De una manera sencilla, en este capitulo, describimos algunos tipos de microscopios, los

cuales asumen propiedades bien definidas, segn sus caractersticas individuales.

Rutinariamente se utilizan diferentes tipos de microscopa ptica para estudiar varios
aspectos de la estructura celular.
Estos microscopios no son muy distintos del Microscopio Compuesto que ya
conocemos; la diferencia radica en que cada uno de ellos posee aditamentos especiales
que, segn el tipo de microscopio, lo especializa para cumplir una funcin en particular.
A continuacin mencionaremos algunos de ellos.
- Microscopio de Campo Oscuro
- Microscopio de Contraste de Fases
- Microscopio de Polarizacin.
- Microscopio de Fluorescencia
- Microscopa Focal
- Microscopa de excitacin por dos fotones
- Microscopio Electrnico
1. MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO O ULTRAMICROSCOPIO:
Estos microscopios se especializan en la observacin de microorganismos y estructuras
celulares que resultan totalmente invisibles cuando son observados con los microscopios
ordinarios; pero que por contraste del medio que los rodea, se hacen visibles. (Efecto
Tyndall).
Se denomina de campo oscuro por la forma de iluminacin que emplea y
ultramicroscopio por su poder de resolucin incrementado. Consiste en un microscopio
comn en el cual el condensador normal es reemplazado por un condensador parablico,
paraboloide o cardioide.
En el condensador Paraboloide, los rayos de luz llegan perpendiculares a su cara inferior
y se reflejan en las caras de un espejo parablico, donde se renen en un solo foco; justo
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en el rea en que se coloca el objeto a examinar. Una lmpara opaca bloquea los rayos
centrales.
El condensador Cardioide posee, en su parte central, una pieza semi esfrica de cristal
plateada y pintada de negro en su parte superior. De este modo. Los rayos luminosos se
reflejan en la cara plateada y, despus de una segunda reflexin en las paredes exteriores
el condensador, se enfoca sobre la preparacin Este condensador suministra un cono
hueco mejor concentrado que el paraboloide.
a).- paraboloide

b).- cardioide

Con el microscopio de campo oscuro pueden descubrirse, pero no resolverse, estructuras

ms pequeas que las que se visualizan con el microscopio ptico comn.
Por esto se requiere cortes muy delgados o que las sustancias estn en suspensin. En
histologa se utiliza a menudo el campo oscuro para el anlisis de preparados
radioautogrficos
Tiene la mayor aplicacin en el campo de la bacteriologa, en especial en el diagnstico
y determinacin de la espiroqueta de la sfilis, el Treponema Pallidum, que
comnmente se denomina examen de campo oscuro.
2. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE O INTERFERENCIA:
1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia.1932 Zernike
inventa el microscopio de contraste de fases.
Este microscopio altera la velocidad de la luz, produciendo una demora o retardo que se
denomina cambio de fase. Al salir del medio la velocidad de la luz se restablece, pero el
retardo subsiste. Los cambios de fase de la luz producen cambios de amplitud y brillo.
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Plano de la imagen

O
B
J
E
T
I
V
O

DISCO DE ZERNIKE

Plano focal posterior

del objetivo
Haz difractado
Haz no difractado
C
O
N
D
E
N
S
A
D
O
R

MUESTRA

Haz luminoso

DIAFRAGMA ANULAR

Cuando
se interpone un objeto transparente y absorbente se produce un retardo, pero tambin una
disminucin de la amplitud (brillo) que el ojo humano distingue con ms claridad.
Los objetos observados por este mtodo presentan un claro contraste sobre sus alrededores.
El brillo de las imgenes es superior al que se obtiene con iluminacin de campo oscuro y
los detalles internos de las clulas vivas se ponen de manifiesto notoriamente.

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Se Aplica al estudio de los seres vivos, transparentes y no coloreados, en el estudio de los

fenmenos vitales., como reproduccin celular, etc., a los que se que no se los puede teir
porque se los mata o altera en su estructura.
Este microscopio presenta un diafragma anular que proyecta un cono luminoso, que al
pasar por la muestra origina dos haces de luz, uno que no sufre desvo y otro que al atravesar
la muestra se refracta respecto al primero.
Mediante una placa de retardo de fase o disco de Zernike, (situada entre el objetivo y
ocular) es retardada ms an. Luego ambos grupos de ondas se recombinan, interfirindose
entre si. Esto hace que los pequeos cambios de fase que producen las estructuras celulares,
se transformen en cambios de amplitud, brillo.
3.- MICROSCOPIO DE POLARIZACIN:
ocular
ANALIZADOR
Cubo
fluoresc
ente

Filtro emisor
Espejo dicroico
Filtro
excitador

Lmpara de
mercurio
colector

Prisma
analizador

Objetivo

MUESTRA

condensador
Prisma
polarizador

Lmpara de
halgeno

espejo
Lente colectora

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1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada. Este microscopio se emplea
para determinar si los objetos son mano o birrefringentes.
Es similar al microscopio corriente, con la diferencia que posee dos prismas de Nicol.
Uno situado debajo del condensador llamado prisma polarizado, y otro prisma analizador
situado encima del objetivo.
Cuando se observa una estructura monorrefringente, el campo microscpico permanece
oscuro, si es birrefringente la luz se restablece.
Esto se explica porque las estructuras birrefringentes producen un rayo extraordinario
polarizado que es captado por los prismas de Nicol, iluminando el campo.
El rayo ordinario que se produce por las estructuras monorrefringentes es desvado por los
prismas y en consecuencia no es empleado por el ocular.
Este microscopio en particular; es empleado en Histologa para observar las bandas claras y
oscuras del msculo estriado por sus propiedades de mono y birrefringencia; adems del
estudio de la matriz cartilaginosa.
4.- MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA:
1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia Se basa en el
fenmeno de la fluorescencia descrito en captulos anteriores.
Este microscopio presenta una fuente luminosa especial que emite rayos ultravioleta y azul
violeta del espectro luminoso. Dicha fuente luminosa produce elevadas temperaturas, razn
por la que requiere un sistema especial de ventilacin.
Estos rayos no son visibles ante nuestros ojos, por lo que tambin posee una cmara
fotogrfica acoplada, la que se encargar de registrar la imagen.

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Presenta, adems, un condensador de cuarzo en vez del condensador ordinario. Tambin

un espejo de superficie aluminizada, puesto que la plata refleja con menor eficacia la
radiacin ultravioleta y un filtro de absorcin situado entre el objetivo y el ojo del
observador para evitar daar la retina.

La microscopa de fluorescencia se utiliza extensamente y es un mtodo muy sensible

para el estudio de la distribucin intracelular de las molculas. Se utiliza una tincin
fluorescente para marcar las molculas que interesan tanto en clulas fijadas o vivas.
Las protenas de clulas vivas pueden visualizarse mediante el uso de la protena verde
fluorescente (PVF) de las medusas que es capaz de fusionarse con una gran variedad de
protenas.
La tincin fluorescente es una molcula que absorbe la luz a una longitud de onda y
emite la iluminacin de la muestra con una longitud de onda que excita al tinte
fluorescente.
La microscopa fluorescente se puede utilizar para estudiar una gran variedad de
molculas dentro de las clulas. Una de las aplicaciones ms frecuentes es la
sealizacin de anticuerpos con tintes fluorescentes dirigidos. Presenta su mayor
aplicacin en la inmunologa, denominndose corrientemente microscopio de
inmunofluorescencia. En 1941 Coombs usa anticuerpos acoplados a tintes
fluorescentes para estudiar antgenos celulares.
5.- MICROSCOPA FOCAL .- Combina la microscopa fluorescente con el anlisis
electrnico de la imagen para obtener imgenes tridimensionales.
Un pequeo punto de luz, normalmente producido por un lser, se enfoca en la muestra a
una profundidad determinada. La luz fluorescente se recoge utilizando un detector, como
una video cmara.
Solamente la luz emitida desde el plano de enfoque es capaz de alcanzar el detector. El
barrido a lo largo de la muestra genera una imagen en dos dimensiones, una imagen

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mucho ms detallada que la obtenida con la microscopa fluorescente habitual. Adems,

es posible fundir una serie de imgenes obtenidas a distintas profundidades para
reconstruir una imagen tridimensional de la muestra.

6.- MICROSCOPA DE EXITACIN POR DOS FOTONES.- Es una alternativa a la

microscopa tridimensional que tambin puede aplicarse a las clulas vivas. La muestra se
ilumina con una luz de una longitud de onda tal que la excitacin del tinte fluorescente
requiere la absorcin simultnea de dos fotones.
Esta potente excitacin automticamente proporciona una solucin tridimensional, la
localizacin de la excitacin reduce el dao de la muestra, permitiendo imgenes
tridimensionales de clulas vivas.

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7. MICROSCOPIO ELECTRNICO: (M/E).

Desarrollado para lograr mayor poder de resolucin e incremento del aumento, el
microscopio Electrnico ha sido el instrumento gracias al cual se produjeron los
descubrimientos ms importantes del siglo pasado.
La utilidad del microscopio fotnico est limitada por la longitud de onda de la luz
visible, de alrededor de 500nm; mientras que este microscopio la reemplaza por un haz
de electrones de longitud de onda del orden de 0.005nm.
Actualmente se dispone de tres variedades de ellos:
a).- Microscopio electrnico de transmisin o convencional (MET).
b).- Microscopio electrnico de barrido, rastreador o scanning. (MEB).
c).-Microscopio de Tnel de Barrido (MTB)
Caractersticas.- El microscopio Electrnico se basa en la propiedad que tienen los
electrones de ser desviados por campos electromagnticos en la misma forma que un
rayo de luz es refractado por una lente.
En lugar de las lentes se emplean campos electromagnticos que se denominan lentes
electromagnticas, que son bobinas que presentan un orificio ventral de unos 30 a 50
micrmetros, por donde pasan los electrones. Los electrones presentan propiedades
similares a la luz, manifestando un carcter vibratorio y corpuscular.
Las lentes electromagnticas son:
- Condensador magntico, (corresponde al condensador).
- -Objetivo magntico, (corresponde al objetivo).
- Proyectora de imagen intermedia, (corresponde al ocular).
As como el microscopio comn presenta una parte mecnica y otra ptica el
microscopio electrnico presenta una unidad de consola y otra de potencia.
La unidad de consola corresponde a los soportes, mandos de control, bomba de vaco,
etc., representando la parte mecnica del microscopio comn.
La unidad de potencia suministra la tensin elctrica para el funcionamiento de las
bobinas, representando la parte ptica del microscopio fotnico.

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Si comparamos ambos tipos de microscopios, tanto al microscopio de Luz, (M.L), como al

microscopio Electrnico, (M.E.); podramos encontrar las siguientes diferencias:

Microscopio electrnico de transmisin o convencional (MET).Fue el primero en desarrollarse, construido en 1931 por KNOLL y RUSKA.
Este microscopio es un tubo de rayos catdicos, en el cul el ctodo filamentoso es de
tungsteno (en forma de V), que calentado electrnicamente, emite electrones que son
acelerados hacia el nodo, gracias a una diferencia de potencial de 50 a 100 kV. (kilo
voltios). El nodo tiene la forma de una placa metlica con un orificio central
denominado "apertura", a travs del cual pasan algunos de los electrones que son
reunidos por el condensador magntico en el plano del objeto y la lente del objetivo
magntico forma la imagen.

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El campo electromagntico ejercido por esta lente agranda la imagen adicionalmente

por la lente de proyeccin que proyecta la imagen sobre una pantalla fluorescente o en
una placa fotogrfica para hacerla visible y para obtener micrografas electrnicas. Se
llega a obtener un milln de aumentos directos y ampliando las fonografas se llega
hasta 10 millones de aumentos.
Todo el sistema del microscopio Electrnico debe estar al vaco ya que los electrones se
desvan al chocar con las molculas de aire. La imagen sobre la pantalla se forma por la
dispersin de los electrones, como "imagen en sombra".

Como los electrones tienen muy poca capacidad de penetracin, se requiere que la
muestra de estudio sea muy delgada (40 80 manmetros) requiriendo una tcnica
especial para su preparacin.
Actualmente para lograr mayor capacidad de penetracin se est trabajando con
potenciales de aceleracin de 500 a 3.000 kv, requiriendo blindajes especiales para el
observador, pero se pueden estudiar cortes empleados para el microscopio comn
Microscopio electrnico de barrido, rastreador o scanning (MEB).Es un invento reciente que no requiere que los electrones atraviesen la muestra.
La imagen obtenida tiene el aspecto de un cuadro tridimensional que se forma
indirectamente a travs de la captacin puntual de detalles en la superficie del
preparado. Este se cubre de una delgada capa de un metal pesado y se bombardea con
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un haz de electrones primarios muy estrecho que "barre" y desplaza sobre la muestra
copindola. (bobina deflectora).
Los electrones primarios, al igual que el microscopio electrnico de transmisin, son
originados por un ctodo.
Desde cada punto del objeto se emiten electrones secundarios, de tal modo que la
intensidad de cada uno vara segn el ngulo que toman sobre la muestra y las
irregularidades de su contorno y superficie.
La emisin secundaria se mide con un detector ubicado cerca de la preparacin y
adaptado a una pantalla de televisin donde se registra.(Fig. 6).

El MEB forma la imagen de la superficie de la muestra por lo que no es necesario

utilizar cortes ultra finos, dado que el haz de electrones no atraviesa el preparado. Su
poder de resolucin es de alrededor de 10 nm; pero su poder de profundidad de foco o
penetracin es de 10 veces la que se obtiene con el microscopio ptico.
Microscopio de Tnel de Barrido (MTB).Por medio este instrumento es posible, entre otros adelantos, captar la estructura de la
superficie de un preparado hasta el nivel atmico.
El principio se basa en colocar una sonda muy delgada a una distancia de hasta 1 nm por
debajo de la preparacin. Se aplica luego un contacto elctrico en el extremo de la sonda
que al mismo tiempo "barre" con la superficie de la muestra crendose un tnel de
electrones a travs de la hendidura formada entre el preparado y la sonda

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Mientras esta se desplaza sobre la muestra se mantiene constante la corriente, debido al

movimiento automtico de la sonda hacia arriba y abajo por las irregularidades de la
muestra. La informacin obtenida durante estos movimientos se registra en una
computadora que permite obtener una imagen de hasta dos hebras de molculas de DNA

MANEJO Y CUIDADOS DEL MICROSCOPIO DE LUZ

Para emplear un microscopio en el estudio de la Histologa y de todas aquellas ramas de la
ciencia relacionadas a l; el observador deber seguir, en primera instancia y con atencin,
cada uno de las instrucciones que aqu se recomiendan.
1.- Como primer paso para poder manejar correctamente el microscopio, este deber
permanecer fijo en un mesn de trabajo, preferentemente oscuro para evitar la reflexin de
la luz; y el cual ser estable para prevenir las vibraciones sobre l.
2.-El microscopio estar situado a una
altura adecuada para el observador, el que debe
encontrarse cmodamente sentado frente al
instrumento.
3.- Se procede, luego, a iluminar el
campo microscpico, ya sea a travs de luz
natural, empleando para ello cualquiera de las
caras del espejo, segn la cantidad de luz
existente en el ambiente, o por lmparas
incorporadas al microscopio. Muchas veces se

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puede ascender el condensador si la luz no es

suficiente.
4.-Una vez obtenida una buena iluminacin, donde el campo microscpico se tornar
brillante, inmediatamente se coloca la preparacin No debemos olvidar situar la muestra
sobre el orificio central de la platina y sostenerla cuidadosamente con las pinzas de sujecin.
5.- El cubreobjetos siempre debe situarse hacia arriba, de otro modo el enfoque se
har ms dificultoso o inclusive se puede daar la preparacin.
6.- Inmediatamente procedemos a separar la platina de los objetivos, ya sea por
ascenso del tubo o descenso de la platina, segn sea el modelo del microscopio.

7.-Colocar
los
objetivos
del
microscopio en orden progresivo de aumento.
Posteriormente se coloca el primer aumento
en "eje ptico. Girando siempre el revolver
porta- objetivos de izquierda a derecha,
producindose, entonces, un ligero chasquido.

8.-Luego mirando lateralmente tanto el objetivo como la lmina histolgica, se acerca

la platina hacia el objetivo hasta que estn a menos de 2mm. , evitando que la lente frontal
del objetivo roce sobre el cubreobjetos. Estas no pueden tocarse de ninguna manera, puesto
que de hacerlo se corre el riesgo de lesionar tanto la preparacin como la lente frontal del
objetivo.

9.- Una vez realizado este movimiento

se observa por el ocular y por medio del
tornillo Macromtrico lentamente se separa la
platina de los objetivos hasta encontrar una
buena imagen que luego se afina empleando
el tornillo Micromtrico.

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10.- Si se requiere potencia superior en el microscopio se procede al uso de un

mayor aumento, para lo cual debemos separa la platina de los objetivos, ya que estos se
hacen ms largos cuanto mayor aumento poseen.
Los objetivos no deben por ningn motivo, desmontarse en sus diferente piezas.
11.- Cuando no se logra la imagen, no debemos acercar la platina hacia los objetivos
mirando por el ocular ya que se puede mover ms de lo debido, rompiendo la lente y la
lmina histolgica, accidente muy frecuente; pero que pone en riesgo la integridad de la
muestra.
12.- Una vez terminada la observacin, el microscopio siempre debe guardarse
cubierto con un lienzo oscuro para evitar la acumulacin de polvo sobre sus partes. Nunca
limpiar las lentes con Xilol, porque puede desprenderlas y dejar un residuo grasoso en su
superficie.
NOTA.- El microscopio es un instrumento noble y delicado, por lo que todos los
cuidados y recomendaciones arriba expuestas no deben pasarse por alto. Nos brinda la
oportunidad de descubrir un mundo nuevo y fascinante, adems de despertar en nosotros
inquietudes y deseos de ampliar nuestros conocimientos.
BIBLIOGRAFA
"OPTICA, INSTRUMENTOS PTICOSY MICROSCOPA"
segunda Edicin

DR. RENE BOTHELO PERPICH

"HISTOLOGA HUMANA NORMAL"

(TOMO I)

DR. FERMIN HUMBOLDT B.

"TEORA Y PRCTICA DEL MICROSCOPIO"

J. AGUILAR PERIS

"EL MICROSCOPIO, GUA TERICO- PRCTICA"

Coleccin cuadernos de Biologa

F. JAVIER CERD

"HISTOLOGA" Tercera edicin

Editorial Mdica Panamericana

FINN GENESER

"HISTOLOGA TEXTO Y ATLAS"

L. P. GARTNER, J. L. HAIATT

"HISTOLOGA"

SOBOTTA

"HISTOLOGA"

ROSS, ROMRELL KAYE

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