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net/jhonnyrojanop/turbidimetria-ambiental
REACCIONES DE PRECIPITACIN.
1.1. TTULO DE ANTICUERPOS.
1.2. REACCIONES DE NEUTRALIZACIN.
1.3. REACCIONES DE PRECIPITACIN.
1.3.1. INMUNODIFUSIN RADIAL SIMPLE (RID) O TCNICA DE MANCINI.
1.3.2. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO I (IDD-I).
1.3.3. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO II (IDD-II) U OUCHTERLONY.

1. REACCIONES DE PRECIPITACIN.
1.1. TTULO DE ANTICUERPOS.
El ttulo de Ac es la mayor dilucin que da una respuesta POSITIVA. El mtodo de evaluacin
puede ser midiendo la absorbancia a travs de la densidad ptica (DO), o sea una DO
mayor a la lnea de corte.

1.2. REACCIONES DE NEUTRALIZACIN.

Prueba utilizada para detectar inmunidad frente a virus.

La neutralizacin (Nt) mide actividad biolgica del virus por lo tanto requiere de virus
vivos para poder realizarse. Igualmente, se realiza en un sistema vivo.

El principio bsico de la prueba de Nt es la inhibicin (neutralizacin) de la infeccin


viral a la clula (cultivo o animal) por medio de los Acs especficos, por lo tanto se
neutraliza la accin del virus sobre el hospedero.

Lectura de la placa

1.3. REACCIONES DE PRECIPITACIN.


Hay precipitacin de Ag y Ac cuando se combinan en proporciones de equivalencia o
cercanas a ella. Estos mtodos se utilizan para examinar la relacin entre diferentes Ag y/o
Ac.

La precipitacin se efecta sobre geles de agarosa.

1.3.1. INMUNODIFUSIN RADIAL SIMPLE (RID) O TCNICA DE MANCINI.

Mtodo de cuantificacin de antgenos.


til en inmunologa clnica para cuantificar fracciones plasmticas humanas como ASH,
Inmunoglobulinas, C3 y C4, factores de coagulacin.
Esquema de la tcnica:
Placa de gel de agar con suero especfico en la matriz. Se incorpora el Ac especfico en el
gel de agarosa.
Se hacen pocillos en el gel de agarosa y en ellos se depositan volmenes estndar de
suero con el Ag que se quiere detectar (Ig o protenas plasmticas).

Fenmeno de difusin. Se deja en reposo 24 horas para que difunda y reaccionen Ag y Ac


(punto de equivalencia), formando un anillo de precipitacin.

Cuantificar. Se mide el dimetro del anillo. Halo proporcional a la conc. de antgeno. Es


una prueba CUANTITATIVA.
Para el calculo de resultados hay que construir una curva patrn a partir de unos
estndares que se ponen en el gel junto con las muestras problemas. Se representa
grficamente el cuadrado del dimetro del anillo frente a la concentracin de Ag.
Se interpola en la curva el valor de cada muestra.

1.3.2. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO I (IDD-I).

Prueba CUALITATIVA.
Se vierte el gel de agarosa sobre portas y se deja gelificar (1-2% de agarosa a pH 7-8.5).
Se hacen dos pocillos y se deposita el Ag en uno de ellos y el Ac en el otro.
Ag y Ac difunden y en el punto de encuentro de los dos, y s las concentraciones son
adecuadas, se produce una banda de precipitacin.
Si en la solucin existen dos Ag reconocidos por el Ac, habr dos bandas.
Se puede usar azul cromassie para teir las bandas.
1.3.3. INMUNODIFUSIN DOBLE TIPO II (IDD-II) U OUCHTERLONY.

Tambin es conocida como Agar gel immunodiffusion test (AGID).

Se puede utilizar para determinar la relacin Ag/Ac (prueba CUALITATIVA). Se enfrenta a un


suero con dos o ms Ag, y nos podemos encontrar con tres patrones bsicos:
a) Identidad (los dos Ag tienen los mismo epitopos reconocidos por el suero): se forma una
banda de precipitacin con forma de arco continuo.

b) No identidad (se trata de Ag distintos): se forman bandas de precipitacin independientes


y no dan un arco continuo. Aparece una figura con forma de aspa.

c) Identidad parcial (los dos Ag comparte un epitopo, pero uno de ellos tiene un epitopo
extra que es reconocido por el suero): se forma un arco de precipitacin al que le sale un
espoln.

Artculos relacionados:

TEST: PREGUNTAS TIPO TEST DE LA SECCIN DE DIAGNSTICO


INMUNOLGICO

REACCIONES DE HEMAGLUTINACIN Y LISIS

CITOMETRA DE FLUJO

REACCIONES DE PRECIPITACIN (II): ELECTROFORESIS

INMUNOFLUORESCENCIA

https://microinmuno.files.wordpress.com/2011/07/inmunodifusic3b3n-radial.pdf
http://es.slideshare.net/HermerLira1/inmunodifusion

Inmunofluorescencia
Autor: SALVADOR RESINO | Visitas: 8.051 views | Categora: DIAGNSTICO
INMUNOLGICO

5. FLUORESCENCIA
5.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA
5.2. ELECCIN DEL FLUOROCROMO

5.3. MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA


5.3.1. FUNDAMENTO.
5.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIN DE ANTICUERPOS POR SUSTANCIAS
FLUORESCENTES
5.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA
5.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.
5.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE.
5.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).
5.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).
5.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA POR COMPLEMENTO.

5. FLUORESCENCIA
Es el resultado de un proceso en tres etapas que ocurre en algunas molculas (fluorforos)

1: Excitacin: se entrega un fotn de energa por una fuente externa a


un fluorforo que absorbe, pasando a un estado electrnico excitado S1
2: Duracin del estado excitado: existe por un perodo de tiempo finito (tpicamente 1-10 x 10-9
segundos), sufre cambios conformacionales y puede interaccionar con su ambiente
molecular. Consecuencias: La energa de S1 es parcialmente disipada produciendo un estado
excitado relajado desde el que se emite la fluorescencia; no todas las molculas inicialmente
excitadas del estado 1 vuelven al estado S0 por fluorescencia, existen otros procesos.
3: Emisin de fluorescencia: un fotn se emite, lo que permite el retorno al fluorforo al nivel S0. A
causa de la disipacin de energa durante el estado excitado, la energa de este fotn
es menor.
La diferencia de energa es llamada Stokes shift (h?EX h?EM) que es fundamental para la
sensibilidad de las tcnicas de fluorescencia, ya que la emisin del fluorforo
permite distinguirse del background.

5.1. ESPECTRO DE FLUORESCENCIA


El mismo fluorforo puede ser repetidamente excitado y detectado. Para molculas
poliatmicas en solucin las transiciones electrnicas son reemplazadas por unespectro de
energa llamado espectro de excitacin de fluorescencia y de emisin. El ancho de banda del
espectro es un parmetro importante para cuando dos fluorforos son detectados
simultneamente.
El espectro de emisin de fluorescencia es independiente de la longitud de onda a la cual se excita.
La intensidad de emisin es proporcional a la amplitud del espectro de excitacin a la longitud
de onda de excitacin.
Para una intensidad satisfactoria de fluorescencia es preciso que se utilicen como
excitadoras radiaciones de longitud de onda correspondientes a los mximos de absorcin del
fluorforo.
Los espectros de absorcin y de fluorescencia de un fluorforo en general estn prximos
(l ms cortas y l ms largas respectivamente). Esto es importante en la eleccin de los
filtros.
La intensidad de la seal depende de los mismos parmetros que la absorbancia, aunque
tambin de la fuente de excitacin (comnmente un lser de ion argn, longitud de 488
nm) y de la eficiencia de recoleccin del detector.

Las muestras biolgicas marcadas con fluorescencia contienen tpicamente ms de una


especie fluorescente, haciendo que el aislamiento de la seal sea compleja. Otras seales
pticas (como S2) quizs correspondan al background o a una segunda sonda fluorescente.
La deteccin de autofluorescencia puede ser minimizada por la seleccin de filtros
adecuados que reduzcan la transmisin de E2 respecto de E1.

Quenching de fluorescencia: En muestras biolgicas el fluorforo est en solucin y puede


interaccionar con otras molculas. Como consecuencia de esta interaccin se puede
producir una perdida de emisin fluorescente. Es un proceso de desexcitatcin no radiativa
provocado por una molcula ajena al fluorforo (compuestos no fluorescentes), que recibe
el nombre de quencher. Al proceso se lo denomina quenching de la fluorescencia

5.2. ELECCIN DEL FLUOROCROMO


La eleccin de un fluorocromo depender de una serie de factores. Si se necesita un nico
color el fluorocromo de eleccin ser el FITC. El FITC es barato, tiene un alto rendimiento
cuntico y es relativamente hidroflico. La rpida prdida de la fluorescencia bajo una
intensa iluminacin ultravioleta puede ser solucionado por el aadido al preparado de
fenilen diamina o n-propil galato, sin embargo estos reactivos son txicos para clulas vivas.
El derivado triaznico de la fluorescena, el dicloro-triazinilamino fluorescena (DTAF) posee
propiedades pticas muy similares al FITC pero es mucho ms estable.
El segundo fluorocromo ms popular es el isotiocianato tetrametil de rodamina (TRITC),
que es mucho ms fluorescente que el isotiocianato de rodamina. La intensa fluorescencia
roja del TRITC es fcilmente distinguible de la verde del FITC. Debido a ello por varios aos
fueros los dos fluorocromos de eleccin para experimentos con fluorescencia combinada. La
prdida de la fluorescencia del TRITC es mucho menor que la FITC.

5.3. MICROSCOPA DE FLUORESCENCIA


La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un filtro excitador
que slo permite que pase la radiacin excitada de la longitud de onda deseada. Esta
radiacin es reflejada por el filtro dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la
muestra, las molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por
fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es enfocada por el
objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico y no se refleja. Un filtro de
barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiacin de excitacin.

Fuente luminosa: coincidente con espectro de absorcin del fluorocromo. Que no llegue al
ocular (UV perjudica la retina) Luz monocromtica o no.
Filtros:Excitador: Transparente a l cortas bloqueando l ms largas. Barrera: Transparente a
l largas bloqueando l cortas. Se coloca entre el objeto y el observador.

5.3.1. FUNDAMENTO.
Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo despus este
conjugado a los anticuerpos o antgenos correspondientes en cortes de tejidos, frotis de
microorganismos o de clulas, o cultivo de tejidos en capa nica. Cuando la reaccin es
positiva y se expone a la luz ultravioleta se producir fluorescencia observable bajo el
microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza un acople a un anticuerpo de un fluorforo o
una enzima que cataliza una reaccin por la cual se emite fluorescencia

5.3.2. PRINCIPIOS GENERALES DE MARCACIN DE ANTICUERPOS POR SUSTANCIAS


FLUORESCENTES
A) Conjugados
Compuestos fluorescentes + Anticuerpos = Conjugados
Un buen conjugado debe tener:
Fluorescencia intensa
Reaccin especfica con los antgenos
Depende de:
Calidad y concentracin de los Acs en el suero
Propiedades de la sustancia fluorescente
Modificaciones que ambos pueden sufrir en el acople

Tambin influyen:
Intensidad de marcacin
Homogeneidad de marcacin
Presencia en el conjugado de otras molculas marcadas
B) Anticuerpos
Para mayor especificidad utilizar antgenos puros para inmunizar
Absorber los antisueros para eliminar Acs indeseables o naturales
Purificar la fraccin de Ig a marcar
Verificar ttulo de anticuerpos
Existe un estrecho paralelismo entre ttulo precipitante y fluorescente
Titulacin de reactivos: Ac 1 y Conjugado deben titularse.
C) Fluorocromos
-El fluorocromo no unido se dializa o se separa por filtracin en geles. Disponibilidad filtros
D) Intensidad de marcacin
Fluorocromo puede ser conjugado en un nmero variable a cada molcula de protena,
resultando diferentes grados de marcacin.
Mayor intensidad de marcacin, mayor intensidad
Marcacin excesiva:
Disminucin del PI de las protenas
Alteraciones en las propiedades inmunolgicas de los anticuerpos (6 7 molculas de
fluorescena/ molcula de Ac es el lmite mximo)
Quenching de fluorescencia (disminucin del rendimiento de emisin)
E) Homogeneidad de marcacin
Altamente marcadas: Fluorescencia inespecfica
Medianamente marcadas: Resultados ms satisfactorios
Insuficientemente marcadas: Fluorescencia poco intensa

5.3.3. TIPO DE INMUNOFULERESCENCIA

5.3.4. INFLUENCIA DEL TIPO DE ANTICUERPO.


Ac Policlonal

Ac Monoclonal

Pool de Ac
monoclonales

Fuerza de
seal

Excelente

Regular a Buena

Excelente

Especificidad

Buena, pero a
veces el
background
es alto

Excelente pero
con posible
reaccin cruzada

Excelente

Seal fuerte

Especfico

Seal fuerte

No renovable

Baja seal

Especfico

Ventajas

Desventajas

Background

Disponibilidad

Se necesita
titular

5.4. REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA EN FASE SOLUBLE.

Es una tcnica CUALITATIVA que se usa para detectar la presencia de Ac especficos


en el suero.

En esta tcnica la visualizacin del IC no es directa, sino que se lleva a cabo por
intervencin de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac o anti-Ac, que recibe el
nombre genrico de conjugado fluorescente. Los Ag utilizados son formes o
partculas (cortes de tejidos, bacterias, parsitos o cortes de parsitos, etc).

5.4.1. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD).

Se aade la solucin de Ac fluorescente sobre el Ag, previamente fijado en un porta o placa,


se incuba, se lava y se leen los resultados.

5.4.2. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI).


El suero problema (con el Ac buscado) se aplica sobre el Ag fijado, se lava y luego se aade
el anti-Ac fluoresceinado contra la regin Fc del primero, se lavan y se leen los resultados.

Se usa de rutina para detectar auto-Ac en sangre de pacientes con enfermedades


autoinmunes.

5.4.3. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA AMPLIFICADA POR COMPLEMENTO.


Se usa para detectar Ac fijadores del complemento. En el segundo paso, despus de aadir
el Ac, se aade complemento fresco, que se fija alrededor de donde se han fijado los Ac.
Debido a los pasos de amplificacin de la va clsica del complemento, una molcula de Ac
puede fijar muchas molculas de C3b al Ag, que se revelan con Ac anti C3b fluoresceinado.
Es una tcnica mucho ms sensible.

En los tres casos, los IC formados se ponen de manifiesto por observacin del porta en un
microscopio provisto de luz ultravioleta (los Ac se ven con fluorescencia verde). El patrn de
fluorescencia es caracterstico de cada Ag.

http://es.slideshare.net/JeluyJimenez/inmunodifusin
http://es.slideshare.net/cbejarl/estudio-de-proteinas-sericas
urbidimetra y nefelometra
Cuando un rayo de luz golpea una partcula en suspensin, una parte de la luz es reflejada, otra absorbida,
otra desviada y el resto es transmitida. La turbidimetra mide la reduccin de la intensidad de la luz en su
paso a travs de una suspensin, a causa de las partculas presentes en esta, y cuantifica la luz residual
transmitida. La nefelometra mide la luz desviada en diversos ngulos (entre 15? y 90?) por las partculas
presentes en esta suspensin.
La sensibilidad de la turbidimetra est limitada, en lo fundamental, por la exactitud y sensibilidad del
instrumento utilizado para la medicin, y depende de la capacidad del detector para registrar peque?os
cambios en la intensidad de la luz. Las lecturas realizadas en longitudes de onda bajas, en un
espectrofotmetro de buena calidad, permiten obtener buenos resultados.
Para la nefelometra es necesario emplear un equipo con caractersticas especficas, que recibe el nombre
de nefelmetro. Sus componentes bsicos son:
1.

Fuente de luz: los modelos ms antiguos empleaban la lmpara de W. En la actualidad se usan


lmparas de arco de Hg, diodos emisores o lser de helio-nen, de baja potencia.

2.

Sistema colimador (innecesario con la lmpara de lser), cuya funcin es la de concentrar el rayo
de luz en haces paralelos.

3.

Selector de longitud de onda.

4.

Cubeta de medicin.

5.

Detector (fotomultiplicador).

6.

Galvanmetro.

Los primeros equipos de este tipo efectuaban la medicin de la luz en un ngulo de 90?, pero hoy se
prefiere trabajar con la deteccin en ngulo ms peque?o, lo cual confiere una mayor sensibilidad.

http://es.scribd.com/doc/54885577/Turbidimetria-y-Nefelometria
http://bibing.us.es/proyectos/abreproy/4821/fichero/MEMORIA%252FCAPITULO+4.pdf

Los mtodos Turbidimtricos y sus aplicaciones en


las ciencias de la vida
Ao:
2013 (Volumen 44)

Nmero:
1
Autores/Authors:
Dayana Acebo Gonzlez, Armando T. Hernndez Garca
Palabras Claves / Key words:
mtodos

turbidimtricos,

sistemas

pticos,

bioprocesos,

cultivo

celular,

microbiologa

predictiva,

turbidimetric methods, optical systems, bioprocessing, cell culture, predictive microbiology


Resumen:
El desarrollo de la industria biotecnolgica ha propiciado la necesidad de contar con herramientas analticas
cada vez ms rpidas y potentes, que permitan estimar de manera ms eficaz el crecimiento celular en el
transcurso de los bioprocesos. En tal sentido, las tcnicas turbidimtricas constituyen herramientas muy
tiles que satisfacen tales expectativas y que se aplican en las ciencias de la vida. Los sistemas para la
medicin de turbidez operan sobre la base de los fenmenos pticos que se producen al incidir un haz de
luz a travs de un medio. La luz se dispersa debido a la existencia de partculas suspendidas en el interior
del medio en anlisis, que tambin intervienen en la reduccin de la intensidad del haz de luz resultante.
La manera en que la muestra suspendida en el medio interfiere con la luz est relacionada con el tamao,
la forma, la composicin de las partculas en la suspensin y la longitud de onda de la luz incidente. En el
presente trabajo se muestra el estado del arte en relacin con el desarrollo y el uso de las tcnicas
turbidimtricas en el cultivo de clulas. Las tcnicas turbidimtricas se diferencian por la geometra del
detector de luz utilizado. El avance de los sistemas pticos ha conducido a su empleo eficaz para la
obtencin de informacin en distintos campos de medicin incluidos los procesos biotecnolgicos. De esta
manera, los mtodos turbidimtricos constituyen una alternativa en la obtencin de informacin y el
control de los sistemas biotecnolgicos
Abstract:
The development of the biotechnological industry has favored the need of having analytical tools,
increasingly fast and powerful, which allows a more effective estimation of cell growth during bioprocesses.
In this regard, turbidimetric techniques are very useful tools that fill such expectations and can be applied
to life sciences. Systems for measuring turbidity are based on optical phenomena resulting from passing a
beam of light through the culture medium. Light becomes scattered, due to the presence of foreign
particles suspended in the medium under analysis thereby reducing the intensity of the emerging light. The
manner in which a sample, suspended in medium, interferes light is then related to size, shape and
composition of particles in suspension as well as the wavelength of the incident light. This paper describes
the state of art of the development and use of turbidimetric techniques in cell culturing. Turbidimetric

techniques differ one each other in geometry of the light detector used. The development of optical
systems has led to an effective use in order to have information on various measurement fields including
biotechnological processes. Therefore, turbidimetric methods constitute an alternative way for obtaining
information and controlling biotechnological systems

Texto Completo:
INTRODUCCIN
Las tcnicas pticas de medicin se utilizan desde hace aos para obtener cierta informacin de un objeto,
teniendo en cuenta

la existencia de fenmenos pticos y las propiedades que presenta la luz. Los

fenmenos pticos implican la interaccin de la luz con un medio. Al atravesar una muestra el haz
luminoso, ocurre la absorcin, la fluorescencia o la dispersin que junto a las propiedades ondulatorias
(amplitud, fase, polarizacin, longitud de onda) ofrecen un mundo rico en informacin. 1
La medicin de la turbidez, inicialmente comenz a utilizarse para proporcionar una evaluacin bsica de la
calidad del agua. Los primeros turbidmetros se desarrollaron en la dcada del 60 del siglo XX y la
tecnologa ptica fundamental se mantuvo sin cambios hasta mediados de los aos 80. Desde entonces, el
desarrollo tecnolgico de estos instrumentos ha avanzado de manera agigantada. Nuevos diseos de
turbidmetros han evolucionado en cuanto a la tecnologa utilizada (fuentes de luz y el diseo del detector)
y se han utilizado para compensar o eliminar las interferencias asociadas

al anlisis de la turbidez

(ejemplo: color de la muestra, burbujas en la muestra que desvan la luz y longitud de onda), que a
menudo hacen difcil la comparacin de las mediciones realizadas. 2
Las tcnicas pticas tradicionales de medicin han experimentado un renacimiento debido al fuerte
desarrollo de las fuentes y los detectores de luz, as como de nuevos elementos de tipo ptico. Los
avances en la nanotecnologa han abierto nuevos campos como la nanomedicina y la tomografa ptica,
impulsando una creciente demanda para el desarrollo de la medicin ptica y de la tecnologa de imagen
en las ciencias de la vida. En general, son tcnicas rpidas, sin contacto y no destructivas para el medio
ambiente.3 Los recientes acontecimientos en las tcnicas pticas, como: las sondas de densidad ptica, los
biosensores pticos, los sensores de fibra ptica, infrarrojos y de fluorescencia, demuestran la creciente
importancia que presentan los sistemas de sensores pticos en el registro de los procesos biotecnolgicos.
Estos ofrecen la posibilidad de un seguimiento continuo del proceso sin perturbacin alguna y cercano al
valor real.4 El objetivo de esta revisin consisti en mostrar el estado del arte en cuanto a las tcnicas de
medicin de turbidez aplicadas a las ciencias de la vida, especialmente, a los bioprocesos.

MEDICIN DE TURBIDEZ

Definicin de turbidez
La turbidez se define por la Organizacin Internacional de Normalizacin (ISO), como la reduccin de la
transparencia de un lquido causada por la presencia de partculas no disueltas de material distinto al
propio lquido.5 Al ser un indicador de apariencia ptica, ocasionado por la dispersin y absorcin de la
energa lumnica a travs del lquido, la turbidez solo puede ser medida usando tcnicas pticas. 6 Se
fundamenta en la relacin de la intensidad de la luz incidente y de la luz dispersada por el medio, mediante
la ley de Lambert-Beer (Ecuacin 1), en la que la turbidez es proporcional a la concentracin de
partculas.7-9 Un haz de radiacin monocromtica paralelo con intensidad I 0 llega al medio absorbente
perpendicular a la superficie; luego pasa a travs de la longitud X del medio, que contiene partculas
absorbentes que bloquearn la transmisin de la luz (tomos, iones o molculas), la intensidad del haz
disminuye a I como resultado de la absorcin y la dispersin. Si el material se compone de partculas con
diferentes coeficientes de absorcin y de dispersin, el coeficiente total de absorcin y de dispersin, (A y
B), es igual a la suma de los coeficientes de absorcin y de dispersin de todas las partculas. 10

dnde:
I intensidad de la luz resultante.
I0 intensidad de la luz en el punto 0.
0 punto de partida del paso de luz a travs del medio absorbente.
X longitud del medio o distancia del viaje de la luz a travs del medio.
C concentracin del medio.
A coeficiente de absorcin.
B coeficiente de dispersin.

La proporcionalidad entre la intensidad de la luz incidente y la luz dispersada por el medio depende del
tamao y de la forma de las clulas que se encuentren en el medio que se est analizando, que tambin

puede ser afectada por las condiciones ambientales. La correlacin entre la concentracin de partculas y la
turbidez, tambin llamada calibracin, depende, en el caso del anlisis de cultivos bacterianos, de las
especies bacterianas que se estn analizando, y en ocasiones, incluso de la cepa especfica utilizada. 11 La
medicin de turbidez se usa para estimar los indicadores de crecimiento de bacterias como una alternativa
a los recuentos de las placas tradicionales. Su utilizacin se ha incrementado como nueva tendencia en la
microbiologa predictiva y ha comenzado a centrarse en la cuantificacin de la variabilidad de las
respuestas bacterianas en los entornos de los alimentos y otros productos industriales. 11-12
La unidad de medicin estndar para la turbidez es la Unidad Nefelomtrica de Turbidez (UNT). Aunque
tambin se utilizan

otras

unidades

de medida para la turbidez establecidas

por regulaciones y

estndares, como, Total de Slidos Suspendidos (SST) y Concentracin de sedimento en suspensin


(SSC).12

Principio de medicin de turbidez


Cuando el haz de luz atraviesa el fluido de la muestra (Fig. 1), los slidos suspendidos dispersan la luz en
todas direcciones. La reduccin de la intensidad del haz de luz se debe a la difusin del haz por dichos
slidos suspendidos en el medio. Sin embargo, la absorcin de la radiacin incidente por sustancias
coloreadas disueltas, tambin reduce la intensidad de la luz y debe tenerse en cuenta para contrarrestar
este efecto, de forma manual o automtica.13 En el anlisis de bajas cantidades de slidos suspendidos, se
suele usar la medida de la luz dispersa, debido a que los fotodetectores detectan pequeos cambios de la
intensidad de la luz en contraste con un fondo oscuro. Sin embargo, este mtodo tiene como desventaja
que con grandes cantidades de slidos disueltos en la muestra, se produce una dispersin mltiple que
limita la cantidad de luz que recibe el detector.13 A elevadas concentraciones de slidos suspendidos, se
deben emplear mtodos de medicin alternativos, tales como los de absorcin. 13-14

Fig. 1. Efectos de luz al atravesar la muestra. 6 L1 Haz de luz incidente sobre la muestra. L2 Haz de luz
que ha pasado a travs de la muestra. M Muestra en anlisis. St Luz difundida por las partculas
suspendidas en la muestra. G y G1 Rayos perifricos del haz de luz difundido.
Tcnicas turbidimtricas de medicin
La turbidez se mide utilizando las tcnicas de turbidimetra o nefelometra. La relacin directa entre los
datos de turbidez y la concentracin de slidos suspendidos depende de muchos factores, entre los cuales
se incluye el tamao de las partculas, la forma, la distribucin y el estado de la superficie, ndice de
refraccin de las partculas de dispersin y de la longitud de onda de la luz utilizada. 5
Hay tres diseos bsicos de medidores de turbidez (Fig. 2):

El nefelmetro cuantifica la intensidad de la luz dispersada por la muestra bajo anlisis. El

sensor se encuentra montado en un ngulo normalmente de 90 del rayo de luz incidente. Este diseo
tiene una precisin limitada a elevadas turbiedades. A medida que aumenta la turbidez aumenta la
cantidad de luz dispersa, ocurriendo una dispersin mltiple que disminuye la intensidad de luz difusa que
llega al detector situado a los 90.5,14-17

El turbidmetro mide la absorbancia de la muestra en estudio. Es uno de los instrumentos ms

utilizados y la tcnica empleada consiste en el uso de un cultivo de microorganismos en un medio lquido,


que acta como una suspensin coloidal, la cual bloquea y refleja la luz que pasa a travs de l. La luz es
absorbida de manera directamente proporcional a la concentracin de clulas que hay en el cultivo. 5,14-17

El turbidmetro que revela la tasa o relacin de intensidades luminosas, mide tanto la

transmisin de la intensidad de la luz como su dispersin. Este diseo es

muy apropiado para los

productos lquidos que presenten colores intensos y para muestras de gran turbidez. 5 Esta configuracin
es la clave para obtener buenas caractersticas de rendimiento en las mediciones de turbidez, as como
una buena estabilidad, linealidad, sensibilidad, baja luz difusa y rechazo del color.14
Adems de estas tcnicas de medicin, la de retrodispersin se refiere a la medicin de la luz dispersada
en un ngulo entre 90 y 180. 10,18 La espectrometra de retrodispersin Rutherford (RBS) es una poderosa
tcnica analtica, basada en la medida de un haz de iones retrodispersados de elevada energa que incide
sobre una muestra.En este mtodo, la luz dispersada se detecta en direcciones determinadas, siempre
correspondientes a ngulos de dispersin mayores de 90. Esta tcnica brinda informacin sobre las masas
atmicas en el medio y determina la distribucin de los elementos en el medio en funcin de su
profundidad.19,20

Fig. 2. Tcnicas para la medicin de turbidez.


Fuente de luz
Generalmente se consideran emisores optoelectrnicos
convertir energa elctrica en luz.
termoluminiscentes
(halgenos).

(bombillas),

aquellos

dispositivos

que son capaces

de

Existen varios tipos de emisores o fuentes de luz, como los

electroluminiscentes

(LED

lseres)

los

basados

en

plasma

21

Un ejemplo de fuente de luz utilizada comnmente en las mediciones de turbidez es la lmpara de


filamento de tungsteno incandescente, la cual contiene una banda espectral con diferentes longitudes de
onda. Esta caracterstica pudiera ser una desventaja para su uso, ya que la produccin de numerosas
longitudes de onda puede llevar a obtener una menor intensidad de la luz dispersada. 14
Otros dispositivos tambin muy utilizados como fuente de luz en las mediciones de turbidez, son los LEDs
(light-emitting diodes). Holonyak desarroll el primer LED en 1962 sobre la base de capas de GaAsP y
logr emitir con luz roja. 22 Desde entonces, los LEDs, han desempeado un papel prominente como
sensores pticos.23 Estos dispositivos semiconductores capaces de emitir una radiacin electromagntica
cuando son polarizados en forma directa. La longitud de onda emitida depende del material semiconductor
usado y de su dopaje (proceso donde se agregan impurezas a un material semiconductor en su forma
pura, las cuales no son ms que tomos de otro elemento que modifican las propiedades de conduccin del
material). Se pueden adquirir LEDs de diversas longitudes de onda, por ejemplo, verde (565 nm), amarillo
(590 nm), naranja (632 nm), rojo (649 nm), azul (470 nm) y en el infrarrojo cercano. 24
Los LEDs ofrecen un mayor nmero de ventajas en comparacin con otras fuentes de luz utilizadas en
aplicaciones optoelectrnicas. Estos, incluyen mayor tiempo de vida, bajo costo, menor consumo de
energa, mayor brillo, construccin robusta, configuracin flexible, una mayor pureza espectral, pequeo

tamao y un amplio intervalo espectral (247-1550 nm, intervalo espectral de los LEDs disponibles
comercialmente).23
El diodo lser, como otro ejemplo de fuente de emisin, se obtuvo como resultado del desarrollo del diodo
LED. La palabra lser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) en espaol se traduce como
Amplificacin de la luz por emisin estimulada de radiacin. El diodo lser es un dispositivo que utiliza un
principio de la mecnica cuntica: la emisin inducida o estimulada para generar un haz de luz coherente
de un medio adecuado y con el tamao, la forma y la pureza controlados. Refirindose al proceso cuntico,
la luz caracterstica emitida por electrones cuando pasan de un estado de gran energa a un estado de
menor energa, estimula a otros electrones a efectuar una trayectoria similar (pasar de un estado de
mayor energa a otro de menor energa). El resultado es una luz sincronizada que sale del material. Una
caracterstica importante es que la luz emitida no solo tiene la misma frecuencia (monocromtica), sino
que es monofsica (est en fase), tambin est sincronizada y se obtiene como resultado un rayo de luz
muy preciso.24

Detectores
En los turbidmetros el haz de luz resultante de la interaccin entre la luz incidente y la muestra ser
detectado por el fotodetector y como resultado, la seal electrnica producida se procesa y se convierte
entonces en un valor de turbidez. La ubicacin del detector en el turbidmetro vara de acuerdo con la
configuracin del diseo en el instrumento. Existen cuatro detectores que se utilizan frecuentemente en
los turbidmetros, estos son, los tubos fotomultiplicadores, los fotodiodos de vaco, y de silicio, as como los
fotoconductores de sulfuro o de cadmio.25
Estos detectores se diferencian por su respuesta espectral, de acuerdo con la longitud de onda del haz de
luz incidente (Fig. 3). Los fotomultiplicadores utilizados en la instrumentacin nefelomtrica tienen picos de
sensibilidad espectral en el ultravioleta cercano y en el espectro del azul visible. Requieren un suministro
de alta tensin bien ajustado para mantener una buena estabilidad en la medicin. El fotodiodo de vaco
generalmente exhibe una respuesta espectral similar a la de un fotomultiplicador,

pero un poco ms

estable. Sin embargo, sus caractersticas se ven afectadas por las condiciones del medio ambiente, en
particular, la humedad.16 Los fotodiodos de silicio generalmente tienen un mximo de sensibilidad espectral
en la regin visible del rojo o del infrarrojo cercano. El fotoconductor de sulfuro o de cadmio tiene este
mximo entre la respuesta espectral del fotomultiplicador y del fotodiodo de silicio. 10,26

Fig. 3. Caractersticas tpicas de la respuesta espectral de cuatro tipos de fotodetectores. 23


Los recientes avances en la ingeniera de materiales y en la microelectrnica han permitido desarrollar
fotodetectores con el objetivo de mejorar sus prestaciones y extender su campo de utilizacin a la
identificacin de los microorganismos. En consecuencia, se ha desarrollado una gran variedad de
fotodetectores de alta tecnologa como los fotodiodos de silicio. 27-28
El uso de los fotodetectores de silicio elimina muchos de los problemas relacionados con el ruido en la
medicin, al detectar la seal dispersada o transmitida. Debido a su estabilidad elevada, gran intensidad y
la posibilidad de detectar diferentes longitudes de onda en el espectro visible y ultravioleta. 29 Estos sistemas
pueden medir la absorbancia o la fluorescencia, o ambas inclusive lo que posibilita su empleo para
determinar la concentracin de bacterias, vitaminas (riboflavina), frmacos, protenas y aminocidos en
muestras biolgicas.30

Estandarizacin en el diseo de los turbidmetros


Diversas organizaciones han desarrollado normas con el intento de estandarizar los diseos de los
instrumentos y lograr que los resultados sean exactos y repetibles. Estas normas regulan las diferentes
configuraciones en el diseo de los turbidmetros que se encuentran disponibles actualmente en el
mercado.15
Hoy da, estn reconocidos los mtodos USEPA 180.1 y la Norma ISO 7027. 31 Mientras USEPA 180.1
recomienda el uso de la emisin de la radiacin en el intervalo visible, con longitudes de onda entre 400 y
600 nm, la Norma ISO 7027 propone la luz infrarroja a 860 nm como fuente emisora. 25-26, 31
Se debe destacar que ambas metodologas fueron diseadas para las muestras de agua con baja turbidez y
la interferencia de un mnimo de color. Sin embargo, existe una enorme variedad de muestras en las que
estos dos mtodos pueden fallar al medir la turbidez con un elevado grado de sensibilidad. Estas muestras

contienen, generalmente, ya sea una matriz fuertemente coloreada, partculas coloreadas, o ambas.
Adems, la muestra puede emitir fluorescencia o partculas con tamaos especficos. Estas caractersticas
se traducen en una mayor interferencia, que disminuye el rendimiento de estos dos mtodos. En los
ejemplos de tales muestras se incluyen: productos lquidos alimenticios, control de la contaminacin
durante la produccin de diversos fluidos, resinas, la degradacin de aceites y recuentos bacterianos en
agar, siendo solo una pequea parte de la gran variedad de posibilidades. 25

Diseo general de un sistema para la medicin de turbidez


Las

tcnicas

clsicas

empleadas

en

microbiologa

para

medir

el

crecimiento

celular

son:

las

determinaciones de densidad ptica (turbidez), conteo en placa y peso seco. El conteo en placa es la ms
antigua (aproximadamente 100 aos) y es considerada una de los procedimientos ms utilizados en la
aquella. Aunque esta ltima posibilita conocer de manera directa la viabilidad de los microorganismos
presentes en una muestra, sin embargo, consume tiempo. En tal sentido, el mtodo turbidimtrico tiene la
ventaja de estimar de manera rpida el crecimiento de una poblacin microbiana. 17
Generalmente, un sistema para la medicin de turbidez consta de la fuente de luz, la muestra en anlisis y
del fotodetector (fotodiodo, fotorresistencia, etc.) (Fig. 4). En estos sistemas, la fuente de emisin de luz
(ejemplo los LEDs), tiene la capacidad de emitir a una longitud de onda determinada, existe un recipiente
cristalino o frasco donde se coloca la muestra en estudio y el fotodetector se comporta como receptor de
los

fotones

sensor

ptico. 17 Dicho

fotodetector

se

encuentra

antes

de

un

bloque

de

acondicionamiento, que permite amplificar y filtrar las seales emitidas por l en forma de impulsos
elctricos. Estas seales pueden ser introducidas en una Unidad Central de Procesamiento y Control
(UCPC) encargada de la conversin analgico-digital de la seal de entrada y de cumplir con las tareas del
procesamiento digital, como la cuantificacin y el procesamiento matemtico con el objetivo de
proporcionar el resultado requerido, adems de mostrar el valor de la turbidez medida despus del
procesamiento digital.31-32 Asimismo, la UCPC es capaz de generar y controlar una seal con determinadas
caractersticas para estimular la fuente de emisin de luz.5,33

Fig. 4. Esquema general de un sistema para la medicin de turbidez.


Para el diseo de un sistema de medicin de turbidez es importante conocer el espectro de absorcin de la
muestra que se quiere determinar, esto es, a qu longitud de onda de la radiacin incidente causar la
mxima absorcin la especie en estudio para obtener la mejor sensibilidad en su cuantificacin. 34 En
general, sobre la sensibilidad del diseo en el mtodo a utilizar, pueden influir: la longitud de onda, la
intensidad y la frecuencia de la corriente elctrica de estimulacin, as como el ngulo de incidencia de los
fotones para el sensor (foto detector) utilizado. 23

Aplicaciones de la turbidimetra en los bioprocesos


Los bioprocesos modernos son extremadamente complejos y difieren entre s, (entre ellos se tiene la
produccin de antibiticos, el cultivo de clulas de mamferos, entre otros), por lo que se han desarrollado
diversos sistemas de anlisis y configurado a partir del diseo de

diferentes mdulos bsicos, que

satisfacen las demandas especficas de cada proceso en particular.35-36


Dentro de los procesos biotecnolgicos se encuentran los de fermentacin, en donde la introduccin de
nuevos sensores pticos ha permitido el avance en su comprensin. 37 Los sensores

pticos

son

herramientas eficaces para obtener cierta informacin del sistema biolgico bajo estudio, ofreciendo un
control no destructivo de los procesos biotecnolgicos. 34
Durante el registro y control de los procesos fermentativos, se necesita una estimacin rpida del
crecimiento bacteriano, para lo cual se han desarrollado mtodos turbidimtricos que permiten medir la
absorbancia de las bacterias en el cultivo.38 Para determinar el crecimiento microbiano, se toma una
muestra del caldo de fermentacin (off-line) y se mide la absorbancia de la muestra con un
espectrofotmetro o un colormetro, a una longitud de onda constante. La medicin de la densidad ptica

con un espectrofotmetro es un modo rpido y fcil para obtener la curva de crecimiento de dicho
microorganismo.39 Las mediciones de la densidad ptica proporcionan informacin til para el control del
cultivo alimentado en el fermentador, por lo que resulta ideal realizar estas mediciones directamente (online) en el proceso y as, obtener valores en tiempo real. 40 Por lo tanto, para el control en tiempo real de los
procesos de fermentacin de microorganismos, se requiere del uso de sensores que posean un amplio
intervalo dinmico de medicin.41
Varias son las investigaciones publicadas, relativas a procesos fermentativos, en las que se mide la
densidad ptica on-line. Por ejemplo, en el trabajo publicado por Kennedy,37 se realizaron mediciones
dentro del propio fermentador, para lo cual se utiliz como fuente de emisin una sonda de fibra ptica
junto a la fuente de deteccin, ambas sumergidas en el cultivo, las que posibilitaron la medicin de la
dispersin de la luz por la muestra. En este sistema experimental, se obtiene el espectro de dispersin de
la luz en la fermentacin de tres microorganismos individuales (aproximadamente a las mismas
concentraciones): Saccharomyces

cerevisiae, B. subtilis y Escherichia coli. La relacin til entre la

dispersin de la luz y la concentracin de clulas se observa en la curva de calibracin de cada uno de los
microorganismos.37
Otro ejemplo de la aplicacin de la turbidimetra en los procesos de cultivo en biorreactores lo constituye la
investigacin realizada por P. Wu, 42

en la que se realiz la

medicin de la densidad ptica on-

line mediante sondas pticas, durante el proceso de cultivo de hibridoma murino.42


La desventaja de usar la densidad ptica para la estimacin rpida del crecimiento celular, radica en que
tanto las clulas viables como las no viables absorben a una longitud de onda especfica y como resultado,
el valor de la densidad ptica no puede tomarse como una medida directa de la viabilidad celular.43-44

Sistemas pticos para la medicin de la turbidez


El anlisis de la turbidez se torna cada vez ms popular, sobre todo, porque la prctica alternativa de toma
de muestras y anlisis de la sedimentacin o filtracin y pesaje de los procedimientos, son procesos lentos
y propensos a errores. El precio relativamente elevado de medidores de turbidez comercialmente
disponibles ha estimulado intensas investigaciones relacionadas con el diseo de nuevos sistemas para la
medicin de la turbidez.4
Algunas variantes modernas posibilitan, realizar mediciones de absorcin y fluorescencia a partir del uso de
diferentes longitudes de onda, lo que permite disminuir los tiempos empleados en la deteccin y estudio de
microorganismos. En un artculo reciente, se describe un mtodo que posibilita mejorar la capacidad de

un sistema optoelectrnico de deteccin de microorganismos combinando la centrifugacin de la muestra,


el empleo de fuentes fluorescentes de luz y el uso de cinco longitudes de onda de excitacin (comprendidas
entre el rojo y el ultravioleta).45
Tambin, se ha probado

el uso de un sensor ptico (luminiscencia), combinado con el empleo de

diferentes ngulos de captacin de las seales y de diferentes longitudes de onda (entre el ultravioleta y el
infrarrojo), para el que se ha descrito un incremento significativo en la sensibilidad del sistema para la
deteccin de patgenos procedentes de diferentes medios. 46
Por otro lado, existen autores que abordan la mejora del fotodiodo y de la tarjeta asociada (circuito
integrado) en la medicin de la absorbancia (dependiendo de la frecuencia). 47 El detector de absorbancia
utilizado, se bas en la utilizacin de un amplificador en configuracin lock-in para realizar el
procesamiento digital de la seal (DSP LIA). Este detector mostr menor nivel de ruido al ser comparado
con un detector que incluy un amplificador operacional simple (TL082CP). 47
Adems, Song et al.48 reportaron el empleo de un arreglo de fotodiodos, en forma de microchip porttil,
para la identificacin y cuantificacin de E.coli O157:H7. En otra investigacin,49 se realiz el diseo y
construccin de un instrumento electrnico para

registrar slidos suspendidos en diferentes sistemas

acuosos, basado en los principios de la turbidimetra y nefelometra. En dicho trabajo, se evaluaron dos
sensores pticos monolticos de gran sensibilidad, del orden de 0,45 A/W a 650 nm, colocado en la
direccin del haz transmitido y del haz dispersado. Se utiliz un amplificador de transimpedancia que
proporcion una tensin lineal y proporcional a la cantidad de luz recibida por el detector, en el que las
fotocorrientes de ambos detectores resultaban alimentadas por un circuito logartmico de precisin. La
salida del circuito logartmico es digitalizada para tener mediciones de turbidez en anlisis de aguas o de
transparencia en el caso de recubrimientos y de dispersin de luz en sistemas acuosos que tienen algn
grado de materia slida suspendida. 49
El mtodo

turbidimtrico o espectrofotomtriaco de absorcin, se ha utilizado tambin en distintas

investigaciones para determinar la concentracin de glucosa. 30 Basado en que su reaccin con la


hidroxilamina se obtiene la oxima correspondiente la cual es el compuesto a determinar cuyo espectro de
absorcin UV se ubica en el intervalo de 200 a 260 nm. La fuente de radiacin, en esta investigacin, se
seleccion considerando estos valores. En el diseo se utilizaron dos fotodetectores de silicio. El sistema
de registro de la seal de salida de cada detector hace uso del amplificador
amplificador operacional LM308N y el microcontrolador

logartmico LOG102, el

PIC16F873A; componentes que son de gran

precisin, que permiten la obtencin de resultados, muestreando elementos tcnicos y valores nominales a
tener en cuenta para el diseo del instrumento de medicin. 30
En

varios

trabajos

destinados

al

diseo

optoelectrnico

de

los

turbidmetros,

se

incorpora

el

amplificador lock-in, que tambin puede ser implementado digitalmente. Este dispositivo tiene como
caracterstica principal que elimina el ruido introducido en la seal de medicin a otra frecuencia que no

sea la de referencia sin afectar dicha medicin. 31,47,50,51 En estos sistemas se miden los cambios de amplitud y
fase de las seales pticas intrnsecas (IOS), las cuales revelan cambios en la transmitancia y dispersin
de la luz. Estos sistemas en general se componen de tres partes principales: 1) fuente de alta frecuencia
que modula la intensidad de la luz; 2) detector de luz; 3) procesamiento de seales y el mdulo de
adquisicin de datos. El emisor es excitado por una fuente de corriente sinusoidal de intensidad modulada,
generada y controlada por la UCPC. Los fotones dispersos, despus de la interaccin con el medio, son
capturados por el detector de luz. En el mdulo de procesamiento de seales, se incluye un circuito
integrado (CI) demodulador, un filtro pasa bajo y un circuito de amplificacin, la seal demodulada
obtenida

en el procesamiento analgico

es muestreada por el mdulo de adquisicin de datos.

Finalmente, se enva la seal a un ordenador personal para su posterior anlisis. 31 La combinacin de estas
tcnicas proporciona una elevada relacin seal-ruido y la falta de sensibilidad a la luz ambiente. 31,50

Sistemas pticos para la medicin de turbidez, aplicados a los bioprocesos


El control de los procesos de fermentacin se encuentra limitado por la incapacidad para medir parmetros
tales como: sustrato, producto y concentracin de biomasa para mantener una lnea rpida de
realimentacin. Los parmetros fsicos y qumicos, tales como la temperatura y el pH, actualmente pueden
medirse en lnea usando sensores adecuados. Sin embargo, para obtener informacin sobre la densidad
ptica, es preciso, en algunos casos, tomar muestras para la medicin. El diseo de nuevos sistemas
pticos ha permitido el desarrollo de las tcnicas espectroscpicas, haciendo posible registrar en tiempo
real los parmetros que intervienen en el proceso de fermentacin. Las tcnicas espectroscpicas
requieren de una mnima o ninguna preparacin de la muestra, y se pueden utilizar para evaluar
simultneamente varios parmetros en matrices complejas. 52
Se han desarrollado nuevos diseos de biorreactores destinados a la medicin on-line de densidad ptica.
Un ejemplo es el dispositivo desarrollado por Pascal Picart, 53 dedicado a la medicin simultnea de la
bioluminiscencia y la densidad ptica en un cultivo de bacterias bioluminiscentes. El biorreactor
optoelectrnico dispone de un mdulo que incluye: un diodo lser modulado dedicado a la medicin de la
densidad ptica y un cabezal de deteccin para la adquisicin de la bioluminiscencia y las seales de
densidad ptica. La bioluminiscencia se mide a travs de una unidad fotomultiplicadora muy sensible que
ha sido calibrada fotomtricamente para permitir mediciones de la luz a flujo

continuo. El sistema

optoelectrnico para determinar la densidad ptica consta de un diodo lser y un fotodiodo. El dispositivo
ha sido validado con la bacteria Vibrio fischeri, en condiciones de cultivo continuo. Se ha comprobado una
muy buena correlacin entre las mediciones manuales y las automticas procesadas con este
instrumento.53
Es importante destacar que se han realizado varias mediciones on-line en procesos de fermentacin de E.
coli de cultivos de gran densidad mediante dispositivos pticos basados en fuentes de luz como las

lmparas o emisores de luz de diodos (LED). 39Un ejemplo es la investigacin realizada por Martin y
Timothy, en la que se describe el procedimiento no invasivo de una nueva sonda ptica basada en la
reflectancia ptica. La naturaleza no invasiva de la medicin evita los problemas de ensuciamiento del
sensor y la contaminacin cruzada, adems de la necesidad de esterilizar la sonda, lo que reduce el costo
de los materiales utilizados en la produccin del sensor. El instrumento consta de un sensor ptico que se
monta sobre el exterior del recipiente de fermentacin y de un monitor que procesa las seales de
reflectancia medidas por los sensores. El rendimiento del instrumento fue probado bajo las condiciones de
fermentacin del microorganismo E. coli.54
En recientes publicaciones, se trata el uso del sensor llamado TruCell, desarrollado por la compaa
Finesse, LLC, que consiste en una fuente lser dirigida a travs de una ventana de tefln. Este sensor
puede captar la luz dispersada enviada hacia adelante, dentro de un cono de 20, lo que hace posible una
mayor deteccin de la intensidad de luz transmitida. Este ngulo de recogida permite al sensor lograr una
gran relacin seal-ruido, incluso en medios muy turbios. Este sensor es capaz de medir en tiempo real
dentro de una brecha de la sonda de medicin, la cual tiene una longitud fsica de acuerdo con el camino
ptico de la luz, que pasa directamente a travs del medio lquido en el interior del biorreactor.40,55
Las investigaciones destinadas a mejorar los sistemas para la medicin de turbidez, van enfocadas no solo
a realizar cambios en la fuente de radiacin y deteccin, sino tambin, a mejorar la captacin de la seal
de salida del detector o sensor ptico para distintos campos de medicin, y se centran en variantes tales
como: la posicin del detector, la amplificacin de la seal medida y la disminucin

de los ruidos

procedentes de fuentes externas, con el objetivo de obtener una mejor sensibilidad en la medicin, as
como un valor cercano al real.

Sistemas turbidimtricos (on-line) aplicados a los bioprocesos y disponibles en el mercado


internacional
La academia y la industria han propuesto diferentes inventivas para el desarrollo de mtodos rpidos y la
automatizacin

de

instrumentos aplicados a los bioprocesos, buscando siempre las ms precisas y

confiables. De modo que se ha desarrollado un rea dinmica de la microbiologa aplicada que hace frente
al estudio para mejorar los mtodos de deteccin temprana, la caracterizacin y el recuento de
microorganismos tanto en productos clnicos, como en muestras de alimentos, productos industriales y
ambientales.56 En el mercado internacional se pueden encontrar diferentes sistemas que emplean como
tcnica de diagnstico la medicin de turbidez y que se utilizan en los procesos biotecnolgicos.
El desarrollo de nuevos sensores pticos, que pueden ser incorporados a un biorreactor, ha permitido la
medicin de la densidad ptica on-line. Entre ellos, se encuentra la sonda no invasiva, BE2100, fabricada
por la compaa Applikon Biotechnology. Este sensor se ha diseado para su uso en laboratorios de

investigacin y en ambientes industriales. Debido a la que no precisa ningn contacto directo con el medio,
el sistema puede ser utilizado en los procesos de cultivo de microorganismos patgenos y no necesita ser
esterilizado.57 El sensor BE2100 emplea una matriz de rayos lser y detectores infrarrojos, los cuales son
sensibles a los diferentes cambios en la biomasa del cultivo. Este sensor realiza mediciones continuas y en
tiempo real, en un intervalo mayor de 300 unidades de densidad ptica. 57-58
El OD4, es un sensor ptico creado por la compaa DASGIP Information and Process Technology GmbH,
para el registro on-line de la absorbancia y el crecimiento celular. El mdulo correspondiente se puede
incorporar en cuatro biorreactores como mximo. Utiliza sensores infrarrojos de gran precisin con
diferentes longitudes de trayecto ptico. 59 Cada mdulo OD4 tiene su propio microprocesador, el cual
permite que todos los datos puedan ser transferidos a un sistema de control para la

supervisin del

proceso. Presenta un intervalo de medicin de 0 a 5 unidades de absorbancia. 60


Otro ejemplo es el sensor InPro 8200 (de fibra doble), fabricado por Mettler Toledo Ingold. 61 La medicin
ptica de turbidez en este caso, se basa en la tecnologa de luz retrodispersa o backscattered light, opcin
indicada para grandes concentraciones de slidos no disueltos en el cultivo. Utiliza la tecnologa de fibra
ptica y presenta un intervalo de medicin de 5 a 4000 FTU (Unidades de Turbidez Formazin) por sus
siglas en ingls.62-63
Estos sistemas pticos de medicin estn especficamente diseados para integrarse en el biorreactor.
Adems, le proporcionan a los operadores una herramienta poderosa para caracterizar el crecimiento de
clulas en tiempo real en laboratorios de investigacin, plantas piloto, en cultivos celulares a gran escala,
y en instalaciones de fermentacin.64

CONCLUSIONES

La turbidimetra es una tcnica

que se sustenta bsicamente en los fenmenos pticos que ocurren

durante el paso de un haz de luz a travs de un medio. La implementacin de tcnicas de medicin cada
vez ms novedosas ha permitido realizar mediciones de turbidez que incluyen una buena linealidad y
estabilidad, un amplio intervalo de medicin y la posibilidad de medir la turbidez de la muestra, incluso en
presencia de colorantes. De igual modo, la introduccin de nuevos sistemas pticos para medir el
crecimiento celular en los procesos biotecnolgicos contina creciendo en inters, ya que constituye una
estrategia de control para los bioprocesos. De esta manera, el continuo desarrollo de los sensores pticos,
como por ejemplo, las sondas de densidad ptica, los biosensores pticos, los sensores de fibra ptica,
los infrarrojos y de fluorescenc

La turbidimetra y la nefelometra tienen una gran variedad de aplicaciones y permite


trabajarcon muestras gaseosas, liquidas e incluso con slidos transparentes. La
formacin deprecipitados difciles de filtrar, como por ejemplo los gelatinosos o los de
tamao de partculamuy pequeo, suelen proporciona suspensiones ideales para la
aplicacin de tcnicas basadasen la dispersin de la luz que sustituye a las tcnicas
gravimtricas. Este tipo de aplicacionesson frecuentes en laboratorios analticos,
laboratorios clnicos y en plantas de procesos. Unode los principales campos de
aplicacin reside en estudios de polucin de aire y agua, donde las dos tcnicas se
usan para determinar la transparencia y controlar el tratamiento de aguaspotables,
efluentes de plantas de tratamiento de aguas y otros tipos de aguas ambientales.Las
medidas de dispersin de la luz se utilizan tambin para determinar la concentracin
dehumos, polvo, niebla, aerosoles, etc.A pesar de que los trminos turbidimetra y
nefelometra suelen restringirse a aquellasaplicaciones en las que se mide la
concentracin de partculas en suspensin existen tambinotros tipos de aplicaciones
basados en las medidas de dispersin de la luz. Entre ellaspodemos citar la
determinacin de la forma y tamao de las partculas as como la de lospesos,
moleculares (especialmente en el caso de polmeros).
Cmo diferenciar la turbidimetra y la nefelometra?
Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de
partculasslidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa
turbia La turbidezes la propiedad ptica de una muestra que hace que la radiacin sea
dispersada y absorbidams que transmitida en lnea recta a travs de la muestra. La
turbidez es ocasionada por lapresencia de materia suspendida en un lquido. Hay dos
mtodos para medir la turbidez deuna muestra, la turbidimetra y la nefelometra. Son
dos tcnicas complementarias que seutilizan para el anlisis cuantitativo de
disoluciones coloidales, emulsiones, humos o nieblas.La dispersin no supone la prdida
neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin dela propagacin, porque la
intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo.En la turbidimetra se
compara la intensidad del rayo de luz que emerge con la del que llega ala disolucin. En
cambio, en la nefelometra la medida de la intensidad de luz se hace con unngulo de
90 con respecto a la radiacin incidente. El instrumento usado en la nefelometra,el
nefelmetro se asemeja al fluormetro. En cambio en turbidimetra se utiliza
elturbidemetro que es un fotmetro de filtro.
DEFINICIONES
Turbidimetra
Es un mtodo en el que se mide la disminucin de la potencia de la radiacin
transmitidadebido a la dispersin. Se mide en un espectofotmetro UV/Vis.Para
determinar la concentracin del analito mediante este mtodo aplicamos:


En donde T es la transmitancia medida

,
es la intensidad de la fuente de radiacintransmitida,

es la intensidad de la radiacin de la fuente transmitida por un blanco. Larelacin entre

y la concentracin de las partculas dispersas es similar a la proporcionadapor la ley de


Beer:

Siendo

la concentracin de las partculas dispersantes expresada como masa por unidad


devolumen;

es la longitud del camino ptico y

es una constante que depende de variosfactores: tamao, forma de las partculas


dispersantes y la longitud de onda.
Nefelometra
Es un mtodo para medir la intensidad de una radiacin dispersa en un ngulo de 90 C
conrespecto a la fuente. Se mide en un espectrofluormetro.Para determinar la
concentracin de analito en este mtodo aplicamos:

Donde
es una constante emprica del sistema,
es la intensidad de la fuente de radiacinincidente. El valor de depende de una curva
de calibracin preparada, usando una serie depatrones de concentracin conocida.
Eleccin entre turbidimetra y nefelometra
La eleccin entre turbidimetra y nefelometra viene dada por dos factores:-

Intensidad de la radiacin transmitida o dispersada con la intensidad de la


radiacinprocedente de la fuente. Cuando la concentracin de partculas dispersantes
en ladisolucin es pequea,

ser muy similar a

. Por lo que la mejor eleccin cuando lamuestra contiene pocas partculas dispersantes
es la nefelometra. La turbidimetra esuna buena tcnica para cuando las muestras
contienen grandes concentraciones departculas dispersantes.-

Tamao de las partculas dispersantes. En la nefelometra la intensidad de la


radiacindispersada a 90C es mayor si las partculas son bastante pequeas para que
seproduzca una dispersin Rayleigh. Si las partculas son mayores la intensidad de
ladispersin disminuir a 90C. En turbidimetra la seal consiste en la
disminucinrelativa de la radiacin transmitida, por lo que el tamao de las
partculasdispersantes es menos importante.Generalmente, nefelometra y
turbidimetra se utilizan en el anlisis de la calidad qumica delagua para determinar la
claridad y para el control de los procesos de tratamiento. Tambin seutilizan para la
determinacin de iones sulfato.
TURBIDIMETRA
Dispersin de la radiacin por partculas en disolucin
.Cuando un haz de luz monocromtica, de longitud de onda no absorbible choca contra
laspartculas de una sustancia que est en suspensin, cambia la direccin de
propagacin delhaz de luz (en realidad slo cambian de direccin algunos fotones del
haz). Este efecto esusado para determinar la presencia de un analito en suspensin ya
que ese cambio dedireccin del haz y de su intensidad depende de muchos factores
que una vez relacionados ycuantificados permiten obtener los valores buscados.Cuando
un haz de radiacin monocromtica de una longitud de onda determinada

, es
enfocada sobre un medio que contiene partculas de dimensiones menores a 3/2
, se
observa dispersin de radiacin en todas las direcciones del espacio. Si la partcula
presentamayores tamaos, la radiacin puede ser reflejada o refractada. Existen dos
tipos dedispersin:1. Elstica: radiacin es absorbida por el analito y reemitida sin
cambios en la energade la radiacin. Es el caso de la dispersin Raileigh o las
dispersiones de grandespartculas.2. Inelstica: la radiacin es absorbida y reemitida
con cambios en su energa.
Turbidimetra fundamento
La turbidimetra puede realizarse en espectrofotmetros de visible o violeta. Cuando
laconcentracin de partculas en suspensin se mide por turbidimetra, la suspensin se
poneen una cubeta similar a un tubo de ensayo, que permite realizar las medidas de las
energaincidentes y transmitidas. La fuente de radiacin ms frecuentemente usadas es
la lmpara dewolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiacin visible. Si
ponemos en la cubetasuspensiones coloreadas se debe usar un filtro para evitar que
influya sobre los resultadosdando valores excesivamente altos. Los Turbidmetros
pueden incorporar cualquier detectorque sea sensible a la longitud de onda transmitida.
http://es.slideshare.net/jhonnyrojanop/turbidimetria-ambiental