,4306
1,918657
143

-0,0559
0,1071
0,992
0,9960

SYARAT
KESIMPULAN
Grafik Kurva Kalibrasi Dari Data Diatas

r > 0,98
LINIERITAS BAIK

x2
1
4
9
16
25
36
49
140

y2
0,000392
0,035194
0,076452
0,149692
0,213167
0,333044
0,487483
1,295424

20

0,185061

(x)2
784

0.8
0.7

f(x) = 0.11x - 0.06

R = 0.99

0.6
0.5
0.4

Linear ()

0.3
0.2
0.1
0
0

Rumus-rumus yang digunakan :

Pembahasan :
Dari data diatas, didapat nilai r sebesar

0,9960. Nilai r dikatakan baik apabila

nilanya mendekati 1. Suatu metode bersifat linear jika nilai R 2nya lebih besar dari 0,98.
Dalam pengukuran didapat nilai R2 sebesar 0,992.Maka, dapat disimpulkan bahwa
metode analisis memiliki nilai linieritas yang baik.
4. Uji Limit Deteksi dan Limit Kuantisasi
LOD (Limit Of Detection) atau batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah
dalam sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.
LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di
bawah nilai tersebut. LOD dapat dihitung berdasarkan pada standar deviasi (SD) respon

dan kemiringan (slope, S) kurva baku pada level yang mendekati LOD. Standar deviasi
respon dapat ditentukan berdasarkan pada standar deviasi blanko, standar deviasi
residual dari garis regresi, atau standar deviasi intersep y pada garis regresi.
LOQ (Limit Of Quantification) atau batas kuantifikasi didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan
akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan.
Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai konsentrasi.

Prinsip Pengujian:
Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis segresi
linier dari kurva kalibrasi yang di dapat dari uji linearitas. Untuk mendapat nilai batas
deteksi dan kuantitasi gunakan nilai slope (b) dan simpangan baku residual (SDx).

Hasil Absorbansi Blanko:

Pengulanga
n ke1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Absrobansi blanko

xi-x

(xi-x)2

0,0000
0,0002
0,0001
0,0003
0,0002
0,0004
0,0001
0,0005
0,0003
0,0002

-0,00023
-0,00003
-0,00013
0,00007
-0,00003
0,00017
-0,00013
0,00027
0,00007
-0,00003

0,0000001
0,0000000
0,0000000
0,0000000
0,0000000
0,0000000
0,0000000
0,0000001
0,0000000
0,0000000

(xi-x)2

0,0000002

Rata-rata (x)
SD
b
LOD
LOQ

(xi-x)2/(n-1)

0,000000022
3

0,00023
0,00015
0,10710
0,00419
0,01395

Pembahasan :
Dari perhitungan tersebut didapat nilai LOD = 0,00419 dan LOQ = 0,01395. Dapat
disimpulkan sebagai berikut :

Alat dapat mendeteksi sampel hingga konsentrasinya 0,1778 mg/L. Apabila

konsentrasi sampel dibawah 0,1778 mg/L maka alat tidak dapat mendeteksi. Dan
jika konsentrasinya diatas 0,1778 mg/L maka alat dapat mendeteksi tetapi presisi

dan akurasinya kurang baik dan tidak dapat di pertanggung jawabkan.

Alat dapat mendeteksi sampel hingga konsentrasinya 0,5927 mg/L. Apabila
konsentrasinya dibawah 0,5927 mg/L maka alat dapat mendeteksi tetapi dengan
presisi dan akurasi yang kurang baik. Dan jika konsentrasinya diatas 0,5927
mg/L maka alat dapat mendeteksi dan hasilnya dapat dikuantifikasi.