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Examen
Bactriologique des
Aliments
Auto-Contrle par les Professionnels

TD ENVT HIDAOA - Hubert Brugre, Denis Corpet

MJ partielle janv 2013

Cadre rglementaire

Abrogation

de larrt du 21 dcembre 1979

relatif aux critres microbiologiques auxquels doivent satisfaire

certaines denres dorigine animale.

Rglement

CE 2073/2005 de la Commission

Europenne Critres microbiologiques applicables aux denres

alimentaires.
Un des rglement du Paquet Hygine,
Applicable depuis le 1er janvier 2006.

On est pass d'un cadre strict, contraignant mais scurisant, avec des
critres microbiologique imposs
A une "responsabilisation" moins confortable ! Consquence frquente
= augmentation du nombre d'analyses microbiologiques !

Un peu de recherche prospective: Comment dcider

"combien de bactries sont acceptables, combien sont "trop" ?"

FSO/ALOP based food safety policy

FSO = Food Safety Objective
ALOP = Appropriate Level of Protection
Objectif de Scurit de l'Aliment (FSO) =
Frquence (ou concentration) d'un danger,
dans l'aliment consomm, qui donne
le niveau appropri de protection (ALOP).
Exemple hypothtique de FSO:
le niveau de Listeria monocytogenes dans un aliment prt l'emploi
ne doit pas dpasser 3 Log CFU/portion (=1000 bactries)

Comment tablit-on les FSO partir des ALOP ?

De ALOP FSO
La thorie

Donc ALOP = 10-6

3- On en dduit qu'on
Veut moins de 3.5 log
Du pathogne par repas

Log Proba (Cas de TIAC / Repas)

1- On construit la courbe
observe entre les cas
pidmiques et la
contamination des repas
(bcp d'incertitudes !!)
2- Choisir ALOP: par ex.
on dcide qu'on veut
Un "cas" malade pour
Un million de repas

-2

FSO = 3.5 log CFU

4- Marge de scurit: On
met le critre de scurit
plus bas que le FSO,
par ex < 100 CFU du pathogne

Epidmies relles observes

-3

-4

-5

ALOP

-6

-7
2

FSO

Log (Nb CFU pathognes) / Repas

FSO, Food safety objective
ALOP, Appropriate level of protection

Probabilit dinfection

Loi dose-rponse exprimentale:

plusieurs courbes en pratique !

Dose (exposition un nombre de bactries)

The application of the Appropriate Level of

Protection (ALOP) and Food Safety
Objective (FSO) concepts in food safety
management, using Listeria monocytogenes
in deli meats as a case study


Gkogka et al. Food Control

February 2013 - Predictive Modelling of Food

Quality and Safety. 29 (2), 382393.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095671351200182X#

1 Pour contribuer la protection de la sant publique et viter

les interprtations diffrentes, il convient de dfinir des critres
de scurit harmoniss relatifs lacceptabilit des denres
alimentaires.

critres de scurit des denres alimentaires



2 Les critres microbiologiques fournissent galement une

orientation sur l'acceptabilit des denres alimentaires et de
leurs procds de fabrication, de manutention et de
distribution. Lutilisation de ces critres devrait faire partie
intgrante de la mise en oeuvre des procdures fondes sur les
principes HACCP et les autres mesures de contrle de
l'hygine.

critres dhygine des procds

1 critres de scurit des denres alimentaires

E. sakasakii : Quatre
prmaturs infects
en 2004 par le mme
lait en poudre

Scurit = Pas de microbe pathogne

ont t retenus:
- Listeria monocytogenes
- Salmonelles
- Entrotoxine de Staph. aureus
- Histamine (poissons)
- Enterobacter sakasakii (actualit, lait poudre)
- On ne cherche ni E.coli, ni virus (Norovirus,
hpatite A), car on n'a pas de mthode fiable

2 critres dhygine des procds

Hygine procds = il ne faut pas "trop" de bactries banales
pas "trop" de contaminants "tmoins" (d'origine fcale)

Critre scurit // Critre hygine

Anarobies sulfito-rducteurs

K2

Dnombrement: ralisation
Prlvement strile, transport au froid
 Prparation des 5 chantillons:


Aliment

solide, broy dans un liquide strile

Ralisation de dilutions dcimales (1 dans 9)

K3

Dnombrement en milieu liquide



Pour chaque srie de culture issue de la mme dilution

on compte le nombre de tubes positifs (3 sries
identiques)
On compose le nombre caractristique,
et la lecture de la table de Mac Grady nous donne
le Nombre le Plus Probable: NPP.
Avantages:

Mise en vidence dun caractre particulier

Phase de ranimation, enrichissement tout fait pour suite

Inconvnients:

Manque de prcision (variabilit de 1 log)

Lourde mettre en oeuvre

Source: ENSTA TD microbio

Table de
Mac Grady
pour 3 tubes
par dilution

Dnombrement sur milieu solide

Une bactrie, place sur un milieu favorable, donnera

naissance une colonie macroscopiquement visible.
UFC = Unit formant colonie
Etalement en surface ou en profondeur

Avantages:

Plus facile mettre en uvre

Plus prcise (variabilit de 0.5 log)
Mthode disolement

Inconvnients:

Mthodes de revivification parfois ncessaire

Source: ENSTA TD microbio

Petrifilm

Ptrifilms ou boites de Ptri: quelles dilutions compter ?

Comment calculer les UFC = nombre de bactries par g ou par ml ?
Comment exprimer le rsultat ?

Micro-organismes dnombrs ou recherchs

dans les analyses de routine => on va les voir plus en dtail

Entrobactries

Coliformes Fcaux
E. coli

Salmonella spp.

Coliformes Totaux

Flore Arobie
Msophile Totale

Staphylocoques
coagulase +

Anarobies
sulfitorducteurs

Milieux de culture
Quy a-t-il dans un milieu de culture ?

N.S.

Flore arobie msophile totale =

FAMT = Microorganismes Totaux


Ensemble des germes capables de se dvelopper sur un

milieu nutritif 30C en arobiose.

Milieu ordinaire : glose pour dnombrement ou PCA,

contenant peptone, glucose, extrait de levure.

Indicateur dhygine gnrale, valuation de laltration

microbienne des denres

Attention flore technologique

Recherche de flores plus slectives pour certains

produits

Milieux de culture slectifs

Entrobactries

Glose au cristal violet, rouge neutre,

bile, glucose (VRBG) ou lactose (VRBL)

Coliformes

Glose dsoxychlolate lactose

Bouillon lactos bili au vert brillant

E. coli

BLBVB ou le bouillon de Mac Conkey

Milieux de culture slectifs:

inhibent la croissance de certains micro-organismes
rvlent la croissance de ceux qui sont recherchs
VRBL

Hetkoen

Entrobactries


Bacilles droits, Gram-, aro-anarobie

Rduction des nitrates en nitrites
Fermentation du glucose
Oxydase ngatif

Nombreuses espces = htes normaux du tube

digestif des animaux
Bactries fcales frquemment des
contaminants alimentaires dorigine fcale
Certaines espces sont pathognes: lesquelles ?

Coliformes


Coliformes (df. ISO) (qui a la forme de E.coli) :

Bacilles Gram-, non sporuls, aro-anarobies,
capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et
en fermentant le lactose avec production dacide et de
gaz 37C.

Coliformes thermotolrants ou fcaux: df. Idem 44C

E.coli prsums : Coliformes thrmotolrants +

production dindole partir du typtophane.

E.coli : E.coli prsums + RM (rouge de mthyle)

positifs, VP (Voges-Proskauer) ngatif, Citrate ngatif

Indicateurs de
contamination
dorigine fcale
Un indicateur doit:

toujours

tre prsent lorsque

les micro-organismes pathognes sont prsents

apparatre

en plus grand nombre que les agents

pathognes associs

avoir

le mme comportement que les agents

pathognes dans lenvironnement naturel et au cours
des procds de fabrication

doit

tre mis en vidence, dnombr et identifi

laide de techniques simples.

Indicateurs de contamination
dorigine fcale






Coliformes totaux / fcaux (44C) / E. coli

Dveloppement de nouveaux milieux
chromognes spcifiques de E. coli
gnralisation de cet indicateur qui est un des
plus sensibles et le plus spcifique
Entrobactries et coliformes totaux renseignent
sur la matrise de lhygine gnrale
Streptocoques fcaux,
plus rsistants dans le milieu,
indicateurs du futur ?

Anarobies
sulfito-rducteurs


Clostridium:

htes

normaux de lintestin

Tellurique

Dans les matires en putrfaction



Dnombrement sur
Tryptone Sulfite Cyclosrine
Indicateur dhygine gnrale
Prsomption de la prsence de
Clostridium perfringens

Staphylocoques coagulase +


S. aureus est la fois:

Germe

pathogne car peut scrter une toxine

Indicateur dhygine




Dnombrement sur glose de Baird-Parker (dia suiv)

Vrifier lactivit coagulase +
Si ncessaire,
recherche entrotoxines staphylococciques =
critre de scurit pour les produits laitiers

Staphylococcus aureus sur glose

Baird-Parker (jaune duf + tellurite)
colonies
de staph.
noires,
entours
dun halo
+ prcipit

Salmonella spp.




Dangereux par simple prsence

Principale source : origine fcale, contamination croise
Recherche:

Pr-enrichissement
Enrichissement sur bouillon au slnite ou au trathionate
Isolement sur glose au vert brillant et rouge de phnol et une
autre glose ventuellement.
J+3 : suspicion de prsence de Salmonelles
J+4 : confirmation ou non par la galerie API

Critres de scurit des denres

alimentaires


critre dfinissant lacceptabilit dun produit

ou dun lot de denres alimentaires, applicable aux
produits mis sur le march
Les rsultats des analyses :

rvlent

la qualit microbiologique du lot contrl.

peuvent aussi tre utiliss pour dmontrer lefficacit
de lapplication du systme HACCP ou des bonnes
pratiques dhygine dans le cadre du procd.

Critre microbiologique pour un aliment

Elments pris en compte


Un critre microbiologique permet de

s'assurer qu'un aliment est acceptable
compte tenu du nombre de bactries prsents.
Il se compose des lments suivants:








Microorganismes /toxines indsirables

Mthodes d'analyse pour les dtecter / les quantifier
Plan dchantillonnage (Nb prlevts, taille chantillon)
Limites microbiologiques juges appropries l'aliment
Nombre d'units qui doivent tre conformes aux limites.
Un critre microbiologique doit galement stipuler l'aliment
et le stade de la chane auxquels il s'applique, et les
mesures prendre lorsqu'il n'est pas satisfait.

Source FAO: http://www.fao.org/docrep/w6419f/w6419f05.htm

K7
Catgorie de
denres
alimentaires

Microorganismes
/ toxines,
mtabolites

Plans
d'chantillonnage1

Limites2

Mthode
d'analyse
de
rfrence3

Stade
d'application du
critre

1.4 Viande
hache et prpa
de viande
destines tre
consom. crues

Salmonella

Absence
dans 25 g

EN/ISO 6579

Produits mis
sur le march
pendant leur
dure de
conservation

1.5 Viande
hache et
prparations de
vde de volailles
destines tre
consom. cuites

Salmonella

2006
Absence
dans 10 g

EN/ISO 6579

Produits mis
sur le march
pendant leur
dure de
conservation

partir de
2010
Absence
dans 25 g

Plan dinterprtation 2 classes :

satisfaisante / insatisfaisante
Si non satisfaisant, aliment NON commercialis, et mme RAPPEL si dj mis en vente

Critres dhygine des

procds


critre indiquant lacceptabilit du fonctionnement du procd

de production. Un tel critre nest pas applicable aux produits mis
sur le march. Il fixe une valeur indicative de contamination dont le
dpassement exige des mesures correctives destines
maintenir l'hygine du procd conformment la lgislation
sur les denres alimentaires.

Viandes et produits base de viande

Lait et produits laitiers
Ovoproduits
Produits de la pche
Lgumes, fruits et produits base de lgumes et de fruits

Interprter un Plan trois classes

pour tester lhygine des procds



Une troisime classe acceptable se glisse

entre satisfaisant et non satisfaisant
On* dfinit deux limites microbio (m seuil bas et
M seuil haut): on acceptera que quelques
chantillons se trouvent entre les deux
Le plan dchantillonnage dfinira donc le
nombre de prises dchantillons n et le nombre
acceptable entre les deux limites c
* On cest le rglement CE 2073/2005, qui dit : n = nombre d'units
constituant l'chantillon; c = nombre maximal de rsultats pouvant prsenter
des valeurs comprises entre m et M, pour le nombre d'chantillons n ralis

Catgorie de
denres
alimentaires

Microorganismes

Prparations E. coli
de viande

Plan
chantillonnage

Limites

500
ufc/g
ou
cm2

Mtho
Stade
anad'applilyse de cation du
rfcritre
rence

5000
ISO
Fin du
ufc/g 16649- procd
ou
1 ou 2 de fabricm2
cation

Action en
cas de
rsultats
insatisfaisa
nts

Amliorer
hygine de
production
et
slection
matires
premires

Plan dinterprtation 3 classes :

satisfaisant / acceptable / insatisfaisant
C, nombre maximum de rsultats pouvant prsenter des valeurs
comprises entre m et M, pour le nombre dchantillons n ralis.

Prlvements sur carcasse

Lieux de prlvements
4 sites sur 5 carcasses

Cuisse

x 10 semaines
Montre hygine abattoir

Flanc

Epaule

Collier

CARCASSES
Catgorie de
denres
alimentaires

Microorganismes

Plan
d'chantillonnag
e
n

Carcasses de
bovins,
dovins, de
caprins et
dquids4

Limites

Mthode
d'analyse de
rfrence3

Stade
d'application du
critre

Action en
cas de
rsultat
inacceptable

Nombre de
colonies arobies

3,5 log
ufc/cm2
moyen
quotidien

5,0 log
ufc/cm2

ISO 4833

Carcasses
aprs
lhabillage,
mais avant
le ressuage

Amliorer
lhygine de
labattage et
rexamen
des contrles
de procd

Entrobactries

1,5 log
ufc/cm2
moyen
quotidien

2,5 log
ufc/cm2

ISO
21528-2

Carcasses
aprs
lhabillage,
mais avant
le ressuage

Amliorer
lhygine de
labattage et
rexamen
des contrles
de procd

Plan dinterprtation 3 classes (sur moyenne des log)

satisfaisant / acceptable / inacceptable

Examens Bactriologiques sur Carcasse

Pour vrifier et amliorer lhygine de labattoir
Pour quelles autres raisons ?



Abattage animal accident

Contrle officiel si doute

Septicmie

ou Tuberculose ?

Substance antimicrobienne ? (pvt = rein)



Vto Inspecteur peut le demander

pour aide la dcision
Carcasse garde en consigne
Si deuxime examen dfavorable = saisie totale

Questions d'interro possibles (exemples)

- Quels sont les 2 types de critre microbiol. dfinis par la rglementation europenne ?
Que signifient-ils? Donner pour chacun d'entre 2 exemples de bactries concernes
- Citez 4 bactries ou toxines recherches dans les critres microbiologiques de scurit
- Diffrences entre dnombrements bactriens en milieu liquide et en milieu solide, avantagesinconvnients, et type de rsultat obtenu (on peut faire un schma)
- Sur un exemple de numration en milieu solide (donn sur le sujet), trouver le nombre de
bactries par gramme d'aliment, et exprimez-le de faon standard
- Quelle bactrie et/ou famille de bactries utilise-t-on en gnral comme indicateur de
contamination fcale ? Donner trois facteurs qui permettent de slectionner/distinguer cette
bactrie/famille lors de sa numration sur boite de ptri
-Combien de temps faut-il pour dtecter et confirmer la prsence de Salmonelle dans un
aliment ?
- Quels sont les diffrents lments pris en compte pour dfinir un critre microbiologique ?
- Diffrences entre plan 2 classes et plan 3 classes
- Que fait lindustriel qui constate lors dun auto-contrle quun aliment quil commercialise nest
pas satisfaisant pour un critre microbiologique de scurit des aliments ?
- Que signifie "Plan 3 classes" pour l'interprtation des rsultats de l'analyse bactriologique
d'un lot d'aliment ? Dfinissez m, M, n et c.
- Comment contrle-t-on la qualit bactriologique des carcasses dans un abattoir ?
- Interprter les rsultats d'une analyse microbiologique (sur un exemple). Le plan
rglementaire d'interprtation sera donn sur le sujet d'exam : inutile de le savoir par cur !