PERCOBAAN IV

SPEKTROFOTOMETRI VISIBLE
A.
B.

C.

Judul :
Penetapan kadar Vitamin B12 dengan Spektrofotometri Visible
Tujuan :
Mahasiswa mampu menentukan kadar Vtamin B12

dengan

Spektrofotometri Visible
Dasar Teori :
Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar
tampak; yang dimaksud sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh
mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh mata manusia adalah cahaya
dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi sebesar 299
149 kJ/mol.
Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan
energi terendah disebut keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki
sinar tampak mampu membuat elektron tereksitasi dari keadaan dasar
menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau menuju keadaan
tereksitasi.
Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang
ditangkap oleh mata manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang
dilihat dalam kehidupan sehari-hari disebut warna komplementer.
Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila menyerap warna biru dari
spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam bila menyerap
semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak.
Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya
menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram.
Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam tabel periodik unsur
wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau
golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan
sebagai lampu pada spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang
memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni 5930 C.
Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis
adalah panjang gelombang dimana suatu zat memberikan penyerapan

paling tinggi yang disebut maks. Hal ini disebabkan jika pengukuran
dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang diperoleh
makin akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.
Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (AC)
apabila nilai absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 A 0,8) atau sering
disebut sebagai daerah berlaku hukum Lambert-Beer. Jika absorbansi yang
diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi tidak linear lagi. Kurva
kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat
pada gambar dibawah ini :

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear :

1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan
blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan
dianalisis termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau
kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi
sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan
pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat
yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).
Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar
tampak adalah zat dalam bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak
berwarna, sehingga analisis yang didasarkan pada pembentukan larutan
berwarna disebut juga metode kolorimetri. Jika tidak berwarna maka
larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen
tertentu yang spesifik. Dikatakan spesifik karena hanya bereaksi dengan

spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut reagen pembentuk warna
(chromogenik reagent).
D.

URAIAN BAHAN
1. Vitamin B12 (Asam Folat) FI edisi III hal 51.

Nama resmi

Acidum Folicum

Nama lain

Asam Folat, Vitamin B12

Rumus struktur

RM/BM

C19H19N7O6 / 411,40

Pemerian

Serbuk hablur; kuning jingga atau jingga

kekuningan; tidak berbau.

Kelarutan

Sangat sukar larut dalm air; praktis tidak

larut dalam etanol (95%) p, dalam klorofom
p, dalam eter p, dalam aseton p, dalm
bensen p; mudah larut dalam asam klorida
encer p panas dan dalam asam sulfat encer p
panas; larut dalam asam klorida p dan dalam
asam sulfat p, larutan berwarna kuning
sangat pucat; mudah larut dalam alkali
nidroksida dan dalam larutan alkali karbonat
encer.

Penimpanan

Dalam wadah tertutup baik dan terindung

dari cahaya.

Khasiat

Hematopitekum.

2. Aquadest ( FI edisi III hal 96)

Nama resmi

Aqua Destilata

Nama lain

Air suling, aquadest

Rumus struktur

Rm/ Bm

H2O/18.02

E.

Pemerian

Cairan jernih; tidak berwarna; tidak berbau;

tidak mempunyai rasa.

Kelarutan

Penyimpanan

Dalam wadah tertutup baik.

Khasiat

Pelarut

Metode Kerja :
1. Alat & Bahan
a. Alat : Labu takar
Pipet volume
Perkamen
Sendok tanduk
b. Bahan : Sampel (Vitamin B12)
Aquadest
2. Cara kerja
a. Pembuatan larutan baku
E11 cm Vitamin B12 diukur pada

maksimum 361 nm (A1 =

207 a) dibuat absorbansi antara 0,2-0,8

A
=axbxc
0,2
= 207 x 1 x c
C
= 9,66 x 10-4 g/100 mL
= 9,66
10 ppm
A
=axbxc
0,8
= 207 x 1 x c
C
= 38,7 x 10-3 g/100 mL
= 38,7
40 ppm
Konsentrasi larutan baku range 10-40 ppm dibuat 4 titik yaitu 10
ppm, 20 ppm, 30 ppm dan 40 ppm
a. Pembuatan larutan baku induk
Vial Vitamin B12 etiket : 8 mg/8 mL
Dipipet 5 mL dari vial Vitamin B12, dilarutkan dalam labu takar
50 mL dengan aquadest larutan baku induk 100 ppm
b. Pembuatan deret baku
1) 10 ppm
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 100
= 50 x 10
V1
= 5 mL
Dipipet 5 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan
aquadest hingga 50 mL
2) 20 ppm

V1 x N1
V1 x 100
V1
Dipipet 5 mL

= V2 x N2
= 25 x 20
= 5 mL
larutan baku induk, kemudian ditambahkan

aquadest hingga 25 mL
3) 30 ppm
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 100
= 50 x 30
V1
= 15 mL
Dipipet 15 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan
aquadest hingga 30 mL
4) 40 ppm
V1 x N1
= V2 x N2
V1 x 100
= 25 x 40
V1
= 10 mL
Dipipet 10 mL larutan baku induk, kemudian ditambahkan
aquadest hingga 25 mL
b. Penentuan Panjang Gelombang
Panjang gelombang maksimum yang didapat pada konsentrasi
adalah 361.
c. Pembuatan Laruta Uji dan Pengukuran
1) Pipet 5 mL vitamin B12 larutkan dalam aquadest 50 mL (100
ppm)
2) Buat pengenceran 10 ppm:
V1 x N1

= V2 x N2

V1 x 100 = V2 x N2
V1 x 100 = 50 x 10 ppm
V1 = 5 mL dilarutkan dalam 50 mL (pembuatan larutan uji)
F.

Data Pengamatan
1. Absorbansi deret baku pada = 360 nm

Konsentrasi (ppm)
10
20
30
40

Absorbansi
0,162
0,341
0,406
0,639

2. Data konsentrasi vs absorbansi

Konsentrasi (ppm)
15,692
14,997
14,404

Absorbansi
0,264
0,252
0,241

G.

Perhitungan
Diketahui : Nilai a : 0,03
b : 0,01496
c : 9796

Kurva baku konsentrasi (ppm) Vs absorbansi

Persamaan : y = bx + a
X1 = 16,7780
X2 = 15,9759
X3 = 15,2406
1. Perhitungan kadar Vitamin B12 dengan ekstrapolasi persamaan garis
x pengenceran x Fp
%=
x 100 %
pemipetan x 1000
16,7780 x 50 x 10
x 100
5 x 1000

% sampel 1

% sampel 2

= 167,78 %
15,9759 x 50 x 5
x 100
=
5 x 1000

% sampel 3

= 159,79 %
15,2406 x 50 x 3,3
x 100
=
5 x 1000

= 152,40 %
167,78 +159,79 +152,40
Kadar (%) rata-rata=
3
= 159,9 %
2. Grafik

Series 1
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

Series 1

10

H.

20

30

40

Pembahasan
Spektrofotometri merupakan suatu perpanjangan dari penelitian
visual dalam studi yang lebih terinci mengenai penyerapan energi cahaya
oleh spesi kimia, memungkinkan kecermatan yang lebih besar dalam
perincian dan pengukuran kuantitatif. Pengabsorpsian sinar ultraviolet atau
sinar tampak oleh suatu molekul umumnya menghasilkan eksitasi electron
bonding, akibatnya panjang gelombang absorpsi maksimum dapat
dikorelasikan dengan jenis ikatan yang ada didalam molekul yang sedang
diselidiki. Oleh karena itu spektroskopi serapan molekul berharga untuk
mengidentifikasi gugus-gugus fungsional yang ada dalam suatu molekul.
Akan tetapi yang lebih penting adalah penggunaan spektroskopi serapan
ultraviolet dan sinar tampak untuk penentuan kuantitatif senyawa-senyawa
yang mengandung gugus-gugus pengabsorpsi.
Metode spektroskopi sinar tampak berdasarkan penyerapan sinar
tampak oleh suatu larutan berwarna. Oleh karena itu metode ini dikenal
juga sebagai metode kalorimetri. Hanya larutan senyawa yang berwarna
ynag dapat ditentukan dengan metode ini. Senyawa tak berwarna dapat di
buat berwarna dengan mereaksikannya dengan pereaksi yang
menghasilkan senyawa berwarna. Contohnya ion Fe3+ dengan ion
CNS- menghasilkan larutan berwarna merah. Lazimnya kolorimetri
dilakukan dengan membandingkan larutan standar dengan cuplikan yang
dibuat pada keadaan yang sama. Dengan kalorimetri elektronik (canggih)
jumlah cahaya yang diserap (A) berbanding lurus dengan konsentrasi

larutan. Metode ini sering digunakan untuk menentukan kadar besi dalam
air minum. Pada metode spektroskopi ultraviolet, cahaya yang diserap
bukan cahaya tampak tapi cahaya ultraviolet. Dengan cara ini larutan tak
berwarna dapat diukur, contoh aseton dan asetaldehid. Pada spektroskopi
ini energy cahaya terserap digunakan untuk transisi electron. Karena
energy cahaya UV lebih besar dari energy cahaya tampak maka energi UV
dapat menyebabkan transisi electron s dan p. (Kimia Analitik Instrumen,
1994: 4-5)
Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar Vitamin B12 dalam
larutan sampel vial Vitamin B12 dengan metode spektrofotometri visible.
Vitamin B12 dapat di ukur kadarnya dengan menggunakan metode
spektrofotometri visible karena sampel vitamin B12 berupa larutan dan
tampak berwarna. Prinsipnya adalah pengukuran Vitamin B12 pada panjang
gelombang maksimum yang ditentukan yaitu 361 nm, setelah larutan
sampel yang mengandung Vitamin B12 dilakukan pengenceran.
Penentuan Vitamin B12 dibagi menjadi beberapa tahapan. Tahapan
tersebut antara lain pembuatan larutan baku yang terdiri atas pembuatan
larutan baku induk dan pembuatan deret baku, pengenceran larutan sampel
serta pengukuran dengan spektrofotometer visible.
Pengukuran menggunakan spektrofotometer visible,

pengukuran

pertama dilakukan terhadap blanko atau aquadest. Blanko adalah larutan

yang mendapat perlakukan sama dengan analat tetapi tidak mengandung
komponen analat. Blanko dibuat untuk mengetahui besarnya serapan yang
disebabkan oleh zat yang bukan analat, baik hanya pelarut untuk
melarutkan atau mengencerkan ataupun pelarut dan pereaksi tertentu yang
ditambahkan. Selisih nilai serapan analat (Aa) dengan nilai serapan blanko
(Ab) menunjukan serapan yang disebabkan oleh komponen alat.
Praktikum ini tidak perlu dilakukan penentuan panjang gelombang
maksimum karena alat spektrofotometer visible yang digunakan langsung
menunjukan panjang gelombang maksimum untuk Vitamin B12.
Regresi linear (r) yaitu 0,9995 menunjukkan bahwa hasil analisis ini
mempunyai ketelitian yang tinggi dan sangat presisi.

Setelah deret standar diukur, langkah terakhir yaitu melakukan

pengukuran sampel pada panjang gelombang maksimum. Setelah
dilakukan pengukuran, didapat absorbansinya untuk sampel 1 = 0,264,
sampel 2 = 0,252, sampel 3 = 0,241 dan absorbansi tersebut termasuk
didalam absorbansi deret standar yang telah diukur sebelumnya, sehingga
dari perhitungan yang dilakukan, didapat konsentrasi Vitamin B 12 dalam
sampel vial Vitamin B12 adalah sebesar 167,78 % untuk sampel 1, 159,79
% untuk sampel 2, 152, 40 % untuk sampel 3 dan rata-rata yang diperoleh
159,9 %. Kurva yang terbentuk tidak linier karena diduga terjadi kesalahan
I.

saat melakukan praktikum.

Kesimpulan
Sesuai dengan tujuan praktikum, yaitu mampu menentukan kadar
sampel Vitamin B12 (sianokobalamin) dengan Spektrofotometri Visible,
maka dari praktikum yang telah dilaksanakan, dapat disimpulkan bahwa
konsentrasi rata-rata dari Vitamin B12 dalam sampel vial Vitamin B12
adalah 159,9 %

Daftar Pustaka
Anonim. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Jakarta : DEPKES RI
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : DEPKES RI
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis.
Pustaka Pelajar : Yogyakarta
Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar
Kromatografi. Penerbit ITB : Bandung.