UC: Biologia Molecular - 2 sem 2014

Coordenadores:

Prof. Julio Cezar Franco de Oliveira: Cincias Biolgicas Integral 4 termo

juliunifesp@yahoo.com.br
Profa. Ileana Rubio : Farmcia e Bioqumica Integral 4 termo

Profa. Lcia Armelin Correa: Farmcia e Bioqumica Noturno 6 termo

Facebook: Monitoria Biomol

Monitores: Mariana, Carolina, Filipe

Pelo Facebook cadastrem-se no grupo dos monitores

Cronograma
Data

Bio

BioMol Biologia - sextas 14-18hs Florestan

TEMAS DE AULAS

15/ago

22/ago

Julio

Abertura da UC_TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 1

Julio

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 2

Marcelo
29/ago

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 3

12/set

Julio

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 4

19/set

Julio

PRTICA: EXTRAO DE DNA / DIGESTO DE DNA

26/set

Julio

PRTICA: PCR / ELETROFORESE

03/out

Julio

10/out

Julio

PROVA 1
REGULAO DA EXPRESSO GNICA

17/out

Julio

CONSTRUO DE BIBLIOTECAS

Lcia
24/out

O CNCER UMA DOENA GENTICA

31/out

Julio

INFORMAO GENMICA

07/nov

Julio

14/nov

Julio

SEMINRIOS

21/nov

Julio

Prova 2

28/nov

Julio

Prova Sub

05/12/2014

Julio

EXAME

ORGANISMOS MODIFICADOS GENETICAMENTE

Avaliao
2 Provas tericas (P1 e P2)
Seminrios (S)
P1+P2+S / 3 = Mdia
Mdia:
>= 6,0 aprovao direta
3,0 a 5,9 Exame
0 a 2,9 reprovao automtica

Prova Substitutiva (fechada)

Exame

Frequncia
A frequncia importante? SIM ela FUNDAMENTAL !!!
Mnimo de 75% de frequncia, ou seja:
At 4 faltas Aprovado na frequncia

5 faltas Reprovao AUTOMTICA na UC !

A frequncia responsabilidade Do Aluno !

Seminrios

Sugesto aos grupos: Escolham Temas que despertem no grupo INTERESSE !

O que te motivou a escolher o curso de Cincias Biolgicas ?

Que rea da Biologia interessa mais ao grupo ?
Que atuao Profissional como BILOGO voc poderia almejar ?
Qual a vantagem (e a perda) em ser aprovado nesta UC
sem levar em considerao as questes acima ?

Temas de seminrios de outras turmas

-Metilao do DNA
-TRANSGNICOS
-Engenharia gentica aplicada nanobiotecnologia: caracterizao
sntese e aplicaes da Spider Silk, Introduo biomecnica molecular
-Modificao do morango para uma melhor adaptao aos impactos
diversos das mudanas climticas.
-Determinao da presena de AKT no ncleo de clulas de melanoma e
sua interao com substratos envolvidos na regulao da sobrevivncia
celular.

-Investigao Forense
-Utilizao da PCR-TR no diagnstico de meningite
-Biologia Forense

-Sequenciamento genmico para conservao da biodiversidade

No basta escrever........

... preciso que o Professor

consiga ler!!!!!!

Bibliografia

1- Biologia Molecular da Clula - Alberts cols (2009)

2- Gentica - Um Enfoque Conceitual , Pierce, Benjamin A.

3- Biologia Molecular do Gene - 5 Ed. 2006 , Watson, James D.; Baker, Tania A.;
Bell, Stephen P.

4- Introduo Gentica - 8 Edio 2006 , Gelbart, William M.; Lewontin, Richard

C.; Anthony J. F. Griffiths.

5- Genes VII - Tratado de Gentica Molecular, Benjamin Lewin

6- Gene VIII, Benzamin Lewin (2004) (disiponvel na internet)

A Cincia do DNA, Micklos, David A, & Freyer, Greg A.
7- DNA Recombinante - Genes e Genomas, James D. Watson; Richard M. Myers;
Amy A. Caudy; Jan A. Witkowski

8- Molecular biology of the cell Alberts (2003) (disiponvel na internet)

Livros disponveis na biblioteca

Consultem e estudem pelos livros !!!

Sugesto de leitura

FUNPEC-Editora
R$29,61 : submarino, americanas

Biologia Molecular - Definio

O objetivo da Biologia Molecular
encontrar, na estrutura de
macromolculas, interpretaes
para os fundamentos da vida

Jacques Monod
1910 - 1976

pela descoberta do controle

gentico da sntese das

enzimas
Nobel de Fisiologia ou Medicina - 1965

Cincia Multi-disciplinar
Microbiologia

Bioinformatica

Paleontologia
Ecologia

Gentica

Bioqumica

Biologia Molecular

Que molcula contm e transmite as caractersticas

hereditrias nos seres vivos?

Frederick Griffith

(1879 - 1941)

1928: Estudando uma vacina contra

a pneumonia na pandemia de gripe
espanhola aps a 1 Guerra Mundial

Streptococcus pneumoniae
Cepa lisa virulenta (S)
Cepa rugosa no-virulenta (R)

Griffith, F., The significance of pneumococcal types (1928) J. Hyg. 27, 113-159.

O princpio transformante

O experimento de Griffiht havia mostrado que cepas

bacterianas no-patognicas podem se tornar infecciosas
quando misturadas com uma cepa virulenta inativada por calor
(Princpio Transformante)

1944: Identificaram o principio transformante

Oswald Avery

Colin McLeod

Maclyn McCarty

1877 - 1955

1909 - 1972

1911 - 2005

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

O princpio transformante

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

O princpio transformante

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

O princpio transformante

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

O princpio transformante

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

O princpio transformante

Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types, (1944) J. Exp. Med. 79:137-158.

Martha Chase
Alfred Hershey

(1930 - 2003)
(1908 - 1997)

1952: Durante a infeco viral,

apenas o material gentico
viral transferido para a clula
hospedeira e promove a
produo de novas partculas
virais

Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.

Experimento de Hershey e Chase

O Experimento do Liquidificador

35S

Protenas

Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.

Experimento de Hershey e Chase

O Experimento do Liquidificador

35S

Protenas

32P

DNA

Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.

Martha Chase
Alfred Hershey

(1930 - 2003)
(1908 - 1997)

Usando marcadores radioativos, mostraram que o

DNA de um vrus, e no suas protenas, que programam
as clulas infectadas para fazer cpias do vrus

Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.

Martha Chase
Alfred Hershey

(1930 - 2003)
(1908 - 1997)

1952: Experimento do Liquidificador

pela descoberta do mecanismo de

replicao e da estrutura gentica

dos vrus
Nobel de Fisiologia ou Medicina - 1969

Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage, (1952) J. Gen. Physiol.36: 39-56.

Erwin Chargaff

(1905 - 2002)

1948: A razo molar A-T e G-C

sempre a mesma em diferentes
organismos estudados

Organismo

A/T

G/C

Mycobacterium
tuberculosis

15.1

14.6

34.9

35.4

1.03

0.99

Ourio-do-mar

32.8

32.1

17.7

18.4

1.02

0.96

Levedura

31.3

32.9

18.7

17.1

0.95

1.09

Rato

28.6

28.4

21.4

21.5

1.00

1.00

Homem (fgado)

30.3

30.3

19.5

19.9

1.00

0.98

Valores em porcentagem (%)

Desoxypentosenuclease in Yeast and Specific Nature of Its Cellular Regulation, (1948) Science, 108(2814):628-629.

Maurice Wilkins
Rosalind Franklin

(1916 - 2007)
(1920 1958)

1952: Wilkins e Franklin obtm excelente imagem da molcula

de DNA (difrao de raio-X)

Revelando uma repetio regular de blocos moleculares

correspondendo aos nucleotdeos e estrutura compatvel com
uma alfa-hlice (Repeties de 34 ngstroms e Largura de 20 ngstroms )

Wilkins, M.H.F., Stokes, A.R., and Wilson, H.R. (1953) Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171:738-740.
Franklin, R. and Gosling, R.G. (1953) Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. Nature 171:740-741.

Francis Crick
James Watson

(1916 - 2007)
(1928)

1953: Propuseram um modelo para a estrutura do DNA

Watson and Crick, Molecular structure of nucleic acids, (1953) Nature 171::737-738.

25-04-1953

Watson, J.D. and Crick, F.H.C. (1953) Molecular structure of nucleic acids. Nature 171::737-738.

Contriburam para o modelo.....

Erwin Chargaff
Quantificou as bases nitrogenadas (adenina, timina, citosina e
guanina) em diferentes organismos e demonstrou existir uma
razo constante entre A-T e C-G
(Evidncia para pareamento entre as bases nas duas fitas de DNA)

Linus Pauling
Descreveu a estrutura de alfa-hlice para protenas
(Mostrou que estrutura de alfa-hlice era possvel)

Rosalind Franklin e Maurice Wilkins

Realizaram estudos de difrao de raios-X com DNA
(Seus dados foram fundamentais proposio da estrutura da
dupla-hlice)

Wilkins

Perutz

Crick

Steinbeck

Watson

Kendrew

por suas descobertas a respeito da estrutura

molecular dos cidos nuclicos e sua
significncia para a transferncia da
informao nos seres vivos

Nobel de Fisiologia ou Medicina - 1962

O Modelo de Watson e Crick

A estrutura molecular do DNA

Ligao Fosfodiester: 3-hidroxila da desoxirribose (nt 1) +

grupo fosfato (nt 2)
Esqueleto
Acar-Fosfato

O Modelo de Watson e Crick

A estrutura molecular do DNA
Dupla-fita complementar

A
C

T
G

O Modelo de Watson e Crick

A estrutura molecular do DNA
As fitas so anti-paralelas

Tcnicas de Biologia Molecular 1

PURIFICAO DE DNA/RNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO

DNA LIGASE

ELETROFORESE

Pergunta do projeto/seminrio:
o que vou estudar?
Dogma Central da Biologia

Mutaes, nmero de
cpias do gene: DNA

Expresso gnica: RNAm Protena

Localizao celular: protena
Atividade biolgica: protena

Material a ter DNA/RNA/Protenas extrados

Cultura de clulas (bacteriana- clulas humanaslevedura etc).
Amostra tecidos fresco e congelado
Amostra de tecidos em blocos de parafina
Sangue perifrico

Programa

PURIFICAO DE DNA e RNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO

DNA LIGASE

ELETROFORESE

Relevncia
Geralmente, a extrao de DNA o primeiro
passo de uma anlise molecular:
Testes forenses
Identificao de organismos
Diagnstico de doenas
(identificao de mutaes)
Isolar genes = clonagem
Sequenciamento

Extrao de RNA:
- Determinar expresso gnica (RNAm)
- Isolar genes = clonagem
- Regulao da expresso gnica (microRNAs)

Consideraes Iniciais
Natureza/Origem do cido nuclico

DNA ou RNA
Procarioto ou eucarioto
Nuclear ou de organela
Genmico ou plasmidial

Quantidade (ilimitada/limitada)
Pureza/qualidade (baixa, alta)

 O DNA e RNAs esto localizados no interior das clulas

Envolto por todas as estruturas celulares
necessrio isol-lo do contedo celular
Procarionte

Eucarionte
DNA
Cromatina
RNAm

DNA
Plasmidial

DNA
cromossmico

RNAr
RNAm
RNAt

DNA

Citoplasma
Membrana plasmtica
Parede celular
Cpsula

RNAr
RNAt

Estratgias de extrao de DNA

1- Desintegrao dos tecidos e/ou lisar as clulas
2- Extrao e Solubilizao do DNA
3- Processo de purificao
Extrao com solventes orgnicos
(fenol/clorofrmio); ou
Processos cromatogrficos
Troca inica
Filtrao em gel
Afinidade

Precipitao

1-Desintegrao dos tecidos

Aumento da superfcie de contato
Usar foras mecnicas para romper a integridade
do tecido e expor as clulas
Quanto menor o tamanho dos fragmentos do
tecido, maior ser a
superfcie de contato
e a exposio ao
tampo de extrao
Logo, mais eficiente
ser a extrao

2- Extrao e solubilizao do DNA

Tampo de Extrao
Tem a funo de solubilizar os cidos nuclicos
Pode auxiliar na lise das clulas, ncleos e organelas
Pode ocorrer simultaneamente ou no desintegrao
(adio de Tampo de Extrao antes ou aps a desintegrao)

2- Extrao e solubilizao do DNA

Tampo de Extrao
Principais constituintes
Substncias tamponantes (pH=8)
Detergentes
Inibidores de nucleases (quelantes
de ctions - inibe as DNAses)
Proteases

2- Extrao e solubilizao do DNA

Tampo de Extrao
Detergentes
Dissolvem os lipdios das membranas (celular e nuclear)
Dissociam as protenas dos cidos nuclicos
Inibem ao das nucleases (desnaturao)

Regio hidrofbica

aninico

CH3 - Br
|
+
CH3- (CH2)15 - N - CH3

CH3
CH3
Triton X-100 ou Nonidet P-40
n = 9 - 10

CH3-(CH2)11-O-S-O- Na+
dodecil sulfato de sdio
lauril sulfato de sdio
SDS

HO

CH3

+
O- Na

brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamnio
(cetil = hexadecil) CTAB

sarcosina

lauroil

CH3

CH3

O
=

O(CH2 -CH 20)n H

lauril

CH3 -C-CH2 -C

CH3

CH3

No inico

CH3

CH3- (CH2)10 - C - N - CH2 - C

O- Na+

HO

deoxicolato de sdio

lauroil sarcosinato de sdio

sarcosil

2- Extrao
Tampo de Extrao
Proteases
Clivam as protenas que se ligam ao DNA e enzimas que
degradam DNA e outras protenas, inativam nucleases.
(Pronase E ou Protenase K)

Inibidores de nucleases
DNases
A grande maioria depende de Mg2+ como cofator
EDTA quelante Mg2+ e inibe ao das DNases

RNases

Muito estveis
Resistem a desnaturao trmica
No requerem cofatores
Inibidores extremamente potentes DEPC (cancergeno)

Resultado: uma
sopa formada
pelos restos celulares,
cidos nuclicos e
contedo
citoplasmtico

3- Purificao do DNA
Solvel (DNA) vs. Insolvel
O extrato fracionado em
material solvel (DNA) e material
insolvel (restos celulares)
Centrifugao
Filtrao

3- Purificao de DNA
DNA vs. outros solutos
Solventes orgnicos
Fenol (pH8,0) / Clorofrmio
Desnatura e extrai as protenas
DNA na fase aquosa
Protenas na fase orgnica

Dificuldades

Demorado
Trabalhoso
Txico
Perde material

3- Purificao de DNA
Precipitao
Adio de sal (NaCl, NaOAc, NH4OAc, KOAc)
Os ctions monovalentes se ligam aos grupamentos fosfato do
DNA, neutralizando suas cargas eltricas
Minimiza a repulso eletrosttica entre as molculas de DNA,
permitindo que elas se agreguem e precipitem

Adio de lcool (etanol, isopropanol)

O lcool promove a retirada das molculas de gua que revestem
os cidos nuclicos, provocando a compactao das molculas
(grau de compactao: 9X)

Maior compactao, maior agregao

Incubao a -20C
Diminui agitao das molculas
Facilita agregao

Centrifugao (30 min, 10.000 rpm, 4C)

DNA pellet

3- Purificao de DNA
Colunas de Troca Inica
(tipo aninica - matriz com carga +)

Slica ou DEAE
DNA se liga a slica
Lavagens sucessivas
removem as impurezas
DNA eludo da coluna

Comparao
Mais rpido
DNA mais puro
Mais caro

3- Purificao de DNA
Eluio
O DNA (pellet ou coluna) deve ser dissolvido/eludo em
uma soluo de baixa fora inica (gua,TE)
Esta soluo pode conter RNase para destruir o
RNA presente

Extrao de RNA
Controle da contaminao com Rnases
Exgena

Manipulao: uso de luvas

Solues: tratamento com dietil-pirocarbonato (DEPC)
Vidraria: queimar por 3 horas a 250C
Plsticos: descartveis e livres de RNase

Endgena
Adio de Inibidores de Rnases
H2O DEPC

Extrao de RNA
Lise Celular: com Trizol: fenol e sais de guainidina:
iniben RNAases.
Tecidos: mecnica
Sangue: agitao

Separao de fases: RNA em fase aquosa, DNA na

interfase, protenas na fase orgnica

Precipitao do RNA: com isopropanol

(lcool)

Quantificaco e pureza dos acidos nuclicos

Leitura da absorbncia a 260nm (A260)
DO260 = 1 50ng/uL DNAds

40ng/uL RNA
Desvantagens: no diferencia DNA de RNA
Interferncia com compostos contaminantes da
extraco

Quantificaco e pureza dos

acidos nuclicos
DNA relao 260/280
A260 /A280 = 1,75 1,8 DNA de boa qualidade
A260 /A280 <1,75: contaminao com protenas ou
lipdios

RNA
A260 /A280 = ~ 2 RNA de boa qualidade
A260 /A280 <2 contaminao com guanidina
A260 /A280 >2 contaminao com fenol clorofrmio

Hora do Recreio

Programa

PURIFICAO DE DNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO

DNA LIGASE

ELETROFORESE

SOUTHERN BLOT

Enzima de Restrio-tesouras moleculares

pela descoberta

das enzimas de
restrio e suas
aplicaes nos
problemas de
gentica
molecular
Nobel de Fisiologia ou
Medicina - 1978
Werner Arber

Daniel Nathans

Hamilton O. Smith

1929

1928 - 1999

1931

1968: Arber descreve a presena das

enzimas de restrio em extratos de E. coli

1970: Smith descreve a primeira enzimas

de restrio que corta o DNA em um stio
especfico

1971: Nathans obtm o primeiro mapa de

restrio
Smith, H. O. and K. W. Wilcox, A restriction enzyme from Haemophilus influenzae: Purification and general properties (1970) J. Mol. Biol. 51: 379-391.

A Guerra Natural
Bactrias vs. Fagos (bacterifagos)

Durante a infeco viral, para se defender, as bactrias

precisam destruir o DNA invasor dos fagos sem
afetar o seu prprio DNA

A Guerra Natural
As bactrias desenvolveram um sistema de defesa
contra DNAs invasores
Duas poderosas Armas
As Enzimas de Restrio
As Enzimas de Modificao

Enzimas de Restrio
Enzimas que se ligam ao DNA e o cortam em stios
especficos (stios de restrio)
Tambm chamadas de endonucleases porque
cortam o DNA internamente

Enzimas de Restrio
Cada espcie de bactria tem a sua enzima de
restrio que reconhece um stio especfico
Mais de 3.000 enzimas de restrio j foram
identificadas

EcoRI enzima da Escherichia coli corta em

Exemplo: EcoRI
Gnero: Escherichia
Espcie: coli
Cepa: R

5--- G-A-A-T-T-C ---3

3--- C-T-T-A-A-G ---5

HindIII enzima da Haemophilus influenzae corta em

5--- A-A-G-A-T-T ---3
3--- T-T-C-G-A-A ---5

BglII enzima da Bacillus globiggi corta em

5--- A-G-A-T-C-T ---3
3--- T-C-T-A-G-A ---5

Enzimas de Modificao
Para garantir que apenas
o DNA viral (invasor) ser
degradado, a bactria
modifica o seu prprio
DNA nos stios que
seriam atacados pela
enzima de restrio
Sistema de Metilao
(A ou C)

Enzimas de Modificao

Enzimas de Modificao
A bactria destri o DNA no-modificado com as enzimas de.
Restrio,
enquanto o seu prprio DNA esta protegido por ao de
enzimas de modificao

Stios de Restrio
Tamanho: 4 a 8 pares de base

8
Recombinant DNA, Watson e col.

Stios de Restrio
Freqncia em que ocorrem:

4n
onde n o nmero de pares de base no stio de restrio

4-base cutter: 44 =
6-base cutter: 46 =

256 bp
4,096 bp

8-base cutter: 48 = 65,536 bp

Stios de Restrio
So repeties invertidas (Palndromes- Maioria)
(comerciais)
socorram me em marrocos
subi no onibus

5----- G - A - A - T - T - C ----3

3----- C - T T - A - A - G ----5

Stios de Restrio
Por que um palndrome ?

As enzimas de restrio
so dmeros formados por
2 subunidades idnticas
O eixo de simetria da
enzima o mesmo da
seqncia do DNA

Stios de Restrio

Stios de Restrio
As enzimas de restrio cortam cada fita do DNA na
mesma posio do palndrome

Stios de Restrio
Os cortes das enzimas de restrio podem produzir
Extremidades abruptas (bunt-ends)
Extremidades coesivas (stick-ends)

Stios de Restrio
As extremidades coesivas podem ser
5- protuberantes (5- overhangs) P 3- protuberantes (3- overhangs) -OH

5- protuberante

3- protuberante

BamHI
BamHI

5.ACTGTACGGATCCGCTA.3
3.TGACATGCCTAGGCGAT.5

BamHI
BamHI

5.ACTGTACGGATCCGCTA.3
3.TGACATGCCTAGGCGAT.5

BamHI

5.ACTGTACG GATCCGCTA.3
3.TGACATGCCTAG GCGAT.5

BamHI

extremidades coesivas
(extremidades 5 protuberantes)

Extremidades Compatveis
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 BamHI
3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
5.TGCTAGCG GATCCAATC.3 BamHI
3.ACGATCGCCTAG GTTAG.5
5.ACTGTACGGATCCAATC.3
3.TGACATGCCTAGGTTAG.5

BamHI

Extremidades Compatveis
5.ACTGTACG GATCCGCTA.3 BamHI
3.TGACATGCCTAG GCGAT.5
5.TGCTAGCA GATCTAATC.3
3.ACGATCGTCTAG ATTAG.5

BglII

5.ACTGTACGGATCTAATC.3
3.TGACATGCCTAGATTAG.5

BamHI
BglII

Extremidades Abruptas

EcoRV
5.ACTGTACGATATCGCTA.3
3.TGACATGCTATAGCGAT.5

Extremidades Abruptas

EcoRV
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3
3.TGACATGCTA TAGCGAT.5

Extremidades Abruptas

EcoRV
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3
3.TGACATGCTA TAGCGAT.5
extremidades abruptas
(Podem se ligar com outras molculas
de DNA com extremidades abruptas)

Extremidades Abruptas
5.ACTGTACGAT ATCGCTA.3
3.TGACATGCTA TAGCGAT.5

EcoRV

5.TGCTAGCCCC GGGAATC.3 SmaI

3.ACGATCGGGG CCCTTAG.5

5.ACTGTACGATGGGAATC.3 EcoRV
3.TGACATGCTACCCTTAG.5 SmaI

Reao com enzima de Restrio

1- DNA
2-Tampo ou Buffer especfico da enzima
3- Enzima de restrio
1ul DNA (1ug)
2ul Tampo2 (10X)
1uL EcoRI (1U/uL)
16ul H2O
20uL

Incubar 2hs

37oC

Concentrao final na reao

Tampo= 1X
Enzima= mximo 10%

Programa

PURIFICAO DE DNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO

DNA LIGASE

ELETROFORESE

SOUTHERN BLOT

DNA Ligase (enzima de modificao)

Quando molculas de DNA com extremidades
coesivas se unem, apenas pontes de hidrognio
so formadas entre os nucleotdeos
complementares

Estas pontes de hidrognio no so estveis o

suficiente para serem permanentes
A DNA Ligase une as extremidades das molculas
de DNA e restabelece a ligao fosfodiester

O Modelo de Watson e Crick

A estrutura molecular do DNA

As fitas so anti-paralelas (alfa hlice)

A
C

T
G

DNA Ligase, cola molecular

DNA Ligase

Pareamento das bases complementares

DNA Ligase

Ligao fosofdiester refeita

DNA Ligase: qual reao mais fcil de acontecer?

extremidades coesivas

extremidades cegas (blunt)

5.ACTGTACGAT
3.TGACATGCTA

GGGGCTA.3
CCCCGAT.5

Exonuclease X Endonucleases
Enzimas de restrio: endonucleases

Que so exonucleases?
- Enzimas que digerem o DNA , fita simples ou dupla, desde a extremidade
Lambda Exonuclease : atividade 5'3' exonuclease de fita dupla: cataliza a
remoo de mononucleotideos 5 mononucleotides da fita dupla de DNA
Exonuclease 1: atividade 3' 5 exonuclease de fita simples
Ex. DNA polimerase I

Mapa de restrio
Representao esquemtica de uma molecula de DNA (circular o linear) indicando os
stios de corte das enzimas de restrio

Mapa de restrio

Como analisar os fragmentos gerados aps digesto de DNA com enzimas de restrio?

Programa

PURIFICAO DE DNA

ENZIMAS DE RESTRIO E MODIFICAO

DNA LIGASE

ELETROFORESE

SOUTHERN BLOT

Eletroforese
uma importante ferramenta da Biologia Molecular
Pode ser usada para:
identificar molculas especficas de DNA obtidas aps
digesto com enzimas de restrio
Comparar genomas
Cincia forense

Eletroforese
Pode ser til para a avaliao da
integridade de uma amostra de DNA
DNA genmico de alta qualidade
>95% alto peso molecular
Banda intacta prxima ao topo do gel
Pouca evidncia de fragmentos
pequenos (smear)

Avaliar se a reao funcionou

Eletroforese
Pode ser til para a avaliao da
integridade de uma amostra de RNA

Eletroforese em gel de agarose

Definio
Um mtodo usado para
separar macromolculas
como cidos nuclicos
(DNA e RNA) e protenas
Mtodo baseado na
migrao destas
molculas atravs de um
suporte sob influncia
de um campo eltrico
a velocidade de migrao
depende do tamanho, da
forma e da carga eltrica
total da molcula

Eletroforese

A corrente eltrica ao passar

atravs do suporte cria um campo
eltrico

O DNA tem carga negativa

(fosfatos) e por isso repelido do
polo negativo (anodo) e atrado
pelo polo positivo (catodo)

A corrente eltrica aplicada

fora os fragmentos de cidos
nuclicos a se mover atravs do
suporte

Biologia Molecular, Turner e col.

Eletroforese
Aparato

Cuba de eletroforese
Fonte
Rack do gel (barquinha)
Pentes
Fonte

Cuba

Rack

Pentes

Eletroforese
Suporte
Gel para separao dos
cidos nuclicos
Agarose ou Acrilamida

Funcionam como
esponjas (polmero),
retardando a passagem
das molculas conforme
seus tamanhos

Agarose
Polissacardeo linear
extrado de algas
Repeties de Agarobiose
D-galactose
3,6-anhydro L-galactose

Substncia gelatinosa, slida

a temperatura ambiente
Precisa ser aquecida para
gelificar
Temp. fuso: 66C
Temp. gelificao: 30C

D-galactose

3,6-anhydro L-galactose

Agarose
Agarose solidificada
porosa, permitindo a
migrao dos cidos
nuclicos
Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (11 m)

Poli-Acrilamida
Poli-Acrilamida
Acrilamida (linear)
Bis-acrilamida (cross-linker)

Possui poros menores

que a agarose
Ideal par separao de
fragmentos pequenos
de DNA e protenas

Eletroforese
Horizontal

Vertical

Gel running

Power Supply

Gel
running

Eletroforese
Tampo de Corrida
Fornece a fora inica para passagem da
corrente eltrica

Composio
Agente Tamponante (Tris-HCl)
Sal (Borato, Acetato, Glicina)
Quelante (EDTA)

Tampo TAE (Tris - Acetato - EDTA)

Tampo TBE (Tris - Borato - EDTA)
Tampo SB (Sdio - Borato)

Velocidade de migrao
A migrao dos cidos nuclicos
depende apenas do seu tamanho
Molculas menores migram mais
rpido que as molculas grandes
Vai depender tambm

(-)

Intensidade do campo eltrico (voltagem)

da fora inica do tampo de corrida
da concentrao do gel

(+)

Fazendo um gel de agarose

O gel de agarose preparado combinando-se

agarose (p) e tampo
O tampo o mesmo que ser utilizado na
eletroforese (tampo de corrida)
Normalmente se usa concentraes de 1 a 3%

Tampo

p.e. gel 1% (1g de agarose + 100mL de tampo)

Agarose

Fazendo um gel de agarose

Agarose insolvel a temperatura
ambiente
Precisa ser aquecida (>70C) para ser
dissolvida (2min. microndas)

Fazendo um gel de agarose

Esfriar o gel (~45C)

Derram-lo no rack (barquinha)
Evitar a formao de bolhas
Colocar os pentes
Os pentes devem ficar
submersos no gel
Os pentes vo formar os
poos onde o DNA ser
aplicado

Fazendo um gel de agarose

Quando fria, a agarose
polimeriza (gelificao)
30-40 minutos
Os pentes devem ser
retirados

Fazendo um gel de agarose

Transferir o gel para a cuba de eletroforese
Cobrir o gel com o Tampo de Corrida

Preparando as amostras antes de aplicar no gel

Tampo de Amostra
Glicerol (aumenta a densidade)
permite que o DNA permanea no poo

Corante
(Azul de bromofenol ou Xileno Cianol)

Permite a visualizao das amostras

Permite avaliar o tempo de corrida

Carregando o gel
As amostras so aplicadas em cada um dos poos do
gel que est na cuba com tampo de corrida

Correndo a eletroforese
Ao aplicar um campo
eltrico, as amostras iro
migrar em direo ao plo
positivo

Correndo a eletroforese

O corante migra junto com as amostras, permitindo a visualizao da

corrida

(-)

DNA (-)

(+)

Corando o DNA no gel

Brometo de Etdio
Corante fluorescente
visualizado quando excitado
por luz UV
Intercalante de DNA
Permite visualizao do DNA

Pode ser adicionado ao gel

(antes da gelificao) ou o gel pode
ser corado aps a corrida
Mutagnico

Alternativas para o Brometo de Etdio

SYBR Gold
SYBR Safe
Gel Ready
Wards - QUIKView DNA
Stain
Carolina BLU Stain

Vantagens
Baratos
Menos txicos

Desvantagens
Menos sensveis
Necessita maior quantidade
de DNA no gel
Maior tempo de
colorao / descolorao

SYBR Gold

QuikVIEW stain

Corando o DNA no gel

Submergir o gel na soluo de colorao
Aguardar alguns minutos (20-30)
Remover o excesso de corante com gua

Visualizando DNA no gel

Transiluminador de Ultra Violeta (UV)

Tamanho dos fragmentos de DNA

(-)

DNA
migration

bromophenol blue

(+)

Tamanho dos fragmentos de DNA

Padro de peso molecular

(-)

(DNA Ladder )

12.000 bp

Fragmentos de DNA com

tamanhos conhecidos

5.000
4.000

Permite a determinao do
tamanho dos fragmentos
de DNA submetidos a
eletroforese

3.000
2.000
1.650

DNA
migration

1.000
850
650
500
400

bromophenol blue

300
200

(+)

100