2013

I. INTRODUCCIN
En el presente informe de laboratorio se muestra como se realiza la
preparacin de muestras para la observacin de microorganismos
usando la tcnica de tincin Gram. Utilizando el fundamento de esta
tcnica para predecir e identificar los microorganismos encontrados
en las diferentes muestras.

II. MARCO TERICO

TINCIN GRAM
Mtodo de tincin descrito por primera vez por el mdico dans
Christian Gram en 1884 utilizado para teir paredes bacterianas y que
permite diferenciar los dos grandes grupos bacterianos: las bacterias
gram-positivas y las gram-negativas. La tincin se basa en las
diferencias que existen en la composicin molecular de las paredes de
ambos grupos de bacterias: el procedimiento consiste en teir las
paredes con un colorante bsico reforzado por un mordiente; las
bacterias gram-positivas retienen el colorante aunque se intente
decolorarlas con alcohol etlico; si a continuacin se aade un colorante
de contraste, se podr observar las bacterias gram-positivas teidas de
color azul y las gram-negativas de color anaranjado.
Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram
negativo
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre
las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa
de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado
en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana
plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el

cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano

(tambin conocido como murena).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas
es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica
exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de
lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una
membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha
de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de
bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las
Grampositivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las
Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la
decoloracin, se debe a quela membrana externa de las Gram
negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la
mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal
violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se
escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario,
las Grampositivas, al poseer una pared celular ms resistente y con
mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin
del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

Reactivos

Utilizados:

1.

CRISTAL

VIOLETA o violeta de genciana: COLORANTE BASICO

2. LUGOL DE GRAM: MORDIENTE
3. ALCOHOL ACETONA: DECOLORANTE
4. FUSCINA (SAFRANINA): COLORANTE DE CONTRASTE
Cristal Violeta
Es el nombre dado a un grupo de compuestos qumicos empleados
como indicadores de pH y colorantes.
Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil prosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede
crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto ms
metilado est el colorante, su color ser de un violeta ms oscuro
Propiedades: En la forma pura, el violeta de cristal se presenta como
lustrosos cristales azul verdosos que funden a 137 Celsius

(279Fahrenheit). Los violeta de metilo son solubles

en agua, etanol, dietilenglicol, y dipropilenglicol. En particular, el violeta
de metilo 6B es soluble en agua al 2.93% y soluble en etanol al
15.21%..
Obtencin: El violeta de metilo se obtiene por reaccin de condensacin
de la cetona de Michler (4,4'-Bis-dimetilamino-benzofenona) con N,Ndimetilanilina en presencia de clorato de fosforilo.
Safranina
La safranina es una dimetil safranina. Hay tambin una trimetil
safranina, que tiene un grupo metil agregado en la posicin orto- del
anillo ms bajo. Ambos compuestos se comportan de forma
esencialmente idntica en usos biolgicos de tincin, y muchos
fabricantes de safranina no distinguen entre los dos. Los preparados
comerciales de safranina frecuentemente tienen una mezcla de ambos.
Usos:

Es un colorante biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin

de Gram para proporcionar un color violeta ms intenso a las
bacterias Gram+ y tie de rosa a las bacterias G- ; en histologa y
en citologa. La safranina se usa como lquido de contraste en
algunos protocolos de tincin, coloreando el ncleo celular de
rojo.

Tambin

para

detectar cartlago, mucina y

grnulos

de mastocitos.

Tambin se usa como indicador redox en qumica analtica.

III.

OBJETIVOS

Aprender a preparar muestras con la tcnica de Gram.

Identificar microorganismos, diferenciando si son

Gran

positivas y Gram negativas.

IV.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
Microscopio
Lamina PortaObjeto
Lamina CubreObjeto
Mechero Bunsen
Asa de Kolle

REACTIVOS
Cristal Violeta
Lugol
Aceite de Inmersin
Safranina
Alcohol Cetona
Chica de Jora
Yogurt natural

V. PROCEDIMIENTO
1. Tcnica de Gram

a. Frotis o extendido
La muestra (sarro dental, isopado farngeo, agua residual,
yogur, etc) se coloca en el centro de una lmina porta objetos
y con un asa de Kolle se extiende en la superficie media.
b. Fijacin
Consiste en calentar el envs de la lmina portaobjetos en la
llama del mechero, con la finalidad de que las clulas se
adhieran a la superficie de la lmina.
c. Coloracin primaria

Se cubre el frotis con el colorante primario cristal violeta o

violeta de genciana durante un minuto, tiempo luego se lava el
exceso con un chorro de agua destilada.
d. Mordiente
El frotis se cubre con una solucin de Lugol (solucin de yodo y
yoduro de potasio) durante un minuto, tiempo luego del cual
se lava el exceso.
e. Decoloracin
Se realiza cubriendo el frotis con alcohol cetona por un periodo
de tiempo aproximado de 10 segundos. Luego se lava con
agua destilada.
f. Coloracin secundaria o de contraste
Se hace un cubriendo el frotis con safranina durante un
minuto, tiempo despus del que se lava con agua destilada.
g. Observacin al microscopio
Antes de la observacin, la lmina debe secar completamente
al medio ambiente y la observacin se hace con el objetivo de
inmersin usando el aceite de cedro o de inmersin.

VI.

RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

RESULTADOS
Muestra de Chicha de
jora
En
la
muestra
se
observa la presencia de
bacilos y una coloracin
azul violeta.

Muestra de
Yogurt
No
se
pudo
identificar
muy
bien
los
microorganismos,
pero se vio que se
volvi
de
color

Muestra de Sarro
dental
En
esta
muestra
observamos
restos
de
alimentos
y
algunos bacilos lo
cual se colorearon de
violeta.

violeta
partes.

ciertas

ANLISIS DE RESULTADOS

Muestra de Chicha de
jora
La
presencia
de
la
coloracin azul violeta
es debido a la presencia
de
microorganismos
Gram positivos.

VII.

Muestra de
Yogurt
El color violeta
nos indica que
hay
microorganismos
Gram positivos.

Muestra de Sarro
dental
Ya que en esta muestra
tambin se observ una
pequea
porcin
de
coloracin azul violeta,
podemos
deducir
la
presencia
de
microorganismos
Gram
positivos.

CONCLUSIONES

Corroboramos la teora viendo que los microorganismos Gram

positivos su coloracin es Morada y los Gram negativas son de
color rosado.
Con la ayuda de las distintas tinciones hemos podido distinguir la
estructura de algunos microorganismos obtenidos mediante las
coloraciones realizadas en prctica.
Se pudo comparar los distintos resultados y morfologas que
adoptaron las muestras en relacin con sarro dental, yogurt y
chicha obtenidas en prctica de laboratorio.

VIII.

BIBLIOGRAFA

http://facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedIn
t/Tencion_de_gram.pdf
http://www.esacademic.com/dic.nsf/es_mediclopedia/20605/tinci
%C3%B3n
http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/im
ages/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica
%203%20Tinci%C3%B3n%20de%20Gram.pdf

CUESTIONARIO
1. Porque se recomienda colorantes bsicos para la tincin
de clulas bacterianas.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen
alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Se recomienda
utilizar colorantes bsicos (son molculas cargadas positivamente cationes) ya que se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucledos y los
polisacridos cidos, etc.
2. Seale los colorantes bsicos ms utilizados en la
coloracin de bacterias.

Son inestables a la luz por lo que no se emplean en artculos que

requieran una gran fijeza del color.

Estos son:

Azul de metileno

Verde Brillante

Verde malaquita

Violeta de metilo 2B

Violeta de metilo 10B

Fucsina

Rodomina

Negro Basico

Crisoidina

Auramina

Pardo Bismarck G