BOLETN ESCUELA DE MEDICINA U.C.

, PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

VOL. 33 N1 2008

LA FISIOPATOLOGA DE LA HEMOSTASIA:
ALGUNOS ASPECTOS SOBRE LA VIDA Y MUERTE DE
LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACION
Dr. Jaime Pereira G. (1)

RESUMEN

INTRODUCCIN

En las ltimas dos dcadas se ha progresado

notablemente en el conocimiento de la
fisiologa de las plaquetas. Esta nueva
informacin no solamente ha significado
cambiar una serie de paradigmas, sino
que tambin ha contribuido a un mejor
entendimiento del papel de estas clulas en
enfermedades hemorrgicas y trombticas.
Entre otros aspectos, han surgido nuevos
hallazgos con respecto a los procesos de
envejecimiento de las plaquetas en la
circulacin y la descripcin de marcadores de
edad plaquetaria; mecanismos de remocin
desde la circulacin y la demostracin de
que las plaquetas experimentan apoptosis
durante su envejecimiento en la sangre.
En cuanto a su participacin en procesos
patolgicos, se describi el papel que
juegan en la patogenia de los estados de
hipercoagulabilidad adquiridos, como los
que se observan en pacientes portadores
de lupus eritematoso sistmico y en el uso
crnico de cocana.

Las plaquetas son participantes esenciales

en el proceso de hemostasia primaria.
Adems, aunque las plaquetas carecen de
ncleo y podran ser definidas como trozos
de citoplasma de los megacariocitos, estas
clulas contienen muchos componentes
estructurales, metablicos y de sealizacin
propios de las clulas nucleadas. Incluso
debido a su participacin en diversos
procesos fisiolgicos y su accesibilidad,
han servido como modelo de estudio
en biologa celular. Las plaquetas, que
circulan normalmente en forma inactiva,
se adhieren a la pared del vaso daado,
secretan el contenido de sus grnulos e
interactan con otras plaquetas, formando
la base del tapn hemosttico. Adems, las
plaquetas participan en la activacin del
sistema de la coagulacin, proveyendo la
superficie sobre la cual se ensamblan los
complejos de este sistema (1). A la luz de
nuestro trabajo experimental y clnico en
torno a la fisiopatologa plaquetaria, en el
presente artculo haremos un recorrido
por aquellos aportes ms relevantes de
nuestro grupo.

Finalmente, la demostracin de que

las plaquetas son capaces de sintetizar
y expresar factor tisular funcional, nos
lleva a proponer un nuevo modelo de
hemostasia basado en clulas. En ste, las
plaquetas constituiran el punto de unin
entre hemostasia primaria y secundaria
y permitiran formular un modelo ms
racional para explicar los mecanismos
hemostticos en salud y enfermedad.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS
PLAQUETAS EN LA CIRCULACION
Las plaquetas humanas despus de ser
liberadas por los megacariocitos de la
mdula sea, permanecen en la circulacin

(1) Profesor Titular, Departamento de Hematologa y Oncologa.

Financiamiento: Fondecyt 1971024, 1990131, 1011010, 8010002, DIPUC 2006/10
Correspondencia: jpereira@med.puc.cl
Fax: 354 3772

durante 8 a 10 das, antes de su remocin

por parte de los macrfagos del sistema
reticuloendotelial (SRE) (2). Estudios de
cintica de plaquetas demostraron que
stas son removidas de la sangre en funcin
de su edad. Durante su envejecimiento en
la circulacin, las plaquetas sufren una
serie de cambios fsicos, bioqumicos y
funcionales, que determinan en gran parte
su heterogeneidad. Este fenmeno fue
el primero en ser abordado por nuestro
laboratorio, enfocndonos principalmente
en aquellos cambios que pudieran constituir
marcadores de edad de las plaquetas (35) (figura 1). Una vez demostrado que
las plaquetas circulantes envejecen, la
siguiente interrogante que surgi fue: Qu
determina, en condiciones fisiolgicas, su
remocin desde la circulacin al cabo de
8 a 10 das?. Debido a que las plaquetas
normales son retiradas de la circulacin en
funcin de su edad, era lgico suponer que
durante el proceso de envejecimiento se
verificaban alteraciones estructurales y/o
bioqumicas que finalmente determinaran
la remocin al final de su vida til. Con el
fin de contestar esta pregunta, iniciamos
estudios tendientes a investigar los cambios
plaquetarios durante su envejecimiento in
vivo que pudieran promover su retiro de la
circulacin. En este sentido, la investigacin
se enfoc en la prdida de la asimetra de
los fosfolpidos de membrana, como un
mecanismo fundamental.
5

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VOL. 33 N1 2008

Figura 1. En A se observa un aumento progresivo en el contenido de serotonina intraplaquetaria (5-HT) luego de esplenectoma efectuada a pacientes
portadores de PTI. El panel B muestra el recuento de plaquetas y el contenido de 5-HT determinados secuencialmente despus de la inyeccin de
estradiol en perros. En el C, se demuestra que las plaquetas de alta densidad (enriquecidas con plaquetas de mayor edad) expresan signicativamente
menor nmero de molculas de HLA, mientras que un antgeno plaquetario especco (PLA1) no cambia.

LA ASIMETRA DE LOS
FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA
DE LAS PLAQUETAS
En las clulas eucariticas, las dos caras de
la membrana plasmtica tienen una distinta
composicin fosfolpidica; esta distribucin
asimtrica se encuentra tambin presente
en la membrana plaquetaria. En las
plaquetas, los lpidos son primariamente
componentes de las membranas y estn
integralmente involucrados en actividades
biolgicas plaquetarias tales como
mantencin de la fluidez de la membrana,
produccin de eicosanoides y actividad
procoagulante. Los fosfolpidos constituyen
cerca del 80% de los lpidos plaquetarios. En
las plaquetas humanas se han identificado
cinco fosfolpidos mayores: fosfatidilcolina
(FC), que constituye alrededor del 38% del
total de fosfolpidos, fosfatidiletanolamina
(FE) 27%, esfingomielina (EM) 17%,
fosfatidilserina (FS) 10% y fosfatidilinositol
(FI) 5% (6). Es de inters sealar que
en las plaquetas humanas, los lpidos
de la membrana plasmtica tienen una
distribucin asimtrica: el 93% de la EM
y 45% de la FC se encuentran en la mitad
externa de la bicapa, mientras que un 80%
de la FE y 92% de la FS se encuentran
en la mitad interna; siendo imposible
descartar que cantidades menores de
FS se expresen en la mitad externa de la
membrana. Esta distribucin preferencial
de los aminofosfolpidos en la capa interna
6

de la membrana se encuentra tambin en

los glbulos rojos (7).
La asimetra de los fosfolpidos de
membrana se mantiene por tres actividades
diferentes:
Translocasa de aminofosfolpidos. La
actividad de translocasa de aminofosfolpidos
dependiente de ATP, fue originalmente
descrita en glbulos y requiere la accin
concertada con otra protena de 32 Kd,
como ha sido descrito para transportadores
ABC (ATP-Binding Cassette). Esta
actividad adems de plaquetas y eritrocitos
se ha descrito en varias clulas incluyendo
las clulas endoteliales (7).
Flopasa dependiente de ATP. Esta
actividad tambin fue descubierta en
eritrocitos y transporta principalmente
colinofosfolpidos (neutros) a la cara externa
y en menor medida aminofosfolpidos.
Su actividad concertada con aqulla
descrita para la translocasa provee a la
clula de un efectivo mecanismo que
corrige las alteraciones en la distribucin
de
fosfolpidos,
evitando
posibles
consecuencias patolgicas.
Escramblasa de lpidos. La membrana
plasmtica dispone de un mecanismo
dependiente de Ca++ que rpidamente
mueve fosfolpidos hacia adentro y afuera,
llevando en minutos a prdida de la
asimetra de los fosfolpidos de membrana

(8), la clonacin del gen de la escramblasa,

permiti obtener una estructura deducida
de la una protena de 37 Kd con un nico
segmento de transmembrana (9).

En resumen, la generacin y mantencin

de la asimetra de los fosfolpidos de la
membrana celular es producto de la
accin sincrnica y cooperativa de la
aminofosfolpido translocasa y flopasa
inspecfica, mientras que la actividad
de la escramblasa resulta en su
colapso. La prdida de esta distribucin
asimtrica de los fosfolpidos se produce
por dao celular, activacin o muerte
celular programada (apoptosis). Estos
mecanismos generales pueden explicar
una gran variedad de situaciones en las
que se produce prdida en la asimetra
de fosfolpidos: eritrocitos y plaquetas
almacenadas (10, 11), clulas falciformes
(12), clulas sanguneas en diabticos (13),
glbulos rojos envejecidos (14) y clulas
tumorales indiferenciadas (15).
La biognesis y mantencin de la asimetra
de fosfolpdos es de gran importancia en
la homeostasis del organismo, debido a
que la exposicin de fosfolpidos aninicos
en la cara externa de las membranas
celulares se asocia a dao celular, lo que se
traducira en: 1) Aumento de la actividad
procoagulante, ya que los fosfolpidos
aninicos, en particular FS, proveen sitios

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de unin y ensamblaje de los complejos

tenasa y protrombinasa, requeridos para
la activacin del factor X y protrombina
respectivamente (7); 2) activacin de
complemento a travs de la va alterna
(16) 3) reconocimiento y remocin de las
plaquetas por parte de los macrfagos del
SER, que poseen receptores para FS (17, 18).
En ese momento propusimos como hiptesis
de trabajo que durante el envejecimiento
de las plaquetas en la circulacin se
producira prdida de la asimetra de
los fosofolpidos de membrana, lo que
determinara la remocin de las plaquetas
de la circulacin.

EL ENVEJECIMIENTO DE LAS
PLAQUETAS EN LA CIRCULACIN
SE ASOCIA A PRDIDA DE
LA ASIMETRA DE LOS
FOSFOLPIDOS DE MEMBRANA
Este fenmeno lo estudiamos en dos
tipos de condiciones experimentales 1) en
subpoblaciones de plaquetas de diferente
densidad, aprovechando el hecho que las
plaquetas humanas aumentan de densidad
con la edad (3, 4 y 2) en un modelo canino
de supresin de la trombopoyesis in vivo
(19). Estudios previos haban demostrado
que perros expuestos a altas dosis de
estradiol desarrollaban trombocitopenia
por supresin de la megacariopoyesis; este
modelo haba sido caracterizado y validado
en el laboratorio, para obtener plaquetas
de diferente edad (5). La exposicin de
fosfatidilserina (FS) sobre la membrana
plaquetaria se demostr mediante
citometra de flujo usando anexina V
marcada con fluorescena. Utilizando este
modelo experimental, demostramos que
la expresin de fosfatidilserina aumentaba
con la edad de las plaquetas En efecto, la
proporcin de plaquetas que expresaban
FS sobre la cara externa de la membrana
aumentaba significativamente con la edad,
desde 3.10.4% antes a 17.712.3%, diez
das despus de la exposicin a estradiol (19)

Figura 2. Recuento de plaquetas y proporcin de plaquetas que expresan fosfatidilserina (FS)

determinados secuencialmente despus de la inyeccin de estradiol en perros. El porcentaje de
plaquetas que expresan FS a los diferentes tiempos fue determinada mediante citometra de flujo.
Los datos representan el promedio error estndar. La exposicin de FS alcanz una diferencia
significativa al da 9 cuando se compar con los das 0 y 3 post-inyeccin de estradiol.

(figura 2). Estos resultados demostraron

que el envejecimiento de las plaquetas en
la circulacin se asocia a prdida de la
asimetra de fosfolpidos, lo cual podra
jugar un papel en el reconocimiento y
posterior remocin de las plaquetas de
la circulacin.

EL ENVEJECIMIENTO DE
LAS PLAQUETAS SE ASOCIA
A CAMBIOS PROPIOS DE LA
APOPTOSIS
Como continuacin de esta lnea de
investigacin, nos interes conocer los
posibles mecanismos de esta prdida de
la distribucin asimtrica de fosfolipidos
durante el envejecimiento plaquetario in
vivo e in vitro. La prdida de la asimetra
de fosfolpidos es comn a todas las
clulas eucariticas y en muchos sistemas
celulares estudiados hasta ahora parece ser
el fenmeno universal que acompaa a la
muerte celular programada o apoptosis (20).
Debido a que inicialmente se dio mucha
importancia al ncleo en la ejecucin
de la apoptosis, la idea que las plaquetas
como clulas anucleadas pudieran

presentar este fenmeno pareca altamente

improbable. Sin embargo, experimentos
in vitro demostraron que las plaquetas
podan experimentar cambios propios de
la muerte celular programada (21), en que
la mitocondria actuara como ejecutora del
proceso. Con el fin de investigar si durante
su envejecimiento en la circulacin, las
plaquetas sufran apoptosis, utilizamos
nuevamente el modelo canino de supresin
de la trombopoyesis. Como marcador
de apoptosis se determin el colapso del
potencial de membrana de la mitocondria
(m) (22). El envejecimiento de las
plaquetas en la circulacin se acompa
de prdida del potencial de membrana
mitocondrial y exposicin de FS (figura 3).
As, por primera vez se demostraba que la
senescencia de las plaquetas se asociaba
a cambios propios de la apoptosis, que
podran ser determinantes de su remocin
desde la circulacin. Esta sugerencia fue
confirmada recientemente por Mason y
colaboradores(23), quienes demostraron
que las plaquetas poseen un programa
intrnseco para la apoptosis, centrado
en la mitocondria,
que controla su
supervivencia y determina su permanencia
en la circulacin.
7

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VOL. 33 N1 2008

especficos puedan ser los responsables

de la destruccin de las plaquetas. En un
estudio realizado en nuestro laboratorio en
pacientes portadores de LES, encontramos
una
prevalencia
de
anticuerpos
antiplaquetarios especficos de solamente
17%, en contraste con un 44% que
presentaba aAFL, cuya presencia se asoci
a recuentos de plaquetas significativamente
ms bajos (25, 26). En ese mismo
estudio, encontramos que era posible
absorber/eluir aAFL purificados a/desde
plaquetas intactas, sugiriendo exposicin
de FL aninicos sobre la membrana
de las plaquetas. De acuerdo con estos
resultados, planteamos en esa oportunidad
que en el LES la prdida de asimetra de
los fosfolpidos de membrana podra jugar
un papel central en la remocin acelerada
de las plaquetas de la circulacin.

Figura 3. En A se observa el colapso del potencial de transmembrana mitocondrial (m) durante

la cada del recuento de plaquetas despus de la supresin de la trombopoyesis en perros. m
fue determinado por incubacin de las plaquetas con DIOC6 y analizadas mediante citometra de
flujo. La intensidad media de fluorescencia (MFI) se presenta como el promedio error estndar de
11 determinaciones. Se observ una cada significativa de la MFI al da 8 despus de la inyeccin
de estradiol *p<0.05. En B, se muestra el colapso de m determinado por la incubacin de las
plaquetas con JC-1 y medicin de la fluorescencia en canales FL1 y FL2 del citmetro de flujo. Los
resultados se expresan como la razn FL1/FL2. Los datos representan el promedio error estndar
(n:13). El aumento en la razn FL1/FL2 es estadsticamente significativa al da 8 post-inyeccin de
estradiol, comparada con los das 0, 3 y 5 *p<0.05.

Esta nueva informacin sobre los

fenmenos que participaban en la
remocin fisiolgica de las plaquetas de la
circulacin, especialmente la prdida de
la asimetra de fosfolpidos, nos movi a
relacionarlos con fenmenos patolgicos,
en los cuales las plaquetas son removidas
prematuramente de la circulacin. En
este sentido, consideramos que en la
fisiopatologa de la trombocitopenia
encontrada en algunas enfermedades, se
haban descrito elementos y mecanismos
propios de aquellos que participan en la
remocin fisiolgica de las plaquetas.
8

LA REMOCIN PATOLGICA DE
LAS PLAQUETAS EN EL LES
En el lupus eritematoso sistmico (LES), la
trombocitopenia es una complicacin que
se presenta en alrededor del 30% de los
pacientes (24). En la mayora de los casos
se asocia a un aumento de la IgG asociada
a las plaquetas (PAIgG), lo cual ha sugerido
que la destruccin plaquetaria sera de
tipo inmune. Debido a que el LES es una
enfermedad autoinmune caracterizada por
la existencia de mltiples autoanticuerpos,
es posible que autoanticuerpos plaquetarios

En esa lnea, postulamos que en el LES

las plaquetas experimentaran cambios
anlogos a los desarrollados durante su
envejecimiento fisiolgico, aunque de
mayor intensidad, lo que se traducira en
prdida precoz de la distribucin asimtrica
de los FL de la membrana. Propusimos
esa hiptesis de trabajo sobre la base de
estudios que demostraban que en el LES
existira una alteracin en los mecanismos
de muerte celular programada, tanto en la
patogenia de la enfermedad (27) como en
la gnesis de algunas de sus manifestaciones
(28). Especficamente, se haba encontrado
que aAFL obtenidos de pacientes con LES
inducan apoptosis en clulas endoteliales,
a travs de su interaccin con anexina V
(28). Esta actividad inductora de apoptosis
en pacientes con LES y la presencia de
anexina V en las plaquetas normales (en
forma similar a las clulas endoteliales),
nos indujo a estudiar este fenmeno en las
plaquetas de estos pacientes. Se postul que
los eventos procoagulantes y la generacin
de aAFL en el LES seran consecuencia del
mismo fenmeno fisiopatolgico: exposicin
de FL aninicos en distribucin distinta a
la encontrada en la bicapa normal. En este

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Tabla 1. Marcadores de apoptosis en plaquetas de pacientes portadores de lupus eritematoso

sistmico (LES).

Palquetas Anexina V
(+)
(%)

MP (nM FS)*

(FL1/FL2)

LES activo

16

6.2 + 1.7

0.48 + 0.13

1.1+ 0.2

LES inactivo

14

2.7 + 0.6

0.23 + 0.06

0.9 + 0.2

Controles 30

30

1.9 + 0.3

0.19 + 0.04

0.96 + 0.1

< 0.03

< 0.02

< 0.05

p ***

*Micropartculas cuantificadas en plasma mediante actividad procoagulante

**Prdida de potencial de transmembrana mitocondrial determionado por citometra de flujo
*** Diferencia entre LES activos y controlespor analisis de variango

sentido, una de las alteraciones celulares

que es propia de la apoptosis y que ha sido
demostrada en plaquetas, es la generacin
de micropartculas desde la membrana,
probablemente por escisin proteoltica de
protenas del citoesqueleto (21).
En las plaquetas circulantes de pacientes
con LES activo, se demostr cambios
propios de la apoptosis tales como prdida
de la asimetra de FL, colapso del potencial
de membrana de la mitocondria y aumento
en la generacin de micropartculas (MPs)
(29) (Tabla 1).
La prdida de asimetra de FL y la
generacin de MPs son fenmenos
caractersticos de las clulas que
experimentan apoptosis; sin embargo, en
las plaquetas tambin pueden presentarse
como consecuencia de la activacin
inducida por distintos agonistas (30). Estas
MPs expresan FL cargados negativamente,
los cuales proveen una superficie
procoagulante para el ensamblaje de los
complejos enzimticos de la coagulacin
(31, 32); adems, existen datos recientes
que identifican a las MPs como fuente de
factor tisular (FT) funcionalmente activo, el
principal iniciador de la coagulacin in vivo
(33, 34). Desde un punto de vista clnico, las
MPs constituyen marcadores patognicos,

ya que varias condiciones protrombticas

estn asociadas a un aumento en el nmero
de MPs circulantes (35-38).

los pacientes (figura 5) y se correlacionaba

en forma directa con las MPs circulantes
(figura 6). El aumento en el nmero
de MPs derivadas de plaquetas y su
asociacin con un aumento del ETP,
sugieren que estas MPs pueden jugar
un papel importante en el estado
protrombtico en esta patologa (44).
De acuerdo a los resultados anteriores, parece
evidente que las alteraciones plaquetarias
en los pacientes con LES no se asocian a
trombocitopenia sino ms bien a un estado
de hipercoagulabilidad adquirido. En este
sentido, es importante considerar que los
pacientes portadores de LES muestran un
riesgo aumentado de presentar trombosis
venosas y arteriales (45). Con respecto a
las trombosis arteriales, los pacientes con
LES tienen mayor predisposicin para
desarrollar arterioesclerosis acelerada y

En el LES y otras enfermedades del

tejido conectivo se ha descrito circulacin
de plaquetas activadas y aumento en el
nmero de MPs (39-43). Debido a que la
mayora de los estudios incluy pacientes
con sndrome antifosfolpidos primario o
secundario, y con el fin de excluir el efecto
de los anticuerpos antifosfolpidos sobre
el estado procoagulante, investigamos en
pacientes portadores de LES el nmero
y caractersticas antignicas de las MPs
circulantes y su capacidad para aumentar
la generacin de trombina (44).
Se cuantific el nmero y origen celular
de los MPs circulantes y tambin la
generacin de trombina (GT) del plasma,
medida como el Potencial Endgeno de
Trombina (ETP), sin la adicin de FL o
factor tisular; bajo estas condiciones, la
GT depende directamente del nmero
de MPs presentes en el plasma de los
pacientes. En la figura 4 se muestran los
resultados de la cuantificacin de MPs
en pacientes y controles. Con respecto al
origen celular de las MPs, encontramos
que el 76% se originaba en las plaquetas.
El ETP fue significativamente mayor en

Figura 4. Enumeracin mediante citometria

de flujo de las micropartculas circulantes (MP)
en pacientes con LES inactivo o activo (MEXSLEDAI >0). La enumeracin de las MP totales
(A) fue realizada usando anexina V-FITC; las
MP derivadas de plaquetas (B) se cuantificaron
usando doble marca con anexina V-FITC y antiCD61-PE. Las lneas horizontales muestran la
mediana; los cuadrados los rangos intercuartiles
y las lneas verticales los valores altos y bajos.
Las diferencias entre los grupos se analizaron
mediante la prueba de Kruskall-Wallis.

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Figura 5. Potencial endgeno de trombina (ETP)

en pacientes con LES y controles. La generacin
de trombina se inici sin la adicin exgena de
fosfolpidos ni factor tisular. La diferencia entre
pacientes y controles se analiz con prueba de t
de Mann Whitney.

VOL. 33 N1 2008

embargo, los mecanismos que participan en

el desarrollo de ateroesclerosis prematura
en los pacientes con LES, son mayormente
desconocidos. En la sangre de pacientes
aterosclerticos con angina inestable o
enfermedad coronaria, se han detectado
plaquetas activadas (49, 50), sugiriendo
que la activacin de las plaquetas podra
participar en la aterotrombosis. En
efecto, se ha demostrado que la infusin
de plaquetas activadas exacerba la
formacin de lesiones ateroesclerticas
en ratones deficientes en apolipoprotena
E (51), los cuales desarrollan lesiones AE
prematuras secundarias a la dislipidemia.
Estas observaciones establecieron las
bases para una serie de investigaciones,
especialmente in vitro y en modelos
animales, que demostraran el papel
que juegan las plaquetas en la gnesis y
progresin de la aterosclerosis.

EL PAPEL DE LAS PLAQUETAS EN

LA ATEROESCLEROSIS

Figura 6. Correlacin entre la capacidad de

generar trombina del plasma libre de plaquetas
y las MP totales (A) y aqullas derivadas de
plaquetas (B). El anlisis se hizo mediante
prueba de correlacin por intervalos segn
Spearman.

enfermedad cardiovascular prematura

(45, 46). De hecho, en estos pacientes el
riesgo de presentar infarto de miocardio
es 50 veces mayor que una poblacin
pareada por edad y sexo (47); este mayor
riesgo es slo parcialmente explicado
por factores de riesgo clsicos como
hipertensin, dislipidemia y diabetes (48).
El LES es una enfermedad inflamatoria
crnica y la inflamacin actualmente se
considera que juega un papel fundamental
en la patogenia de la ateroesclerosis. Sin
10

Aparte de sus conocidas funciones en los

procesos de hemostasia y trombosis, las
plaquetas participan directamente en la
patogenia de la aterosclerosis y representan
un punto de unin entre inflamacin y
aterognesis (52, 53).

LA ADHESIN DE LAS
PLAQUETAS AL ENDOTELIO
Evidencia reciente ha demostrado que la
denudacin endotelial no es un requisito
nico para permitir la unin de las
plaquetas a la pared arterial. El endotelio
previene la reactividad de las plaquetas a
travs de mecanismos de inhibicin tales
como la liberacin de prostaciclina, xido
ntrico (NO) y expresin de una ectoADPasa (CD39). Sin embargo, las clulas
endoteliales daadas y/o activadas son
adhesivas para las plaquetas. Estudios
in vitro han demostrado que la unin
de las plaquetas al endotelio activado es

dependiente de la glicoprotena (GP) IIb/

IIIa, utilizando como protenas puente
el fibringeno, fibronectina y FvW (54).
Evidencia adicional ha mostrado tambin
la participacin de receptores de las
clulas endoteliales tales como ICAM-1
y v3. Estudios in vivo demuestran que
bajo condiciones de fuerza de cizalla alta,
las plaquetas son capaces de adherirse
al endotelio intacto en un proceso que
comprende varias etapas. El contacto
inicial laxo entre las plaquetas y las clulas
endoteliales est mediado por selectinas
presentes en ambas clulas. La P-selectina
es rpidamente expresada por las CE
frente a una variedad de estmulos. El
contrarreceptor de la P-selectina en las
plaquetas sera la glicoproteina GPIb-VIX, que posteriormente se complementa
con la PSGL-1. La unin definitiva de las
plaquetas al endotelio se completa por la
interaccin entre protenas adhesivas (por
ej., fibringeno) y la GPIIb/IIIa (Figura 7).

LAS PLAQUETAS UNIDAS AL

ENDOTELIO ESTIMULAN LA
INFLAMACIN
Durante el proceso de adhesin, las
plaquetas se activan y liberan numerosas
sustancias proinflamatorias y mitognicas
al micromedioambiente local. Entre
las ms importantes se destaca a las
protenas adhesivas (fibringeno, FvW,
trombospondina, P-selectina); factores
de crecimiento (PDGF, TGF-, EGF);
quimioquinas (RANTES, FP4); citoquinas
(IL-1, CD40L, -tromboglobulina) y
factores de la coagulacin (Factor V, Factor
XI, PAI) (55). La accin concertada y
regulada de todas estas protenas promueve
una serie de funciones biolgicas tales como
adhesin celular, quimiotaxis, proliferacin
celular, coagulacin y proteolisis. La IL1-
y el marcador CD40L sobre la superficie de
las plaquetas han demostrado ser potentes
activadores de las clulas endoteliales,
promoviendo la expresin de molculas de
adhesin (ICAM-1, v3) y la secrecin

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Figura 7. Adhesin de las plaquetas al endotelio. Las clulas endoteliales activadas expresan p-selectina que constituye un ligando para la GPIb y su
receptor (PSGL-1) presentes sobre la superficie de las plaquetas. La interaccin inicial es posteriormente reforzada en las plaquetas activadas por la
participacin de las integrinas (GPIIb/IIIa y v3).

de MCP-1, que juega un papel clave en

el reclutamiento de monocitos. La accin
conjunta de las quimioquinas liberadas
por las plaquetas, la presencia de plaquetas
activadas y la expresin de molculas de
adhesin sobre las clulas endoteliales, se
traduce finalmente en reclutamiento de
neutrfilos y monocitos sobre la superficie
endotelial, uno de los fenmenos claves en la
iniciacin del proceso ateroesclertico (55).
De acuerdo con las observaciones
anteriores, parece evidente que las
plaquetas son cruciales en la iniciacin,
desarrollo y extensin total de las lesiones
ateroesclerticas. Sin embargo, gran parte
de la evidencia disponible proviene de
estudios in vitro o en modelos animales.
En este sentido, fue importante encontrar
un modelo humano en el que exista dao
vascular y ateroesclerosis acelerada, en
ausencia de factores de riesgo clsico: es
la situacin que se observa en los usuarios
de cocana.

EL USO DE COCANA Y DAO

VASCULAR
Los usuarios crnicos de cocana tienen
un riesgo aumentado de presentar infarto
de miocardio, angina, muerte sbita, y
accidentes cerebrovasculares, as como

defectos regionales de perfusin cerebral.

La patogenia de las lesiones vasculares
isqumicas asociadas al uso crnico de
cocana no se ha dilucidado completamente,
existiendo varios mecanismos posibles,
entre los que destacan: 1) vasoconstriccin
2) aumento del consumo de oxgeno y
3) trombognesis.
Los efectos sobre el tono vasomotor
se relacionan a las propiedades
simpaticomimticas de la cocana; sin
embargo, varios estudios concluyen que
este efecto no explica completamente
la isquemia cerebral y cardaca. En este
sentido, existe evidencia que muestra
que la activacin de la hemostasia y la
trombognesis asociada participan en la
patogenia de estas complicaciones. La
demostracin de activacin de las plaquetas
y la evidencia morfolgica de formacin de
trombos arteriales, apoyan el concepto de
que en el abuso de cocana una activacin
del sistema hemosttico, especialmente de
sus componentes celulares, juega un papel
importante en la isquemia inducida por esta
droga. Prcticamente todos estos trabajos
estudiaron los efectos de la exposicin in
vitro de plaquetas a la droga o a infusin
e.v. aguda en voluntarios sanos y no se
haba abordado el sistema hemosttico en
forma global, considerando sus elementos

celulares, humorales y la interaccin entre

ellos. En esta lnea, en el modelo celular
actual de hemostasia se establece que la
activacin de las plaquetas y la coagulacin
sangunea son procesos interactivos y
dependientes, que determinan en conjunto
la generacin de trombina.

LA TROMBOGNESIS Y
ATEROSCLEROSIS ACELERADA
ASOCIADAS AL USO DE COCANA
Diferentes estudios y casos reportados
han demostrado claramente un aumento
en la formacin de trombos arteriales en
usuarios de cocana (56-58); sin embargo,
los estudios in vitro e in vivo sobre sus
mecanismos han entregado resultados
controvertidos (56, 59-61, 62-64). Minor
y cols. (56) en un estudio en pacientes
con infarto agudo del miocardio asociado
al uso de cocana, encontraron que un
38% presentaba coronarias sanas, pero
en alrededor del 80% haba evidencia
angiogrfica de trombos intracoronarios.
A continuacin, se discute la evidencia
disponible en cuanto al efecto de la cocana
sobre las plaquetas y los vasos sanguneos,
que permite sostener un papel patognico
de la activacin del sistema hemosttico en
la aterotrombosis inducida por cocana.
11

BOLETN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

EL EFECTO DE LA COCANA
SOBRE LAS PLAQUETAS
Uno de los primeros estudios que abord
el problema fue el de Eichhorn y cols. (64)
que demostr que segmentos de aorta
de conejo expuestos in vitro a cocana
presentaban aumento en la produccin
de tromboxano A2, el cual es un potente
agregante plaquetario. La incubacin
directa de las plaquetas in vitro con cocana
ha mostrado resultados muy variados. Se
ha encontrado aumento significativo de la
respuesta plaquetaria a cido araquidnico
(62), ausencia de efecto significativo sobre
su funcin o incluso, inhibicin de la
agregacin a diferentes concentraciones de
ADP y cido araquidnico (59).
La expresin de p-selectina (CD62-P),
protena integral de la membrana de los
grnulos alfa que se trasloca a la superficie
en las plaquetas activadas, se ha utilizado
ms recientemente como marcador del
efecto de la cocana sobre las plaquetas.
Rinder y cols. (61) estudiando voluntarios
sanos, demostraron que slo la exposicin
crnica -pero no la aguda- a cocana
aumentaba significativamente la expresin
de p-selectina sobre la membrana
plaquetaria. Usando una aproximacin
experimental similar, Kugelmass (60)
demostr que la incubacin in vitro de

VOL. 33 N1 2008

plaquetas lavadas con cocana aumentaba

la expresin de p-selectina, el cual no era
inhibible por aspirina. Ms recientemente,
Heesch (65) usando un modelo de
administracin aguda de cocana en
voluntarios sanos, observ un aumento en
la expresin de p-selectina, aumento en
la liberacin de factor plaquetario 4 y tromboglobulina (protenas de grnulos )
y presencia de microagregados de plaquetas
en la circulacin. En esta misma lnea,
Siegel report un aumento en el nmero
de eritrocitos y del factor von Willebrand
despus de exposicin a una dosis nica de
cocana en usuarios crnicos (66). Zurbano
en un modelo en cerdos, demostr
que la exposicin aguda a cocana se
asociaba a un aumento significativo de la
interaccin de las plaquetas con estructuras
subendoteliales (67).
Algunos estudios que sugieren que la
cocana, bajo ciertas condiciones, puede
afectar la funcin de las plaquetas en forma
negativa. En este sentido, Jennings observ
que la cocana produca una inhibicin
de la agregacin plaquetaria inducida por
araquidonato, ADP y colgeno, (68); un
efecto similar fue reportado por Heesch (65).
Por lo tanto, usando diferentes modelos
experimentales y formas de exposicin
a la droga, es evidente que la cocana se

asocia a una activacin de las plaquetas,

especialmente en los estudios de
administracin a droga in vivo. Debido
a la falta de informacin sobre el estado
de activacin de las plaquetas en usuarios
crnicos de cocana, sus mecanismos
de produccin y especialmente su
relacin con los otros componentes del
sistema hemosttico, se inici en nuestro
laboratorio un estudio con el fin de
abordar estos objetivos.
En usuarios crnicos de cocana se observ
un aumento en el nmero de micropartculas
circulantes, de los agregados monocitoplaquetas y de la expresin de p-selectina
plaquetaria (figura 8) (69, 70). El aumento
en la expresin de estos tres marcadores
demuestra activacin de las plaquetas in
vivo, lo cual podra jugar un papel en el
dao vascular prematuro observado en
usuarios de cocana.
Por otra parte, la presencia de plaquetas
activadas en la circulacin no solamente
puede ser importante en la generacin
y progresin del dao vascular sino
tambin en la generacin de un estado
protrombtico (figura 9). Esta condicin de
hipercoagulabilidad es clave en la patogenia
de las complicaciones vasculares propias
de estos pacientes, tales como infarto de
miocardio o defectos de perfusin cerebral

Figura 8. En los pacientes usuarios de cocana se encontr una activacin significativa de las plaquetas circulantes, evidenciada por un aumento de
los agregados monocito-plaquetas (A) y de la p-selectina de superficie (B). Las determinaciones se hicieron mediante citometra de flujo de sangre
perifrica de los pacientes y controles.

12

LA FISIOPATOLOGA DE LA HEMOSTASIA: ALGUNOS ASPECTOS SOBRE LA VIDA Y LA MUERTE DE LAS PLAQUETAS EN LA CIRCULACIN - DR. JAIME PEREIRA G.

Figura 9. Generacin de trombina (ETP) (A) y correlacin con el nmero de MP circulantes (B) en usuarios crnicos de cocana. La generacin de
trombina se inici sin la adicin exgena de fosfolpidos ni factor tisular.

(70). La actividad procoagulante de las

plaquetas ha cobrado gran importancia en
el ltimo tiempo, especialmente a la luz del
nuevo modelo de la hemostasia basado en
clulas (71).

LA RELACIN DE LAS
PLAQUETAS CON EL SISTEMA DE
LA COAGULACIN: UN NUEVO
MODELO DE HEMOSTASIA
CELULAR
La activacin de las plaquetas y la
coagulacin sangunea son dos procesos
interactivos y mutuamente dependientes,
que determinan en conjunto la generacin
de trombina (72). La conexin entre las
plaquetas y el sistema de la coagulacin es
multifactica y necesaria para lograr una
formacin eficiente del trombo. Basado
en el anlisis de reacciones individuales
en cascada de la coagulacin, se ha
estimado que las plaquetas aceleran la
generacin de trombina en 5 a 6 rdenes
de magnitud (73, 74). De los mltiples
mecanismos propuestos para explicar el
efecto de las plaquetas en la formacin de
trombina (75-82), analizaremos en mayor
detalle el posible papel de la sntesis y
expresin de factor tisular por parte de las
plaquetas activadas (83-87).

LA SNTESIS Y EXPRESIN
DEL FACTOR TISULAR (FT) EN
PLAQUETAS ACTIVADAS
La funcin mejor conocida del FT es la
de iniciacin de la coagulacin. El FT une
factor VII/VIIa y el complejo FT-VIIa
activa los factores X y IX. El FT expresa su
actividad procoagulante mxima cuando
est incorporado a membrana fosfolipdicas.
La presencia de FT circulante funcional
ha sido motivo de mucha controversia.
Algunos autores consideran que el FT
circulante es insuficiente para generar
un tapn hemosttico oportunamente
y que la coagulacin debe ser gatillada
por el FT de la pared vascular (88). Sin
embargo, varios estudios han descrito la
existencia de un FT circulante asociado a
clulas o micropartculas, capaz de iniciar
la coagulacin sangunea (89-93). Los
monocitos constituyen una fuente mayor
de FT, demostrado en experimentos de
activacin con lipopolisacrido y por el
papel que juegan en la patogenia de la
coagulacin intravascular en la sepsis. (94,
95). Las plaquetas aparentemente exportan
FT preformado desde los grnulos alfa a
la membrana plasmtica (96). El origen y
funcionalidad del FT no est por completo
dilucidado, existiendo reportes que
muestran que es transferido a las plaquetas

por micropartculas de monocitos (97), en

contraste con otros que muestran que el
FT es transferido por las plaquetas a los
monocitos (98). En resumen, el origen
y localizacin del FT circulante ha sido
origen de controversia.
Al estudiar el defecto hemosttico en la
uremia, observamos que las plaquetas
humanas expresaban FT y que ste pareca
ser funcionalmente activo. De ser esto cierto,
el modelo actual de la hemostasia celular
debera necesariamente ser redefinido. De
acuerdo con esto, se disearon estudios
con el fin de probar la hiptesis que las
plaquetas humanas sintetizan FT de novo.
Primero, se detect mARN de FT en
las plaquetas humanas, el cual aument
despus de activarlas, lo que confirm dos
observaciones recientes (85, 99),(Figura
10). Este fenmeno se ha explicado
por la existencia de pre-mARN que
sujeto a seales tipo afuera-adentro
se transforma en mARN maduro (100).
Las plaquetas en reposo exhiben una
actividad procoagulante muy baja, la cual
aumenta alrededor de 3 veces despus de
la activacin, lo que demuestra que este FT
es funcional. (Figura 10). Con la marcacin
metablica de las plaquetas con 35Smetionina se observ que la activacin de
13

BOLETN ESCUELA DE MEDICINA U.C., PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE CHILE

VOL. 33 N1 2008

Figura 10. mARN de factor tisular en plaquetas humanas. RNA de plaquetas se extrajo antes y despus de estimular con 5M de TRAP por 15 minutos. En A, amplificacin de los transcritos de RNA en plaquetas. En este experimento se detect mRNA de FT slo despus de la estimulacin de las
plaquetas (lnea 6). En B se muestra la actividad procoagulante de las plaquetas (PCA) despus de la estimulacin con TRAP. Las plaquetas en reposo
y activadas, se incubaron con FX y FVIIa, la generacin de FXa se determin mediante sustrato cromognico. Se observa ausencia de efecto de la
puromicina (inhibidor de la traduccin).

las plaquetas se acompa de sntesis de

novo de factor tisular (figura 11). La sntesis
de protenas por las plaquetas anucleadas
fue sugerida desde hace dos dcadas (101),
pero slo recientemente se document la
sntesis de novo de Bcl-3, interleuquina-1
y PAI-1 (102-104).

Figura 11. Plaquetas con o sin pretratamiento con

puromicina se incubaron con [35S]-metionina,
y se activaron con TRAP. Las membranas de
las plaquetas se inmunoprecipitaron con un
anticuerpo anti-FT policlonal. Se observa
un aumento significativo de la banda de FT
despus de activar las plaquetas (lnea 3), la
cual es reducida por la puromicina (lnea 4).

El paradigma actual del sistema

hemosttico basado en clulas asigna a las
plaquetas un papel central en el ensamblaje
14

de los complejos de la coagulacin sobre su

membrana, pero le demanda una fuente
adicional de FT tisular para gatillar las
reacciones (81). Las plaquetas humanas,
como clulas sintetizadoras de FT, podran
constituir estas clulas portadoras de FT
asegurando la localizacin del FT en el
lugar correcto y en el momento apropiado.
Esta exposicin rpida, localizacin
espacial precisa y depsito progresivo
y ordenado de FT sobre la membrana
plaquetaria, configura un modelo ms
racional para explicar los mecanismos
hemostticos en salud y enfermedad (figura
12). Este concepto resalta el papel nico de
las plaquetas para unificar la hemostasia
primaria y secundaria, enfatizando la
autosuficiencia de los componentes
intravasculares para satisfacer todas
las necesidades hemostticas (87). Por
otra parte, esta nueva concepcin de la
hemostasia podra ampliar las posibilidades
de estudio en enfermedades hemorrgicas
y trombticas, en las que en alrededor del
50% de los casos no es posible demostrar
alteraciones de laboratorio con las pruebas
actualmente disponibles (105).

AGRADECIMIENTOS
A Diego Mezzano, mentor, colaborador y
amigo, que me contagi su vocacin por
la investigacin. A los estudiantes Ivn
Palomo, Mnica Soto, Lindi Marie Cotzee
y Gino Alfaro que con sus trabajos de tesis
generaron muchos de los datos mostrados.
A Isabel Pizarro, Patricia Hidalgo, Eduardo
Aranda, bioqumicos y tecnlogos mdicos
del Laboratorio de Hemostasia.

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Figura 12. Nuevo modelo de la hemostasia basado en clulas. Se propone que la TF bearing cell presente en el subendotelio es fundamental en
el inicio de la hemostasia. Sin embargo, el crecimiento y progresin del proceso hemosttico, depende de la expresin de FT sobre la superficie de
las plaquetas activadas. De esta forma, el proceso modulado en la generacin de trombina y el depsito de fibrina sobre la membrana plaquetaria,
semejante a la accin de cemento sobre los ladrillos, podra construir un tapn hemosttico o un trombo.

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