Facultad de Medicina

SONDAS GNICAS
COMERCIALES
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.
CURSO:

ESTUDIANTE:

INTRODUCCIN
Desde hace muchos aos los investigadores haban utilizado el cdigo gentico para
determinar la secuencia de ADN que codifica la serie de aminocidos que componen
parte de la protena de la hemoglobina. Pero no tenan medios para realizar un examen
aislado del ADN indicador de entre el restante ADN de los 100.000 genes de una clula
humana, para poder saber si el gen era normal o no.
Posteriormente, despus de varios estudios se utilizaron fragmentos de ADN clonados
con secuencias que se igualan con una secuencia de ADN del gen objeto de inters (por
ejemplo, el gen de la hemoglobina) llamadas sondas gnicas, y hoy en da se le est
dando mucha importancia al estudio de enfermedades genticas, ya que estas producen
un efecto devastador a nivel mundial, afectando las poblaciones humanas, por ello la
produccin de sondas gnicas, que permiten la deteccin temprana de estas
enfermedades, es importante en el mbito medico y cientfico, ya que permiten realizar
diagnsticos ms exactos e incluso diagnsticos predictivos de estas enfermedades, para
de este modo estudiarlas y tratarlas.

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OBJETIVOS

Dar informacin til para aumentar el conocimiento de

nuestros compaeros acerca del tema Sondas Gnicas

Brindar puntos claros acerca del concepto,

deteccin de las sondas Gnicas

Saber la utilidad que tienen las Sondas Gnicas

importancia,

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SONDAS GNICAS COMERCIALES

Muchos mtodos de anlisis de ADN implican el uso de sondas de cidos nucleicos y el
proceso de hibridacin
Sonda
Una sonda gentica consiste en un fragmento de ADN complementario a la secuencia
que se busca y a la que se unir de manera especfica. La unin al ADN, puede
detectarse marcando la sonda con "etiquetas qumicas"
El uso de PCR y de sondas moleculares que reconozcan secuencias de ADN asociadas a
enfermedades genticas, permite detectar al gen involucrado, en cantidades nfimas
material gentico obtenido de tejido de adultos o de embriones de humanos y animales.
Una sola sonda puede reconocer su homlogo nico entre millones. La sonda precisa en
un mnimo de 20 nucletidos.
Tcnicas de la biologa molecular resultan ser importantes herramientas:

identificacin de individuos y sus productos

deteccin y diagnostico de enfermedades tanto genticas como infecciosa
seleccin de individuos portadores de un genotipo especifico como progenitores
en programas de mejoramiento gentico

La informacin gentica de un organismo dado est contenida en el ADN (cido

desoxirribonucleico) que se ubica en el ncleo de cada clula de este organismo.
Por su parte, un nucletido est formado por una azcar, un grupo fosfato y una de
cuatro diferentes bases nitrogenadas. Estas bases son representadas de manera simple
utilizando la inicial en mayscula de su nombre, de modo que:
A: Adenina
T: Timina
G: Guanina
C: Citosina.
Aunque todos los organismos de una misma especie tienen caractersticas comunes, los
genes que codifican para esas caractersticas y la naturaleza misma de la caracterstica
no son idnticas en todos los individuos, pues en millones de aos de evolucin se han
ido produciendo pequeos cambios en los genes que codifican para caractersticas
individuales, los que han sido heredados a las generaciones siguientes.
Sondas de cidos nucleicos
Las sondas de cidos nucleicos son secuencias de ADN o de ARN que se han marcado,
radiactivamente o no, y que se pueden utilizar para detectar fragmentos de ADN o de
ARN con homologa de secuencia. Las sondas de cidos nucleicos son generalmente
sondas de ADN. Pueden proceder de mltiples fuentes incluyendo secuencias de ADN
genmico aleatorias, secuencia de ADNc, genes especficos y secuencias de
oligonucletidos obtenidos mediante sntesis basada en la secuencia de protenas. Una

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sonda de ADN puede marcarse de diferentes maneras, ya sea mediante nucletidos

marcados con 32P o sistemas no radiactivos de marcado, como los nucletidos
biotinilados que se introducen en las molculas de ADN. Los sitios donde las sondas de
ADN marcadas radiactivamente hibridan con las secuencias de ADN complementarios
sobre un filtro de celulosa se pueden localizar mediante autorradiografas mientras que
el marcador con biotina se puede detectar por su elevada afinidad a la estreptavidina.
Hibridacin de los cidos nucleicos
La hibridacin con los cidos nucleicos implica la mezcla de ADN de diferentes
orgenes que han sido desnaturalizados por calor o tratamiento con lcalis para
separarlos en hebras nicas y permitir el emparejamiento de las bases complementarias
de las secuencias homlogas en las condiciones adecuadas. Si una de las fuentes de
ADN se ha marcado de alguna manera, es decir, si se trata de una sonda de ADN,
pueden identificarse secuencias especficas. Los dos mtodos principales de hibridacin
de los cidos nucleicos son el Southern blot y el Nothern blot.
Hibridacin por sondas
Las sondas son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas,
sustratos antignicos, quimioluminiscencia o radioispotos, los que se pueden unir con
una alta especificidad a una secuencia complementaria de cido nucleico.
Existen varias condiciones que afectan el proceso de unin o hibridacin entre la sonda
y el segmento blanco, como:
Temperatura
concentracin de sal
pH de la reaccin.
Indicaciones para el uso de sondas en el laboratorio
Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una
muestra clnica (expectoracin, orina, etctera) o para confirmar la identificacin de un
cultivo que por otros mtodos tarda varios das (Legionella pneumophila, Chlamydia
trachomatis, etc).
Adems, las sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para evaluar la respuesta
del husped a un agente infecciosos en particular y tambin para determinar la extensin
de la infeccin mediante el estudio de muestras de tejidos de varios rganos.

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TECNOLOGAS GENTICAS
Los cientficos han desarrollado una serie de tcnicas bioqumicas y genticas mediante
las cuales el ADN puede ser separado y transferido de una clula a otra. Algunos de esos
mtodos de laboratorio ayudan a los investigadores a estudiar las propiedades de los
genes en la naturaleza (permiten, por ejemplo, comparar los ADN de diferentes
animales para establecer distancias evolutivas).
Otras tcnicas de ADN constituyen herramientas bsicas en el campo de la ingeniera
gentica (alteracin de genes de un organismo).

Para localizar un gen especfico en un cromosoma determinado se utiliza una

sonda de ADN, que es un gen clonado o copiado al que se agrega un tomo
radiactivo. La sonda marcada selecciona un segmento de ADN complementario
y se une a dicho segmento; la sonda en cuestin se puede detectar entonces
mediante sofisticadas tcnicas de fotografa. Con este procedimiento se
diagnostica un buen nmero de enfermedades antes del nacimiento o despus del
mismo.

Southern blot
El Southern blot, denominado as en honor de Ed Southern, que desarroll la tcnica,
consiste en la digestin del ADN mediante una enzima de restriccin y que a
continuacin se somete a electrofororesis en un gel de agarosa. Con ello se consigue
separar los fragmentos de restriccin del ADN por tamaos, siendo los fragmentos ms

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pequeos los que corren ms rpido en el gel. Los fragmentos de ADN del gel se
desnaturalizan a continuacin con lcalis, convirtindose en fragmentos de hebra
simple. Una copia permanentemente de estos fragmentos se transfieren a un filtro de
nitrocelulosa que se une al ADN monocatenario marcado radiactivamente con 32P que
hibridar con el fragmento de ADN homlogo del Southern blot, el cual a su vez puede
ser detectado mediante autorradiografa.
Secante de Southern.
Para encontrar una mutacin de un gen determinado en una muestra de ADN los
cientficos usan una sonda de ADN, un tramo de ADN de un solo filamento que
coincide con parte del gen y se une a un tomo radioactivo.
La sonda de un solo filamento busca y se une al gen. Las seales radioactivas de la
sonda aparecen despus en la radiografa, mostrando dnde se emparejan la sonda y el
gen.
Northern blot
El Northern blot difiere del Southern blot en que utiliza ARN mensajero como cido
nucleico diana en el mismo procedimiento. El ARNm es muy inestable debido a las
ribonucleasas celulares intrnsecas. El uso de inhibidores de ribonucleasas permite el
aislamiento del ARN mensajero que, si se corre en un gel electrofortico, se puede
transferir a un filtro. Hibridando el blot con una sonda de ADN marcada
radiactivamente se puede determinar el tamao y la cantidad del transcrito de
mensajero, denominndose a esta tcnica Northern blot. En una alteracin gnica en la
que no se han identificado mutaciones en la secuencia codificante, una alteracin en el
tamao del transcrito sugiera la posibilidad de una mutacin en una regin no
codificante del gen, como la zona de unin intrn-exn. El Northern blot puede
utilizarse tambin para demostrar un modelo de expresin diferente de un determinado
gen en diferentes tejidos o en diferentes estadios del desarrollo.
Hibridizacin con sondas
Los recientes avances en el campo de la biologa molecular y el conocimiento cada vez
mayor de los virus que causan infecciones importantes en la comunidad, han hecho
posible que en el momento se disponga de fragmentos de ADN del material genmico
especfico y altamente conservado de un determinado virus que se utiliza como sonda.

Para estudios de ARN se requieren tejidos frescos congelados rpidamente con

nitrgeno lquido y para estudios de ADN se pueden emplear tanto tejidos
fijados como congelados.

Las sondas preparadas a partir del ADN o ARN especfico se pueden purificar
por clonacin o copia en un plsmido del ADN o del ADNc (complementario)
obtenido de transcripciones de ARN. Utilizando el plsmido como vector y
bacterias como huspedes, es posible producir sondas genticas en grandes
cantidades.

Los fragmentos de ADN o ARN (sondas) se someten a un anlisis de

hibridizacin (o apareamiento con el complementario que se encuentra en el
material que se va a probar); ste se puede hacer ya sea con ADN o ARN tisular

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en solucin, directamente en tejidos o clulas por hibridizacin in situ, o se

puede efectuar sobre ADN o ARN transferidos en membranas de nitrocelulosa a
partir de una electroforesis en gel de agarosa.
La sensibilidad de las sondas depende de la cantidad de material gentico para la
hibridizacin y su especificidad depende de la calidad de la sonda.
Una de las principales limitaciones de esta tcnica se ve cuando existe una baja cantidad
de ADN o ARN y ste no se descubre. Muchas de estas pruebas tienen una sensibilidad
que les permite descubrir 105-106 molculas o aun 103-104 molculas; sin embargo,
esto puede ser insuficiente en muchas situaciones clnicas.
Sondas gnicas comerciales

La caracterizacin de genes que codifican caracteres cuantitativos con

importancia econmica o de genes causantes de enfermedades congnitas ha
llegado a tener mucha importancia.

Por su parte las enfermedades genticas, aunque menos diseminadas, producen

un resultado similar, afectando poblaciones humanas y animales.

Caractersticas

Consiste en un fragmento de ADN complementario a la secuencia que se busca y

a la que se unir de manera especfica.

Estas etiquetas pueden ser molculas marcadas con radiactividad o molculas

portadoras de tomos fluorescentes que pueden ser detectadas por
autorradiografa la primera o con detectores de fluorescencia las segundas

El diagnstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, un

conocimiento de los factores contribuyentes significativos que influyan en la
aparicin de la enfermedad.

La identificacin de los agentes causales o etiolgicos de la enfermedad es hecha

mediante la aplicacin de mtodos cientficos de investigacin.

DEMOSTRACIN DEL AGENTE

Pueden ser:

Altamente sensitivos.

Adicionalmente utilizados para una demostracin definitiva de que un

organismo pertenece a una especie particular

Se pueden dar a travs de

Antgenos: son sustancias moleculares complejas y los anticuerpos especficos
Formados para ellos, reconocen figuras particulares conocidas como determinadores de
antgenos o eptopos.
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Eptopos: son cada uno de los sitios discretos de una macromolcula que son
reconocidos individualmente por un anticuerpo especfico o por un TCR
especfico.
Anticuerpos: La R.C. son ms comunes para los anticuerpos policlonales que para los
anticuerpos monoclonales
PRUEBAS DE DETECCIN USANDO ANTICUERPOS

Inmunofluorescencia y Elisa, se usa para la deteccin de antgenos virales en la

preparacin de diagnsticos.
El anticuerpo fluorescente es usado para detectar antgenos en los tejidos.
ELISA, es usado para detectar antgenos en fluidos o extractos crudos de tejidos.
Todos los organismos vivientes poseen ADN excepto los virus q poseen ARN.
S.G. es un pequeo segmento de bases de ADN, el cual se combinara con un
filamento homologo de ADN.
La S.G. puede ser altamente sensible y muy especifica.
El microorganismo de ADN puede ser detectado en las secciones de tejido
fijadas con un proceso llamado hibridizacion in situ.

SONDAS DE ADN Y ARN

Para identificar cada fragmento no es necesario determinar la secuencia total de

sus bases los mtodos mas usados para identificar un ADN o un ARN
Las sondas de ADN son muy tiles para fines diagnsticos
Fragmento de cadena simple de ADN o ARN de varios cientos o miles de
nucletidos de longitud, que permite poner de manifiesto la presencia de una
secuencia complementaria en una muestra biolgica
La Hibridacin del ADN por una sonda de ADN se llama tcnica de Southern
Blot. Las sondas gnicas permiten encontrar un determinado trozo de ADN de
unas pocas bases pares en una cadena de 6 x 109 bases pares. y ello lo consigue
gracias al marcaje con P32
Cuando el uso de una sonda gnica, marcada con un producto fluorescente, se
hace sobre una clula, a la tcnica se la denomina "fluorescence in situ
hybridization" (FISH).
El ARN mensajero, procedente del ADN, puede volver a reconstituirse en ADN
mediante la enzima transcriptasa inversa, y ser clonado en una bacteria. Este
ADN no tiene intrones, es decir, equivale a los axones del ADN de la clula. Se
le denomina ADN complementario (ADNc), siendo utilizado para actuar como
sonda gnica.

MARCADORES MOLECULARES

Estas tcnicas utilizan los fundamentos de la tcnica de PCR y las ms usadas

incluyen polimorfismos en el largo de fragmentos de restriccin (RFLP),
nmero variable de secuencias nucleotdicas repetidas en tandem (VNTR),
polimorfismos conformacionales de hebra simple (SSCP), electroforesis en gel
denaturante en gradiente (DGGE), amplificacin al azar de ADN polimrfico
(RAPD) y por ltimo, los mtodos que usan el polimorfismo de secuencias
nucleotdicas cortas repetidas en tandem como son los microsatlites

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Esta identificacin permite:

Seleccionar los progenitores en un programa de mejoramiento gentico

Identificar el gen (o grupos de ellos) que codifican para la caracterstica a
seleccionar, pero cuyo genotipo es difcil de visualizar a simple vista.
Determinar a qu variedad gentica pertenece un individuo, estimar su pool
gentico y determinar su origen.

Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante

Hibridacin in situ fluorescente (FISH)
FISH (del ingles fluorescent in situ hybridization) es una herramienta tecnolgica
relativamente nueva que combina la citogentica convencional con la gentica
molecular que se basa en la capacidad nica de una hebra sencilla de ADN, por ejemplo,
una sonda para unirse o hibridar con su secuencia complementaria donde quiera que
sta est localizada en la extensin metafasica aunque con menos frecuencia que otros
mtodos usados para el anlisis cromosmico, FISH puede tambin usarse para estudiar
cromosomas durante la interfase, periodo de descanso entre las divisiones celulares de
aqu que este rea de estudio se denomine interface citogentica.
En esta tcnica la sonda de ADN se conjuga con nucletidos modificados, los cuales,
despus de hibridar con la muestra problema, permiten que la regin en la cual ha
ocurrido la hibridacin se pueda visualizar con luz ultravioleta. Esta tcnica FISH tiene
ahora una amplia difusin para diagnsticos clnicos, ya que sus resultados se obtienen
rpidamente.
Diferentes tipos de sondas FISH
Sondas centromricas
Consisten en secuencias repetitivas de ADN a nivel centromrico en un cromosoma
especfico. Se utilizan en diagnostico prenatal para una deteccin rpida de aneuploidas
(trisomia 13, 18, 21) usando clulas en interfase obtenidas de las vellosidades
corinicas.
Sondas unilocus
Son especficas para un locus particular. Se utilizan con xito en la identificacin de
minsculas deleciones y duplicaciones submicroscpicas. En grupo de trastornos
conocidos como sndromes por microdeleciones
Pintar cromosomas
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en particular.
Cuando esta mezcla de sondas se usa en una hibridacin, el cromosoma entero floorece,
por lo que decimos que esta pintado. Pintar cromosomas es muy til para caracterizar
reordenamientos complejos, tales como translocaciones sutiles y para identificar el
origen de material adicional de un cromosoma, como pequeos marcadores de
supernumerarios o anillos.

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Pintar a la inversa
En este procedimiento una porcin de material cromosmico no identificado, pequeos
marcadores supernumerarios o anillos, se usa para pintar por hibridacin una metafase
normal. El cromosoma no identificado se obtiene por separacin de clulas activadas
por fluorescencia, el cual es amplificado utilizando la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) para preparar dicha pintura. El origen del segmento no identificado se
obtiene mediante la identificacin del cromosoma sobre el cual se hibrida.
Deteccin a nivel de reacciones inmunolgicas
Hay numerosos marcadores en los antgenos de los eritrocitos
SONDEOS GNICOS EN MBITOS CLNICOS
Caractersticas:

El PGH nos acerca a un nuevo tipo de prctica clnica, la que se ha dado en

llamar Medicina Genmica y Predictiva.
Determinacin de anomalas genticas.
Revolucin Del diagnstico y el pronstico

Posibilidades de diagnstico gentico

Sondeo prenatal
Amniocentsis
Extraccin de vellosidades corinicas (transcervical o transabdominal ).
Extraccin y purificacin de sangre perifrica materna muestras de clulas
fetales.
Sondeo neonatal: Fenilcetonuria, Hipotiroidismo congnito, Galactosemia,
Anemia falciforme, Tay-Sachs.

ESTUDIOS EN EL LABORATORIO

Antes: pruebas se reducan al cariotipo.

Herramientas de la Ingeniera Gentica y con la informacin del PGH.
Objetivo: informacin a las parejas sobre la situacin del feto, actual o futura.
Obviamente, el horizonte es el del recurso al aborto en el caso de
"malformacin" o posibilidad de enfermedad grave futura.

PRUEBAS GENTICAS PREDICTIVAS

Si la enfermedad en cuestin es incurable e inhabilitante, esa informacin puede
ser ms peligrosa que el mismo factor gentico de riesgo.
Psicolgicamente devastadora para el individuo.

Actualmente existen tests predicativos para enfermedades monognicas de

manifestacin tarda como la corea de Huntington, Alzheimer hereditario,
poliquistosis renal, hemocromatosis y cncer hereditario de ovario.
Pruebas de susceptibilidad a enfermedades multifactoriales.

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CONCLUSIONES

Las sondas gnicas tienen una gran importancia para el diagnostico temprano y
la prediccin de la aparicin de diferentes enfermedades gnicas.

El ARN mensajero puede ser usado como una sonda gnica.

Las sondas gnicas una vez unidas a sus homlogos de ADN pueden ser
detectadas mediante autorradiografias o detectores de fluorescencia.

El diagnostico predictivo de enfermedades gnicas puede causar un gran

impacto emocional sobre el paciente, es por ello que es importante considerar
esto antes de informarlo sobre su enfermedad.

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BIBLIOGRAFIA

ROBERT F MUELLER. LAN D YOUNG. Gentica Mdica. 10ma. Edicin

Emerys. Madrid Espaa.2001

JORDE L, CAREY J, BAMSHAD M, WHITE R. Gentica del Desarrollo. En:

Gentica Mdica. 2 Edicion. Harcourt, Madrid, 2000.

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