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Bacillus thuringiensis y el control de Tuta

absoluta
BOOK APRIL 2012

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2 AUTHORS, INCLUDING:
Javier Adolfo Hernandez Fernandez
Jorge Tadeo Lozano University
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Bacillus thuringiensis y CONTROL DE Tuta absoluta

LORENA RAMREZ REYES

NATALIA RAMREZ HERNNDEZ
JAVIER HERNNDEZ FERNNDEZ

Universidad Jorge Tadeo Lozano, Facultad de Ciencias e Ingeniera,

Laboratorio de Biologa Molecular, Grupo de Investigacin, Gentica &
Biologa Molecular GENBIMOL, Carrera 4 No 22-61 Piso 6 Modulo 7,
Bogot Colombia, Suramerica

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIN ................................................................................................. 14
2. MARCO TERICO .............................................................................................. 16
2.1. El cultivo del tomate en Colombia. ............................................................ 16
2.1.1. Generalidades del tomate .................................................................... 17
2.1.2. Clasificacin taxonmica del tomate .................................................. 18
2.1.3. Plagas del tomate.................................................................................. 18
2.2. El cogollero del tomate (Tuta absoluta) .................................................... 18
2.2.1. Clasificacin taxonmica de Tuta absoluta ....................................... 19
2.2.2. Descripcin y ciclo de vida de Tuta absoluta.................................... 20
2.2.3. Mtodos de control de Tuta absoluta ................................................. 23
2.2.4. Enemigos naturales de Tuta absoluta ............................................... 23
2.3 La bacteria entomopatgena Bacillus thuringiensis................................. 23
2.3.1 Caractersticas generales de Bacillus thuringiensis (Bt) .................. 23
2.3.2. Clasificacin taxonmica de Bacillus thuringiensis.......................... 24
2.3.3. Bacillus thuringiensis en el medio ambiente .................................... 25
2.4. Intercambio gentico .................................................................................... 26
2.4.1. Conjugacin ........................................................................................... 27
2.4.2. Intercambio intra e interespecfico...................................................... 27
2.5. Las Delta-endotoxinas ................................................................................. 28
2.5.1. Clasificacin de las -endotoxinas de B. thuringiensis ................... 28
2.5.2. Genes que codifican protenas con actividad insecticida ............... 34
2.5.3. Organizacin y estructura tridimensional de las protenas Cry ..... 36
2.5.4. Mecanismo de accin de las protenas insecticidas de cristal
(ICPs) ................................................................................................................ 38
2.5.5. Aplicaciones biotecnolgicas .............................................................. 40
2.6. Tcnicas moleculares .................................................................................. 42
2.6.1. Electroforesis de protenas (SDS-PAGE): ........................................ 43
2.6.2. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)............................ 43
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA .................................................................. 46
4. JUSTIFICACIN .................................................................................................. 47
4. OBJETIVOS .......................................................................................................... 50
4.1. Objetivo general ............................................................................................ 50

4.2. Objetivos especficos ................................................................................... 50

5. MATERIALES Y MTODOS ............................................................................. 51
5.1. Ubicacin del sitio de trabajo ...................................................................... 51
5.2. Cepas de referencia ..................................................................................... 51
5.3. Obtencin de muestras de suelos, rea de estudio................................ 51
5.5 Caracterizacin microscpica de aislamientos nativos ........................... 53
5.6. Caracterizacin bioqumica SDS-PAGE ................................................... 54
5.6.1. Obtencin de extractos crudos ........................................................... 54
5.6.1.1 Medio de cultivo LB 7 das ................................................................ 54
5.6.1.2 Medio de cultivo LB 20 das .............................................................. 55
5.6.1.3. Medio de cultivo LB y muestras con adicin de Urea, Na2CO3 y
NaOH.................................................................................................................. 55
5.6.1.4. Medio de cultivo LB modificado con adicin de Sulfato de
Amonio ............................................................................................................... 56
5.7. Caracterizacin molecular ........................................................................... 56
5.7.1. Extraccin de ADN ................................................................................ 56
5.7.2. Amplificacin por PCR de genes cry1. .............................................. 56
5.7.3. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 ......................... 58
5.7.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos .... 58
5.7.5. Electroforesis de ADN en gel de agarosa ......................................... 59
5.8. Cuantificacin de Protenas de Extractos crudos.................................... 59
5.8.1. Obtencin de Extractos crudos ........................................................... 59
5.8.2. Cuantificacin de protenas totales en los extractos crudos por la
tcnica de Bradford .......................................................................................... 60
5.9. Caracterizacin Biolgica ............................................................................ 60
5.9.1. Cra de Tuta absoluta .......................................................................... 60
5.9.2. Experimentos para la estandarizacin del sistema de bioensayo 62
5.9.3. Evaluacin de bacilos nativos preseleccionados ............................. 66
5.9.4. Determinacin de la concentracin letal 50 (CL50) .......................... 67
5.10. Conformacin de un Banco de Bacilos Nativos Esporulados ............. 68
6. RESULTADOS Y DISCUSIN .......................................................................... 69
6.1. Aislamiento de cepas a partir de muestras de suelo en 4
departamentos de Colombia .............................................................................. 69
6.2. Caracterizacin microscpica ..................................................................... 71

6.3. Caracterizacin bioqumica ......................................................................... 77

6.3.1. Estandarizacin de electroforesis de protenas en geles de
poliacrilamida .................................................................................................... 78
6.3.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida de los extractos crudos
de los bacilos nativos esporulados ................................................................ 82
6.4. Caracterizacin Molecular ........................................................................... 86
6.4.1. Extraccin de ADN ................................................................................ 86
6.4.2. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 ......................... 87
6.4.3. Amplificacin de genes cry1 en bacilos nativos esporulados ........ 89
6.4.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos .... 92
6.4.5. Amplificacin de genes cry1 especficos en bacilos nativos
esporulados. ...................................................................................................... 97
6.5. Seleccin de bacilos nativos para el montaje de bioensayos contra
Tuta absoluta ...................................................................................................... 103
6.6. Obtencin y Cuantificacin de Protenas totales de los extractos
crudos en bacilos nativos esporulados ........................................................... 105
6.7. Caracterizacin Biolgica .......................................................................... 106
6.7.1 Cra de Tuta absoluta .......................................................................... 106
6.7.2. Estandarizacin del bioensayo ......................................................... 108
6.7.3. Bioensayos discriminatorios para la evaluacin de bacilos nativos
esporulados preseleccionadas ..................................................................... 112
6.8. Conformacin de un Banco de bacilos nativos esporulados ............... 124
7. CONCLUSIONES .............................................................................................. 125
8. RECOMENDACIONES ..................................................................................... 128
9. REFERENCIAS .................................................................................................. 129
10. ANEXOS ............................................................. Error! Marcador no definido.

NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Proteinas Cry y Cyt producidas por las diferentes variedades de B.

thuringiensis. .......................................................................................................... 29
Tabla 2. Protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto. ......... 35
Tabla 3. Superficie global de cultivos transgnicos en 2006: por pas (millones de
hectreas)............................................................................................................... 42
Tabla 4. Condiciones empleadas en PCR y PCR mltiplex (Elnifro et al., 2000) .... 45
Tabla 5. Secuencia y posicin de los oligonucletidos universales que reconocen 25
genes de la familia cry1. (Bravo et al., 1998) .......................................................... 57
Tabla 6. Secuencia y posicin de los oligonucletidos especficos, diseados en
secuencias conservadas para cada gen especfico, se presenta el tamao del
producto amplificado (Cern et al., 1994). .............................................................. 58
Tabla 7. Departamento, municipio y nmero de aislamientos nativos, a partir de las
muestras de suelo analizadas................................................................................. 70
Tabla 8. Municipio, nmero y grupo de cristales de bacilos esporulados aislados
presentes en muestras de suelo analizadas. I) Am; II) Am, bp y rd; III) Am y cd; IV)
Am y rd; V) Am, rd y cd; .......................................................................................... 75
Tabla 9. Relacin entre los pesos moleculares de las protenas reveladas en cada
uno de los bacilos nativos esporulados y el/o los grupos de actividad biolgica
establecidos............................................................................................................ 84
Tabla 10. Porcentaje de cepas con presencia del gen cry1 por municipio en cada
departamento. ........................................................................................................ 92
Tabla 11. Variables utilizadas en los experimentos 4 y 5, para la estandarizacin de
las condiciones de la M-PCR para la mezcla de oligonucletidos A y B ................. 97
Tabla 12. Perfil de genes cry1 especficos identificados en bacilos nativos
esporulados en cada uno de los municipios muestreados. ................................... 101
Tabla 13. Caracterstica de las Cepas nativas de Bacillus thuringiensis aisladas de
suelos colombianos seleccionados por sus caractersticas de presencia y numero de
cristales, tamao de las protenas reveladas y presencia de genes cry1 especficos
para bioensayos. .................................................................................................. 105
Tabla 14. Concentracin de protena total del extracto crudo de 10 cepas de B.
thuringiensis escogidos para el bioensayo. .......................................................... 106
Tabla 15. Concentraciones letales 50 (CL50) de las cepas nativas y de referencia.
Cepa 11, Cepa 39 y Bt var. kurstaki HD1, sobre larvas de 2do instar de Tuta
absoluta, con lmites de confianza al 95% ............................................................ 120

NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Dao causado por Tuta absoluta en hojas de tomate. .......................... 17

Figura 2. Ciclo biolgico de Tuta absoluta............................................................. 22
Figura 3. Micrografa de transmisin electrnica de B. thuringiensis. .................... 25
Figura 4. Estructura tridimensional de protena Cry1Aa. ....................................... 36
Figura 5. Alineamiento de las protenas Cry que revela la posicin de los 5 bloques
conservados. .......................................................................................................... 38
Figura 6. Mecanismo de accin de las -endotoxinas. .......................................... 39
Figura 7. Zonas de recoleccin de muestras de suelo en Colombia...................... 52
Figura 8. Cmara de cra del insecto Tuta absoluta. ............................................. 61
Figura 9. Experimento 1: inmersin de hojas de plantas de tomate en diluciones de
los productos comerciales Dipel, Xentari y Turilav. ................................................. 63
Figura 10. Experimento 2: aspersin con aergrafo de hojas de tomate, con las
diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. ............................ 64
Figura 11. Experimento 3: Frascos con foliolos de plantas de hojas de tomate
colocadas a maera de florero, con las diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel,
Xentari y Turilav. ..................................................................................................... 65
Figura 12. Experimento 4: Medio de cultivo extracto de hojas de tomate. ............. 65
Figura 13. Experimento 5: inmersin de hojas de plantas de tomate en dilucin de
los productos comerciales Dipel, xentary y Turilav.................................................. 66
Figura 14. Cultivo por aislamiento de un bacilo nativo esporulado. ....................... 69
Figura 15. Porcentaje de las diferentes formas de cristales observadas en los
bacilos nativos esporulados. ................................................................................... 72
Figura 16. Grupo o perfiles de los bacilos nativos esporulados de acuerdo a la
forma del cristal observado. .................................................................................... 73
Figura 17. Diferentes formas de cristal observadas en los bacilos nativos
esporulados aislados. ............................................................................................. 76
Figura 18. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Bacilos nativos
esporulados y cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB 20 das. ................ 79
Figura 19. Electroforeis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, un bacilo
nativo esporulado y una cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB por
triplicado con tres tramientos distintos Urea, Na2CO3 y NaOH. ............................... 80
Figura 20. Electroforeis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, medio de
cultivo LB modificado. ............................................................................................. 81
Figura 21. Perfil electrofortico de protenas SDS-PAGE en cepas de referencia Bt
var. kurstaki HD1, y algunos bacilos nativos esporulados. ...................................... 82
Figura 22. a) ADN general de bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo Kit
ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit b. ADN plasmdico. Bacilos nativos
esporulados (1-11), con el mtodo Kit ULTRA CLEAMTMMicrobial isolation Kit. Gel
de agarosa al 1% teida en bromuro de etdio. ....................................................... 87
Figura 23. Amplificacin de fragmentos por PCR de genes cry1 utilizando los
oligonucletidos universales Bravo et al. (1998). .................................................... 90
Figura 24. Productos amplificacidos por PCR mltiple para identificar fragmentos
de genes cry1Aa (246 pb), cry1Ab (216 pb), cry1Ac (180 pb) (Mezcla A) y cry1B
(367 pb), cry1C (130pb), cry1D (290 pb) (Mezcla B). .............................................. 93

Figura 25. Productos amplificados de ADN por PCR para genes cry1 especficos
en cepas de referencia. .......................................................................................... 94
Figura 26. Productos de amplificacin por PCR de genes cry1 especficos en cepas
de referencia y cepas nativas. ................................................................................ 96
Figura 27. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en
cepas de referencia y cepas nativas, utilizando la mezcla A de oligonucletidos. ... 98
Figura 28. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en
cepas de referencia y cepas nativas, utilizando la mezcla B de oligonucletidos. ... 99
Figura 29. Distribucin del nmero de bacilos nativos esporulados con presencia
de genes cry1 especifcos en XIV grupos. ............................................................ 100
Figura 30. Instares larvales de Tuta absoluta. ..................................................... 108
Figura 31. Porcentaje de mortalidad de los productos comerciales Dipel, Turilav y
Xentary, sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta. .......................................... 112
Figura 32. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes
bacilos nativos esporulados. ................................................................................. 114
Figura 33. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes
extractos crudos de los bacilos nativos esporulados, prueba de Tukey 95% de
confianza. ............................................................................................................. 115
Figura 34. Mortalidades obtenidas en la evaluacin dosis- respuesta de los bacilos
nativos esporulados sobre larvas de T. absoluta. a. bacilo nativo 11. b. bacilo
nativo 39. c. Cepa de referencia HD1. .................................................................. 118
Figura 35. Mortalidad corregida de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa de
referencia HD1 a las diferentes dosis evaluadas. Tratamientos con la misma letra no
son significativamente diferentes segn la prueba de comparacin de medios de
Tukey (95%) ......................................................................................................... 121
Figura 36. Larva de Tuta absoluta muerta debido a intoxicacin con el complejo
espora-cristal (extracto crudo). ............................................................................. 122
Figura 37. Prueba confirmatoria: bacilos nativos esporulados, aislada del insecto
plaga Tuta absoluta. ............................................................................................. 123
Figura 38. Banco cepas de Bacilos Gram positivos esporulados. ....................... 124

NDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Preparacin de geles y reactivos para electroforsis de SDS-page . Error!

Marcador no definido.
Anexo 2. ULTRA CLEANTM MICROBIAL ISOLATION KIT DE LA CASA
COMERCIAL BIO-LINE ............................................. Error! Marcador no definido.
Anexo 3. KIT, ULTRA CLEANTM 6 MINI PLASMID PREP KITTM DE LA CASA
COMERCIAL BIOLINE ............................................. Error! Marcador no definido.
Anexo 4. SOFTWARE VISION WORK AND ANALISYS VERSIN 6.4.3 UVP LSC.
USA ........................................................................... Error! Marcador no definido.
Anexo 5. Curva de calibracin para la determinacin de protenas por el mtodo de
bradford ..................................................................... Error! Marcador no definido.
Anexo 6. Caracterizacin macroscopca y microscpica de los aislamientos nativos
.................................................................................. Error! Marcador no definido.
Anexo 7. Cuantificacin microscpica y caracterizacin bioqumica y molcular de
aislamientos nativos de bacilos esporulados ............. Error! Marcador no definido.
Anexo 8. Estandarizacin Bioensayo ........................ Error! Marcador no definido.
Anexo 9. Evaluacin de cepas .................................. Error! Marcador no definido.
Anexo 10. Anlisis estadstico de cepas preseleccionas ........... Error! Marcador no
definido.
Anexo 11. Prueba de Probit para la cepas nativas 11, 39 y la cepa de referencia
HD1. Biostat 2007...................................................... Error! Marcador no definido.
Anexo 12. Anlisis estdistco de la eficacia de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa
de referencia HD1 a las diferentes dosis evaluadas. . Error! Marcador no definido.

LISTA DE ABREVIACIONES

MIP:

Manejo Integrado de Plagas

m.s.n.m :

metros sobre el nivel del mar

ha:

Hectreas

ton:

Toneladas

T:

Temperatura

ml:

Mililitros

l:

Microlitros

g/ml:

microgramo por mililitro

aa:

Aminocidos

C:

grados centgrados

r.p.m:

revoluciones por minuto

Agua dd:

Agua destilada desionizada

h:

Horas

nm:

Nanmetros

L. esculentum:

Lycopersicum esculentum

T. absoluta:

Tuta absoluta

var:

Variedad

LB:

Agar Luria Bertani

Bt:

Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis)

ICPs:

Protenas Insecticidas de Cristal (del ingles Insecticidal Crystal

Proteins)

cry:

Genes del cristal

Cyt:

Protena Insecticida con actividad citoltica

Cry:

Protenas del cristal

- endotoxina

Delta endotoxinas
Protenas insecticida que se forman en la fase vegetativa de

VIP:

crecimiento

10

SDS-PAGE:

Electroforesis de Protenas en condiciones denaturantes

kDa:

Kilodaltons

SDS:

Lauril sulfato sdico

PCR:

Reaccin en cadena de la Polimerasa

pb:

Pares de bases

ADN:

cido desoxirribonucleico

mM:

Milimolar

M:

Micromolar

dNTPs:

Desoxirribonucletidos

U:

Unidades

DTT:

Ditiotreitol

PMSF:

Fenil metil sulfanil floruro

11

RESUMEN

En Colombia, gran diversidad de insectos plaga afectan el cultivo de tomate, entre los que se
destaca la polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick). El dao es causado por las larvas que
atacan el follaje formando minas y barrenan las nervaduras, las ramas y tallos, e inclusive
producen la cada de flores y frutos. Para su control, los agricultores utilizan principalmente
insecticidas qumicos, que ocasionan efectos nocivos al ambiente y a la salud humana. El
control biolgico surge como alternativa, y dentro de los posibles controladores biolgicos se
encuentra Bacillus thuringiensis (Bt) dominando el 90% del mercado mundial de
bioplaguicidas. La investigacin en este controlador microbial avanza aceleradamente en el
mundo y continuamente se estn buscando nuevos aislamientos en condiciones naturales.
Se considera que Colombia por su gran biodiversidad, tiene enorme potencial para esta
busqueda. En el presente estudio, se recolectaron 28 muestras de suelo en 14 municipios en
Colombia. Se aislaron 99 bacilos nativos esporulados que presentaron diversidad
morfolgica encontrando cristales con formas amorfas, bipiramidal, cuadradas, redondas y
triangulares. Se observaron bacilos con 1, 2, 3 y 4 formas de cristal, establecindose 18
perfiles diferentes. Los aislamientos positivos para cristales se sometieron a una
caracterizacin bioqumica por medio de electroforesis de protenas totales (SDS-PAGE).
Para estandarizar la obtencin de extractos crudos de protenas totales de los bacilos
nativos esporulados, se evaluaron 4 mtodos: 1) Medio de cultivo LB 7 das; 2) Medio de
cultivo LB 20 das; 3) Medio LB con adicin de Urea, Na 2CO3, NaOH y 4) Medio LB
modificado. El cuarto mtodo present la mejor resolucin de las bandas de protenas en
geles de poliacrilamida. Se evidenciaron bandas de protenas de 10 a 150 kDa, por SDSPAGE, que se clasificaron en 7 grupos de acuerdo a la relacin entre peso molecular y
posible actividad biolgica. Se encontraron bacilos nativos esporulados que revelaron con
notoriedad y abundancia ms de una banda de protena en su patrn electrofortico,
encontrando 28 perfiles diferentes. La caracterizacin molecular por PCR utilizando
oligonucletidos generales amplific fragmentos para la presencia de genes cry1 en 35
cepas nativas de B. thuringiensis. El ADN de estos 35 bacilos fue sometido a dos rondas de
PCR Mltiple con 2 mezclas de oligonucletidos especficos, reconociendo 6 genes
especficos. En los bacilos nativos se amplificaron los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B,
cry1C y cry1D en el 76, 26, 21, 35, 32, y 8,8% respectivamente. De acuerdo a estas
caracterizacion se seleccionaron 10 cepas nativas de B. thuringiensis como promisorios para
el control de Tuta absoluta y se probaron contra larvas de 2do instar de este insecto plaga.
Para estandarizar el sistema de bioensayo se evaluaron cinco mtodos con tres productos
comerciales, (Bioinsecticidas basados en cristales y esporas de B. thuringiensis) Dipel,
Turilav y Xentari: 1) Inmersin de la hoja; 2) Aspersin por aergrafo en hojas de tomate;
3) Frascos con foliolo de plantas de tomate; 4) Medio de cultivo extracto hojas de tomate y
5) Recipientes plsticos. La metodologa ptima para realizar los bioensayos con Tuta
absoluta fue la nmero 1, sumergiendo las hojas en el producto a evaluar, con un 96% de
supervivencia del testigo y 100% de mortalidad, a una concentracin de 2,5 g/L del producto
comercial Dipel. Los bacilos nativos ZBUJTL39 y ZCUJTL11 presentaron mejor actividad
biolgica que la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1. El bacilo nativo ZCUJTL11 present
una CL50 de 2,4 g/ml (P<0,05). Los resultados muestran la gran biodiversidad de bacilos
esporulados que se encuentran en suelos colombianos. Al parecer la gran variabilidad en
ecosistemas y diversidad en insectos, tanto plagas como benficos, determina la
coevolucin en diferentes formas de Bacillus thuringiensis. La metodologa estandarizada
permite seleccionar las cepas de acuerdo a su actividad biolgica potencial, como un paso
previo a los bioensayos. El bacilo nativo seleccionado por su potencial para el control de

12

Tuta absoluta, es promisorio para posteriores investigaciones como la produccin de un

biopesticida o en ingeniera gentica de tomate, para la obtencin de cultivares
autorresistentes a Tuta absoluta.

ABSTRACT

In Colombia, among the great diversity of insect pests affecting the tomato crop stands up
the tomato moth (Tuta absoluta Meyrick). Damage is caused by larvae which attack the
foliage forming auger mines in veins, branches and stems, and even producing flowers and
fruit dropping. For its control, farmers mainly use chemical insecticides, which cause adverse
effects to the environment and human health. Biological control of pests comes up as
alternative, and among many biological agents, Bacillus thuringiensis (Bt) dominate 90% of
biopesticide global market. Research on this biocontrol agent is developing faster around the
world and novel isolates are being scout continusly. In this study, 28 soil samples were
collected in 14 Colombia municipalities and 99 strain native were isolated, which showed
morphological diversiity in between their crystals, with, bipiramidal, square, round, triangular
and amorphous forms. 1, 2, 3 and 4 forms of, bacilli crystals were observed which conform
18 different profiles. Isolates positive for crystals underwent a biochemical characterization by
total protein electrophoresis (SDS-PAGE). To standardize the total protein of strain native
collection of crude extracts, 4 methods were evaluated: 1) LB culture medium, 7 days, 2) LB
culture medium, 20 days, 3) LB Medium with Urea, Na2CO3 and NaOH addition and
4) Middle LB amended. The fourth method presented the best resolution of protein bands in
polyacrylamide gels. Protein bands of 10 to 150 kDa were evidenced by SDS-PAGE and
classified into 7 groups according to the relationship between molecular weight and possible
biological activity. Some strain native revealed notoriously more than one band of protein
electrophoretic pattern with 28 different profiles PCR molecular characterization, using
general primers, amplified fragments for cry1 genes presence in 35 strain native. ADN of
these 35 bacteria was taken into two rounds of PCR with multiple 2-specific oligonucleotide
mixtures, recognizing 6 specific genes. In strain native of Bt, genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac,
cry1B, cry1C and cry1D were amplified, in 76, 26, 21, 35, 32, and 8.8% respectively.
According to these characterizations, 10 native isolates were selected as promising for Tuta
absoluta control and challenged against 2nd instar larvae. To carry out this procedure five
methods were evaluated with three commercial products (based on bioinsecticides crystals
and spores of B. thuringiensis: Dipel Turilav and Xentari : 1) immersion of the leaves,
2) by spraying airbrush on tomato leaves, 3) Bottles with leaflets of tomato plants, 4) culture
medium of tomato extract leaves and 5) plastic containers. The bioassays optimum
methodology to try Bt on Tuta absoluta was method 1, with immersion of leaves into the
evaluated product, (96% control survival and 100% mortality at a 2.5 g/L concentration of
commercial product Dipel. The strain native ZBUJTL39 and ZCUJTL11, showed better
biological activity that the reference strain: Bt var kurstaki HD1. Strain native ZCUJTL11
presented a LC50 of 2.4 mg/ml (P<0.05). Results showed the enormous biodiversity of strain
native that could be found in Colombian soil. Apparently the great variability in ecosystems
and diversity in insects, both pests and beneficials, determines different coevolution ways to
be followed for Bacillus thuringiensis. The methodology allows selecting Bt strains according
to their potential biological activity, as a preliminary step to bioassays. The native bacillus
strain identified with potential to control Tuta absoluta is promising for further research
leadingt to develop a biopesticide or a genetically engineered tomato, resistant to Tuta
absoluta.

13

1. INTRODUCCIN
El tomate (Lycopersicon esculentum Millano) es uno de los cultivos ms importantes
en Colombia, esta hortaliza presenta gran demanda en la dieta alimenticia y genera
empleo e ingresos, no slo en el campo, sino tambin en la agroindustria. En
Colombia la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente de 15.881
hectreas (ha), con una produccin de 420.419 toneladas (ton) y un rendimiento de
26,5 ton/ha en el ao 2006 (Agronet, 2006).

Esta solancea es afectada por una gran cantidad de plagas y enfermedades dentro
de las cuales se destaca el dao causado por las larvas de Tuta absoluta
(Lepidoptera: Gelechiidae). El cogollero del tomate Tuta absoluta es considerado
una de las principales plagas de gran importancia econmica del tomate en
Colombia, ya que ocasiona prdidas que representan un 27- 43%, debido a que
afecta directamente la produccin del cultivo (Cely et al., 2006), Este dao es
causado por larvas de la plaga, que minan el follaje y los tallos de las plantas, y
atacan las hojas jvenes, ramas, perforando adems flores y frutos (Garca, 1993;
De Vis et al., 2001) lo que ocasiona un debilitamiento gradual en la planta
disminuyendo su potencial productivo (Corporacin Colombiana de Investigacin
Agropecuaria CORPOICA, 2008).

Para su control, los agricultores utilizan principalmente insecticidas qumicos, que

ocasionan efectos nocivos al ambiente, generacin de resistencia, aparicin de
residuos qumicos en los alimentos, contaminacin de las aguas, eliminacin de la
fauna benfica y problemas para la salud humana. El control biolgico surge como
alternativa, y dentro de los posibles controladores biolgicos se encuentra Bacillus
thuringiensis (Bt) que domina el 90% del mercado mundial de bioplaguicidas
(Feiltelson et al., 1992). Bt es una bacteria aerbica, Gram positiva, que se
caracteriza por la produccin de cristales paraesporales, compuestos por Protenas
Insecticidas de Cristal ICPs (del ingles, Insecticidal Crystal Proteins) (Schnepf et al.,
1998), que poseen alta especificidad sobre larvas de insectos de diferentes ordnes.

14

La investigacin en este controlador microbial avanza aceleradamente en el mundo

y continuamente se estn buscando nuevos aislamientos en condiciones naturales.
En este trabajo se aislaron y caracterizaron aislamientos nativos de bacilos
esporulados con genes especficos de la familia cry1, con actividad anti lepidptera
a partir de suelos en los que se cultiva tomate en cuatro departamentos de
Colombia: Cundinamarca, en los municipios de Susa y Cha; Boyac, en los
municipios de: Villa de Leyva, Sutamarchn, Raquir y Santa Sofa; Huila, en el
municipio de Garzn; y Santander, en los municipios de: Piedecuesta, Los Santos,
Lebrija, Betulia, Floridablanca, Rionegro y Girn. Se identificaron genes especficos
para poder seleccionar aislamientos nativos de B. thuringiensis y estimar su
potencial sobre larvas de 2do instar de T. absoluta, para de esta manera identificar
bacilos nativos potenciales para el control de esta plaga. Adicionalmente se
conform un banco de bacilos nativos esporulados caracterizados a nivel molecular
de acuerdo a la presencia de genes cry1 como un paso previo a la realizacin de
ensayos biolgicos, que permiten confirmar la efectividad de un aislamiento nativo
en el control de una determinada plaga.

Debido a la importancia que tiene el control de insectos plaga y la necesidad de

proponer alternativas para el control de T. absoluta, la bsqueda en Colombia de
nuevos genes cry que codifiquen para nuevas y novedosas delta-endotoxinas con
un espectro de accin ms amplio, contina siendo un proyecto de gran inters. Por
lo tanto, la variabilidad climtica y la biodiversidad presente en Colombia, aportan
los elementos necesarios para justificar el aislamiento y caracterizacin de bacilos
nativos esporulados que pueden ser la base para el desarrollo de insecticidas
microbiales.

Los resultados parciales de este trabajo de grado han sido presentados en tres
eventos cientficos, uno nacional: el LXIII Congreso Nacional De Ciencias
Biolgicas, Yopal, Casanare, Octubre de 2008; y dos internacionales: Congreso
Colombiano de Biotecnologa, II Seminario Internacional de Bionegocios, Bogot, 29
de Julio al 1 de Agosto de 2008 y XIX Congreso Latinoamericano de Microbiologa,
Quito, Ecuador, Octubre de 2008.

15

2. MARCO TERICO

2.1. El cultivo del tomate en Colombia.

El tomate es una hortaliza que pertenece a la familia Solanaceae y al gnero
Solanum (Peralta et al., 2005). Segn Vallejo (1999), el tomate constituye el 30% de
la produccin mundial de hortalizas, con alrededor de 2.9 millones de hectreas (ha)
sembradas. En Suramrica se cultivan aproximadamente 159.500 hectreas en
donde se destacan Brasil y Chile como los mayores productores. Por su parte, en
Colombia hasta el 2006, la superficie destinada a este cultivo fue aproximadamente
de 15.881 hectreas, con una produccin de 420.419 toneladas (ton) y un
rendimiento de 26,5 ton/ha (www.agronet.gov.co). Segn De Vis et al. (2001), en
Colombia la mayora de cultivos de tomate se producen al aire libre y un pequeo
porcentaje se cultiva bajo invernadero. El cultivo bajo invernadero reduce la
incidencia de plagas y enfermedades al permitir controlar las condiciones
ambientales y abre la posibilidad de utilizar con mayor facilidad el control biolgico
para mantener a las poblaciones plaga en niveles bajos.

Existe gran diversidad de enfermedades y plagas que afectan este cultivo y que
disminuyen su productividad al impedir el ptimo desarrollo del fruto. El gusano
cogollero del tomate, T. absoluta, es un lepidptero de la familia Gelechiidae que
ocupa el segundo lugar entre las plagas de importancia de esta solancea despus
de la mosca blanca (Trialeuroudes vaporariorum) (De Vis et al., 2001). El dao se
incrementa a medida que aumenta la temperatura ambiental (De Vis et al., 2001).
T. absoluta acta como: minador de las hojas, barrenador del tallo, perforador del
fruto, y puede tambin causar dao en las flores al hacer galeras dentro de ellas
(Vlez, 1997) (Figura 1). Segn Garca (2002) el dao se inicia en el semillero y
contina en todo el desarrollo de la planta. Las plantas ampliamente infestadas
presentan minas y perforaciones causadas por larvas, como tambin por la toxicidad
de los insecticidas utilizados.

16

Figura 1. Dao causado por Tuta absoluta en hojas de tomate.

Se observan larvas consumiendo el mesfilo de la hoja.

2.1.1. Generalidades del tomate

El tomate (Lycopersicum esculentum Mill) es una planta originaria de la planicie
costera occidental de Amrica del sur. Fue introducido por primera vez en Europa a
mediados del siglo XVI y a principios del siglo XIX se comenz a cultivar
comercialmente, luego se inici su industrializacin y la diferenciacin de las
variedades para mesa y para industria (Prez et al., 2002).

El tomate es una planta dicotilednea, perteneciente a la familia Solanaceae y al

gnero Lycopersicum. La especie L. esculentum es la especie ms cultivada y
posee nueve especies silvestres relacionadas. Esta planta es perenne y de porte
arbustivo, puede desarrollarse en forma rastrera, semi recta o erecta. La
temperatura ideal para el cultivo es de 25C. Este factor se considera limitante, al
igual que el exceso de lluvias porque favorece la incidencia de enfermedades en el
cultivo (Vallejo, 1999).

17

2.1.2. Clasificacin taxonmica del tomate

Reino: Plantae
Sub reino: Tracheobiota
Divisin: Magnoliopsida
Clase: Asteridae
Orden: Solanales
Familia: Solanaceae
Gnero: Solanum
Especie: S. lycopersicum
2.1.3. Plagas del tomate
El tomate es atacado por un nmero elevado de insectos plaga desde el semillero
hasta la cosecha de los frutos, aunque existen centenares de insectos y caros que
viven del consumo de esta planta, son pocos los que causan daos considerables, y
que en muchas regiones o pocas hacen difcil o casi imposible su cultivo. En
Colombia son cinco los insectos plaga que limitan la produccin y que han
conducido a los agricultores a utilizar deliberadamente insecticidas qumicos
(Vallejo, 1999). Se consideran como importantes, adems del cogollero del tomate
(Tuta absoluta): La Mosca Blanca (Trialeurodes vaporariorum), El Pasador del Fruto
(Neoleucinodes elegantalis Guene), El Minador de la hoja Liriomyza sp., y los
fidos: Aphis gossyppi, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae.
2.2. El cogollero del tomate (Tuta absoluta)
El cogollero del

tomate Tuta absoluta, fue descrito por primera vez por el

entomlogo E. Meyrick (1917) a partir de un ejemplar macho colectado en

Huancayo,

Per,

denominndolo

Phthorimaea

absoluta

(Rojas,

1981).

Posteriormente, recibi otras cuatro denominaciones: Gnorimoschema absoluta,

Scrobipalpula absoluta, Scrobipalpuloides absoluta y finalmente se la ha ubicado en
el Gnero Tuta (Barrientos, 1997).

18

La polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick) est presente en toda Amrica del Sur,
donde se considera plaga clave para el tomate fresco e industrial. Se encuentra
principalmente en las zonas montaosas de los Andes y en Chile se distribuye entre
la Primera y Dcima Regin, en el Archipilago de Juan Fernndez y en la Isla de
Pascua (Uchoa-Fernandes et al., 1995; Artigas, 1994).

El cogollero del tomate T. absoluta es considerado una de las principales plagas del
tomate en Colombia (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria
CORPOICA, 2008), el dao es causado por las larvas que atacan el follaje formando
minas; adems pegan las hojas del cogollo formando una telaraa y barrenan las
nervaduras, las ramas y tallos, e inclusive producen la cada de flores y frutos. Esta
plaga es de gran importancia econmica por que afecta directamente la produccin
del cultivo (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria CORPOICA,
2008). En Colombia, se report la plaga en 1936 en el Valle del Cauca (Garca,
2002). Posteriormente, T. absoluta fue un grave problema para los cultivadores de
tomate en la misma regin entre 1970 y 1974 (Vlez, 1997). Actualmente la plaga
se encuentra presente en los principales departamentos productores de tomate que
son Cundinamarca, Santander, Valle, Caldas, Huila, Risaralda, Antioquia, Atlntico y
Guajira (Corporacin Colombia Internacional, 2006). Es importante anotar que esta
plaga no es exclusiva del tomate, se han reportado daos en plantas de papa,
tabaco y en algunas malezas de la familia Solanaceae (Vlez, 1997; De Vis et al.,
2001).
2.2.1. Clasificacin taxonmica de Tuta absoluta
Orden: Lepidptera
Suborden: Glossata
Familia: Gelechiidae
Gnero: Tuta
Especie: T. absoluta

19

2.2.2. Descripcin y ciclo de vida de Tuta absoluta

Durante el ciclo de vida, T. absoluta pasa por cinco estados: huevo, larva, pupa, pre
pupa y adulto. La duracin de estos estados est directamente relacionada con la
dieta a lo largo del desarrollo y factores ambientales como la temperatura (Figura 2).

Segn Vlez (1997) las principales caractersticas de los diferentes estados de T.

absoluta son:

Huevos: Son elpticos, miden en promedio 0.93 mm de largo y 0.23 mm de ancho.

La coloracin inicial es crema y a medida que avanza el desarrollo, se torna
amarillento, al final adquiere una coloracin amarillo naranja. Se encuentran
preferencialmente en el envs de las hojas, pero pueden encontrarse en cualquier
parte de la planta. Los huevos son depositados individualmente a corta distancia
entre ellos. La duracin en este estado es de a 4-8 das en promedio.
Larvas: Los dos primeros instar larvales corresponden a la fase crtica de la
especie, en donde la mortalidad presenta un alto porcentaje (79.8%), esta
mortalidad se debe principalmente a los depredadores y al control qumico. las
larvas tienen un ciclo de13-23 das.

La polilla del tomate presenta cuatro instares larvales bien definidos y diferentes en
tamao y color (Estay, 2000; Fernndez y Montagne, 1990). El primer instar
presenta color blanco y cabeza de color caf oscuro. La forma es cilndrica,
levemente aplastada dorsoventralmente con excepcin de su cabeza que es
prognata (mandbulas salientes), presenta cinco pares de pseudpodos (Vargas,
1970). Despus de la eclosin de los huevos, las larvas buscan un punto de entrada
en las hojas penetrando en la epidermis de la hoja, y en su avance, consumen el
mesfilo produciendo galeras (Fernndez y Montagne, 1990). El tamao de la
galera aumenta a medida que la larva crece y posteriormente, los tejidos se oxidan
y necrosan (Larran, 1992). La larva perfora brotes, flores y frutos, pero prefiere las
hojas en formacin y los racimos florales, pudiendo ocasionar la prdida de un
racimo completo (Lpez, 1991).

20

A medida que se alimenta, la larva se va tornando verde. En el momento de la

muda para pasar al segundo instar, la larva se torna nuevamente blanca. La longitud
mxima del primer instar es de aproximadamente 1,61 mm (Vargas, 1970). El
segundo instar mantiene la misma forma descrita anteriormente y cambia de color
verde a color blanco en el momento de la muda, el tamao promedio es de 2,80
mm. La larva de tercer instar presenta inicialmente un color gris blanquecino, luego
cambia a verde y luego a blanco, en el final del periodo, la longitud promedio es de
4,69 mm (Vargas, 1970). Al llegar al cuarto instar aparece una mancha rojiza dorsal
que se extiende desde los ocelos hasta el margen posterior (Gonzlez, 1989). La
larva sigue manteniendo su forma original y alcanza al final de este periodo una
longitud de 7,72 mm (Vargas, 1970). Los frutos son penetrados por las larvas en
estado inmaduro, preferentemente, por el extremo peduncular dejando tneles que
provocan deformaciones, facilitando as el ataque de agentes patgenos,
potenciando su pudricin y dejndolos inservibles comercialmente (Apablaza, 1992).
En ocasiones, la larva puede salir de un fruto para ingresar a otro dentro de un
mismo racimo (Lpez, 1991).

Pupas: La crislida o pupa es de tipo obtecta (se pueden diferenciar patas y alas),
tiene forma cilndrica, es ms ancha en el extremo anterior que el posterior. Su color
es verde en un comienzo y se va tornando a un color caf oscuro a medida que se
aproxima a la emergencia (Estay y Bruna, 2002). Presentan textura lisa y brillante
(Vlez, 1997). Sus dimensiones alcanzan 4,35 mm de largo y 1,10 mm de dimetro
horizontal (Vargas, 1970). La mayora de las veces, se encuentra cubierta de
capullos blancos y sedosos (Apablaza, 1992). En esta fase la larva deja de comer y
forma un capullo, dejndose caer al suelo por medio de un hilo de seda para
desarrollar el periodo de pupa (Vargas, 1970), tiene una duracin de 8-15 das
despus de lo cual emergen adultos completamente formados (Vlez, 1997).
Adultos: Son micro lepidpteros de alrededor de 6 mm de largo. Sus alas son
angostas y las antenas largas y filiformes. La coloracin es crptica con escamas
gris oscuro, caf claro y crema. Los adultos son de hbitos nocturnos pero
presentan una actividad diurna limitada. La cpula se produce en la noche despus
de la emergencia. El perodo de oviposicin dura en promedio 4 das. La longevidad

21

promedio de los adultos es de 8.6 das. La proporcin sexual de hembras y machos

es de 1 a 3, y el nmero promedio de huevos por hembra es 52, aunque el
dimorfismo sexual es escaso. Los machos tienen un abdomen gris claro y delgado
mientras que las hembras presentan un abdomen de color blanco crema y ms
ancho que el de los machos. La envergadura alar de las hembras es de 9,0 a 13,0
mm mientras que la de los machos es de 8,5 a 12,0 mm (Vlez, 1997) (Figura 2).

Figura 2. Ciclo biolgico de Tuta absoluta.

1. Los huevos son de forma elptica, de color blanco recin ovipositados, luego se tornan amarillo
o amarillo naranja al aproximarse su eclosin. Son depositados en forma individual sobre la planta.
2. La larva emerge del huevo y busca un punto de entrada, consume el mesfilo y deja reas
traslucidas conocidas como galeras; pasa por cuatro estadios larvales, cambiando de color
blanco, verde, gris, rojo. 3. En estado de pre pupa la larva elabora un capullo, empupando en el
suelo. 4. Los adultos son mariposas que miden aproximadamente 6 mm de longitud, los machos
tienen un abdomen gris claro y delgado mientras que las hembras presentan un abdomen de color
blanco crema y ms ancho que el de los machos.

22

2.2.3. Mtodos de control de Tuta absoluta

Uno de los mtodos ms empleados en Colombia para controlar a los insectos
plaga es el control qumico, en el que se requieren repetitivas aplicaciones de
insecticidas para poder evitar prdidas en la produccin y calidad de los frutos
(Salazar y Araya, 2001). En algunos cultivos del Brasil, se han utilizado mezclas de
insecticidas altamente txicos, como: Tiocyclam, Carbofuram, Metamidofos,
Cypermetrina,

Metomil,

Cihalotronina,

Teflubenzuron,

Imidacloprid

Avermetina, en dosis y frecuencias elevadas (Souza y Reis, 1986), estos

insecticidas no son muy efectivos frente a esta plaga por el tipo de hbitos y biologa
que presenta, adems su uso inadecuado afecta al medio ambiente y provoca la
muerte de fauna natural (Guedes et al., 1994).
2.2.4. Enemigos naturales de Tuta absoluta
Existen tres especies de himenpteros que controlan diferentes estados de la
plaga: Trichogramma petiosum (Riley) y Trichogramma exiguum son parasitoides de
los huevos mientras que Apanteles gelechiidivoris (Marsh) parasita las larvas
presentndose una preferencia por el tercer instar (Escobar et al., 2004). El uso de
estos controladores ha sido muy efectivo. Sin embargo, el entomopatgeno ms
usado y conocido para el control de lepidpteros es la bacteria B. thuringiensis,
debido a que la mayora de sus cepas poseen actividad patgena contra larvas de
este orden, y entre otras cosas no presenta daos al medio ambiente.
2.3 La bacteria entomopatgena Bacillus thuringiensis
2.3.1 Caractersticas generales de Bacillus thuringiensis (Bt)
El inters por los insecticidas microbianos se remonta desde mediados del siglo XIX;
las investigaciones de la enfermedad del gusano de seda Bombix mori efectuadas
por Pasteur en 1849, enfocaron la atencin de los bacterilogos en insectos plagas
y en el descubrimiento de un sin nmero de enfermedades microbianas de insectos.
Ishiwata (1901) aisl una bacteria de un gusano de seda enfermo, denominndola
Bacillus sotto, este acontecimiento marca el comienzo del desarrollo del control
biolgico. En Thuringia, Alemania, Berliner (1911) aisl una bacteria aerbica

23

formadora de esporas de una larva enferma de la palomilla de la harina (Ephestia

Kuhniella Zell) y la identific como Bacillus thuringiensis (Ishiwata 1901, Berliner
1911; citado en: Whiteley y Schnepf, 1986; Hannay y Fitz-James, 1995).

Hacia 1936 se introdujo en el mercado el primer producto comercial bajo el nombre

de Sporine cuyo principio activo eran las esporas de B. thuringiensis. Angus (1954),
descubre el papel de la toxicidad de las inclusiones paraesporales o cristales de Bt
en larvas del gusano de seda. Un ao ms tarde, Hannay y Fitz (1955) encontraron
que este cuerpo es el resultado de la cristalizacin de la protena que representa
entre el 20 y el 30% de la protena total despus de la lisis celular y la liberacin de
la espora. (Angus 1954, Hannay y Fitz, 1955; citado en Hfte y Whiteley, 1989).

En 1967 Heimpel propuso la nomenclatura oficial de los cristales en donde se

designa las diferentes toxinas de B. thuringiensis y se da el nombre de endotoxina o protena insecticida de cristal (ICP's del ingles, Insecticidal Protein
Crystal). Actualmente se utiliza este trmino para designar el cristal proteico o la
toxina activada (Heimpel, 1967).

Actualmente existen otras designaciones para productos comerciales elaborados

con cepas de B. thuringiensis. Acrobe, Bactospeine, Berliner Dipel, Turilav (var.
Kurstaki), Certan, Xentari (var. aizawai), Javelin, Leptox, Novabac, Teknar, Thuricide
y Victory (var. israelensis) (Whiteley y Schnepf, 1986). Las tpicas formulaciones
agrcolas a base de B. thuringiensis incluyen: polvos, polvos humectables,
granulados y tabletas (Bravo y Cern, 2004).
2.3.2. Clasificacin taxonmica de Bacillus thuringiensis
B. thuringiensis pertenece al orden Eubacteriales, a la familia Bacillaceae, al
Phylum: Firmicutes, a la Clase: Bacilli y al Grupo I del Gnero: Bacillus. Es una
bacteria aerbica, Gram positiva, caracterizada por la produccin de inclusiones
paraesporales durante la fase de esporulacin. Esta inclusin contiene protenas
insecticidas de cristal (ICPSs) (Hofte y Whiteley, 1989), tambin denominadas endotoxinas, las cuales son codificadas por los genes cry (Schnepf et al., 1998). Es

24

el organismo entomopatgeno ms utilizado para el control de insectos plaga en

diversos cultivos comerciales (Lambert y Peferoen, 1992; Schnepf et al., 1998).

Las clulas vegetativas de B. thuringiensis tienen forma de bastn y oscilan entre 1

a 1,2 micras de ancho y de 3 a 5 micras de largo. Los cristales txicos oscilan entre
0,5 a 1 micra de dimetro (Claus y Berkeley, 1986) (Figura 3).

Figura 3. Micrografa de transmisin electrnica de B. thuringiensis.

SP (Espora); PB (Cristal). (De Maagd et al., 2001)

2.3.3. Bacillus thuringiensis en el medio ambiente

B. thuringiensis es una bacteria cosmopolita que se encuentra en ambientes
naturales como suelo, invernaderos, superficies de hojas, conferas e insectos
muertos, pero tambin se encuentra con elevada frecuencia en muestras de agua y
polvo (Martin y Travers, 1989), en diferentes ecosistemas como desiertos, estepas,
bosque tropical hmedo, zona de alta montaa, playas y cuevas. La distribucin de
B. thuringiensis en la naturaleza no es homognea y por lo tanto depende de
condiciones ambientales determinadas. Como el nicho ecolgico de B. thuringiensis
no ha sido determinado, no esta claro si la diversidad del hbitat donde se puede
localizar responde a una amplia versatilidad ecolgica de esta bacteria, o
simplemente esta relacionado con el transporte de las esporas por factores
ambientales (Wasno et al., 1999). B. thuringiensis en diversos estudios ha sido

25

aislada de diferentes ambientes como: suelo (Dulmage y Aizawa, 1982; Martn y

Travers, 1989; Bernhard et al., 1997; Hossain et al., 1997; Bravo et al., 1998;
Arango et al., 2002; Uribe et al., 2003; Citado en Bravo y Cern, 2004); insectos
muertos y sus hbitats (Apoloyo et al., 1995; Bernhard et al., 1997; Chilcot y Wigley,
1993); hojas (Meadows et al., 1992); y otras fuentes naturales (Hegalson et al.,
1998). As mismo la dispersin por el hombre juega un papel importante en este
sentido especialmente por efecto del comercio de productos agrcolas de
almacenamiento (Bravo y Cern, 2004).

B. thuringiensis es un habitante ampliamente distribuido en un gran nmero de

ecosistemas, debido a la produccin de esporas, las cuales pueden permanecer por
periodos de tiempo muy largo en ausencia de humedad y nutrientes. A su vez,
cuando la espora se encuentra en un medio rico que contenga los nutrientes
necesarios puede comenzar nuevamente su crecimiento vegetativo (Martn y
Travers, 1989; Holt et al., 2000), las esporas pueden sobrevivir por algunos aos,
aunque la poblacin y la toxicidad declinen rpidamente (Addison, 1993).
2.4. Intercambio gentico
El intercambio de material gentico entre aislamientos de B. thuringiensis, puede
pensarse como una relacin benfica para la especie, en la medida que aumenta la
capacidad de supervivencia de B. thuringiensis en el ambiente, debido a que
permite incrementar la diversidad de alternativas de este, para acceder a los
recursos disponibles. Sin embargo, existen otras relaciones de antagonismo y
competencia que debe enfrentar B. thuringiensis, las cuales generan prdida de su
capacidad de supervivencia.

Otra consecuencia, de esta alta actividad gentica, es que muchas de las cepas de
B. thuringiensis al producirse intercambio de material gentico, pueden perder los
genes asociados a la formacin de cristales, generando as, gran cantidad de
aislamientos esporogenos acristalferos (Chilcott y Wigley, 1993; Theodoluz et al.,
1997; Bravo et al., 1998), los cuales comnmente son interpretados como

26

microorganismos diferentes y pueden estar llevando a subvalorar la riqueza de B.

thuringiensis en el ambiente (Bravo y Cern, 2004).
2.4.1. Conjugacin
El principal mecanismo de transferencia clula a clula es la conjugacin, que es
una funcin codificada por algunos plsmidos. La conjugacin es un proceso
replicativo y ambas clulas terminan con copias del plsmido.
Los plsmidos realizan su propia transferencia de una clula a otra por contacto y se
llaman conjugativos, pero no todos los plsmidos son conjugativos, debido a que la
transmisibilidad mediante conjugacin est controlada por un conjunto de genes
dentro del plsmido que constituye una regin tra. La presencia de una regin tra
en un plsmido puede tener otra importante consecuencia si el plsmido se integra
en el cromosoma. Entonces, el plsmido puede movilizar la transferencia de DNA
cromosmico de una clula a otra (Madigan et al., 2003).
2.4.2. Intercambio intra e interespecfico
La capacidad de B. thuringiensis de llevar a cabo intercambio intra e interespecfico
de informacin gentica, es realizado mediante un proceso a nivel bacteriano
conocido como conjugacin. El intercambio de material gentico intraespecfico
(entre las diferentes serovariedades de B. thuringiensis) e interespecfico (de B.
thuringiensis a B. cereus, y B. anthracis) ha sido demostrada desde hace casi 20
aos en condiciones artificiales (Battisti et al., 1985; Gonzlez et al., 1982; Reddy et
al., 1987), y ms recientemente en larvas de insectos hospederos.
-

Intercambio intraespecfico: desde el punto de vista ambiental tiene varias

implicaciones, ya que aparentemente es posible realizar intercambio de los
genes codificantes para las protenas que conforman los cuerpos paraesporales,
portadores de las toxinas insecticidas (Bravo y Cern, 2004), lo cual conlleva a
que al menos potencialmente las diferentes cepas de B. thuringiensis estn
ganando o perdiendo las endotoxinas que confieren la capacidad biocida a cada
aislamiento, lo cual adems de modificar el rango de hospederos de una cepa
determinada, puede estar conduciendo hasta la creacin de nuevas -

27

endotoxinas (Aronson et al., 1986). Esto puede explicar de algn modo la

diversidad y la actividad de B. thuringiensis en la naturaleza.
-

Intercambio interespecfico: podra ser la clave para entender aquellos

aislamientos de B. cereus que reaccionan con antgenos H de B. thuringiensis o
viceversa. De esta forma la transferencia de plsmidos interespecfica puede ser
un evento que tericamente se puede dar en la naturaleza, representando un
riesgo ambiental. Sin embargo, hay algunos reportes donde cepas nativas de B.
thuringiensis productoras de -endotoxinas, producen tambin -exotoxina y una
enterotoxina similar a la de Bacillus cereus (Perani et al., 1998). Lo cual sugiere
que es necesario confirmar la ausencia de estas toxinas al momento de
seleccionar una cepa de B. thuringiensis para uso agrcola (Bravo y Cern,
2004).

2.5. Las Delta-endotoxinas

2.5.1. Clasificacin de las -endotoxinas de B. thuringiensis

La importancia de B. thuringiensis como entomopatgeno se debe a que presenta

factores de virulencia que le permiten controlar diferentes organismos.
Estos factores de virulencia son: fosfolipasas, proteasas, quitinasas, -endotoxinas
o exotoxinas termolbiles, -exotoxinas, protenas VIP (Protenas insecticidas que
se forman en la fase vegetativa de crecimiento) y las -endotoxinas (Protenas que
se acumulan en la fase de esporulacin formando cristales paraesporales).
Las -endotoxinas se clasifican en dos grupos: las protenas Cry y Cyt. Una protena
Cry se define como cualquier protena paraesporal de B. thuringiensis que muestre
un efecto txico hacia algn organismo, demostrable por medio de bioensayos o
cualquier protena que muestre similitud de secuencia con las protenas Cry
descritas hasta el momento (Bravo, 1998; Crickmore et al., 1998); las protenas Cyt
se definen como protenas paraesporales de B. thuringiensis que muestran actividad

28

citoltica o que presentan similitud con la secuencia de algunas protenas Cyt

conocidas (Crickmore et al., 1998).

En la actualidad se conocen 424 protenas Cry, clasificadas en 55 familias y 121

subgrupos, lo que demuestra la gran diversidad de estos genes. Entre estos, los
genes cry1 son los ms frecuentes en todo el mundo, con variaciones entre
diferentes regiones (Wang et al., 2003). Existen 42 subgrupos que presentan
actividad txica frente a insectos lepidpteros. Adems 6 protenas a las que no se
le ha dado un nombre especfico debido a que no hay conocimiento suficiente de las
secuencias (Crickmore, 2008) (Tabla 1).
Tabla 1. Proteinas Cry y Cyt producidas por las diferentes variedades de B. thuringiensis.
(Crickmore, 2008).
Nombre

Nombre

N de

del gen

anterior

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Cepa Fuente

Cry1Aa15

DQ062690

Sauka et al

2005

Bt INTA Mol-12

Cry1Ab22

ABW87320

Wu and Feng

2008

BtS2491Ab

DQ781309

Lin and Fang

2006

Bt ly4a3

Cry1Ac23

AM949588

Kashyap et al

2008

Bt

Cry1Ad2

A27531

1995

Bt PS81RR1

Cry1Ablike

Cry1Ae1

CryIA(e)

M65252

Lee & Aronson

1991

Bt alesti

Cry1Af1

U82003

Kang et al

1997

Bt NT0423

Cry1Ag1

AF081248

Mustafa

1999

Cry1Ah2

DQ269474

Qi et al

2005

Bt alesti

Cry1Ai1

AY174873

Wang et al

2002

Cry1A-like

AF327927

Nagarathinam et al

2001

Bt kunthala nags3

Cry1Ba5

ABO20894

Song et al

2007

Bt sfw-12

L32020

Donovan et al

1994

Bt EG5847

Cry1Bd2

AY138457

Isakova et al

2002

Bt 834

Cry1Be2

AAQ52387

Baum et al

2003

Cry1Bf2

AAQ52380

Baum et al

2003

Cry1Bg1

AY176063

Wang et al

2002

Cry1Ca11

AY955268

Cai et al

2005

Bt C-33

Cry1Cb3

EU679502

Huang et al

2008

Bt087

AAX63901

Thammasittirong et al

2005

Bt TA476-1

Cry1Bb1

Cry1Cblike

ET5

29

Cry1Da2

I76415

Payne & Sick

1997

Cry1Db2

AF358862

Li et al

2001

Cry1Dc1

EF059913

Lertwiriyawong et al

2006

Cry1Ea8

ABX11258

Huang et al

2007

Bt HZM2

Cry1Eb1

Bt B-Pr-88

M73253

Payne & Sick

1993

Bt aizawai PS81A2

Cry1Fa2

M73254

Payne & Sick

1993

Bt aizawai PS81I

Cry1Fb7

EU679501

Huang et al

2008

Bt087

Cry1Ga2

Y09326

Shevelev et al

1997

Bt wuhanensis

Cry1Gb2

AF288683

Li et al

2000

Bt B-Pr-88

Cry1Gc

AAQ52381

Baum et al

2003

Z22513

Lambert

1993

Bt BTS02069AA

Cry1Hb1

U35780

Koo et al

1995

Bt morrisoni BF190

Cry1H-like

AF182196

Srifah et al

1999

Bt JC291

Cry1Ia13

ABF83202

Martins et al

2006

Bt

Cry1Ib3

EU677422

Liu et al

2008

Bt GS8

Cry1Ic2

AAE71691

Osman et al

2001

Cry1Id1

AF047579

Choi

2000

Cry1Ie1

AF211190

Song et al

2000

Cry1If1

AAQ52382

Baum et al

2003

Cry1I-like

DQ781310

Lin & Fang

2006

Bt ly4a3

L32019

Donovan et al

1994

Bt EG5847

Cry1Ha1

Cry1Ja1

CryIE(b)

PrtC

ET4

Cry1Jc1

Bt BTC007

AAQ52372

Baum et al

2003

Cry1Jd1

AX189651

Arnaut et al

2001

Cry1Ka1

U28801

Koo et al

1995

Bt morrisoni BF190

Cry1La1

AAS60191

Je et al

2004

Bt kurstaki K1

Cry1-like

I90729

Payne et al

1998

Cry2Aa12

DQ977646

Tan et al

2006

Bt Rpp39

Cry2Ab12

ABM21764

Lin et al

2007

Bt LyD

Cry2Ac12

AM689532

Saleem & Shakoori

2007

Bt CMBL-BT3

Cry2Ad5

AM765844

Saleem et al

2007

Bt HD29

Cry2Ae1

AAQ52362

Baum et al

2003

Cry2Af1

EF439818

Beard et al

2007

Bt C81

Cry3Aa12

ABY49136

Sezen et al

2008

Bt tenebrionis

Cry3Ba2

A07234

Peferoen et al

1990

Bt PGSI208

Cry3Bb3

I15475

Peferoen et al

1995

X59797

Lambert et al

1992

Bt kurstaki BtI109P

Cry4Aa3

AL731825

Berry et al

2002

Bt israelensis

Cry4a-like

DQ078744

Mahalakshmi et al

2005

Bt LDC-9

Cry4Ba5

AL731825

Berry et al

2002

Bt israelensis

Cry3Ca1

CryIIID

30

cRY4Balike
Cry4Ca1

ABC47686

Mahalakshmi et al

2005

EU646202

Shu et al

2008

Narva et al

1994

Bt darmstadiensis PS17
Bt darmstadiensis PS17

Cry5Aa1

CryVAa

L07025

Cry5Ab1

CryVAb

Bt LDC-9

L07026

Narva et al

1991

Cry5Ac1

I34543

Payne et al

1997

Cry5Ad|1

EF219060

Lenane et al

2007

Bt L355

Cry5Ba2

EU121522

Sun et al

2008

YBT 1518

Cry6Aa3

DQ835612

Jia et al

2006

Bt 96418

Cry6Ba1

CryVIB

L07024

Narva et al

1991

Bt PS69D1

Cry7Aa1

CryIIIC

M64478

Lambert et al

1992

Bt galleriae PGSI245

Cry7Ab4

EU380678

Shu et al

2008

Bt

Cry7Ba1

ABB70817

Zhang et al

2006

Bt huazhongensis

EF486523

Gao et al

2007

Bt BTH-13

U04364

Narva & Fu

1992

Bt kumamotoensis

EU044830

Cheng et al

2007

Bt B-JJX

U04365

Narva & Fu

1993

Bt kumamotoensis

Cry8Bb1

AX543924

Abad et al

2002

Cry8Ca2

AAR98783

Song et al

2004

Bt HBF-1

Cry8Da3

BD133575

Asano et al

2002

Bt

Cry8Db1

AB303980

2007

Bt BBT2-5

Cry8Ea2

EU047597

Liu et al

2007

Bt B-DLL

Cry8Ga2

DQ318860

Yan et al

2005

Bt 145

Cry8Ha1

EF465532

Fuping et al

2006

Bt 185

Cry8Ia1

EU381044

Yan et al

2008

Bt su4

Cry8 like

ABS53003

Mangena et al

2007

Bt

Cry9Aa2

X58534

Gleave et al

1992

Bt DSIR517

AAQ52376

Baum et al

2003

Cry7Ca1
Cry8Aa1

CryIIIE

Cry8Ab1
Cry8Ba1

CryIIIG

Cry9Aa
like
Cry9Ba1

Yamaguchi and
Asano

X75019

Shevelev et al

1993

Bt galleriae

Cry9Bb1

AY758316

Silva-Werneck et al

2004

Bt japonensis

Cry9Ca2

AAQ52375

Baum et al

2003

Cry9Da2

AF042733

Wasano & Ohba

1998

Bt japonensis

Cry9Db1

AY971349

Flannagan et al

2005

Bt kurstaki DP1019

Cry9Ea3

EF157307

Lin et al

2006

Cry9Eb1

AX189653

Arnaut et al

2001

Cry9Ec1

AF093107

Wasano & Ohba

2003

Bt galleriae

Cry9Ed1

AY973867

Flannagan et al

2005

Bt kurstaki DP1019

CryIX

31

Cry9 like

AF093107

Wasano et al

1998

Bt galleriae

Cry10Aa3

AL731825

Berry et al

2002

Bt israelensis

DQ167578

Mahalakshmi et al

2006

Bt LDC-9

AL731825

Berry et al

2002

Bt israelensis

DQ166531

Mahalakshmi et al

2007

Bt LDC-9

Cry11Ba1

X86902

Delecluse et al

1995

Bt jegathesan 367

Cry11Bb1

AF017416

Orduz et al

1998

Bt medellin

Cry10A
like
Cry11Aa3
Cry11Aalike

Cry12Aa1

CryVB

L07027

Narva et al

1991

Bt PS33F2

Cry13Aa1

CryVC

L07023

Narva et al

1992

Bt PS63B

Cry14Aa1

CryVD

U13955

Narva et al

1994

Bt sotto PS80JJ1

M76442

Brown & Whiteley

1992

Bt thompsoni

Cry15Aa1
Cry16Aa1

cbm71

X94146

Barloy et al

1996

Cb malaysia CH18

Cry17Aa1

cbm72

X99478

Barloy et al

1998

Cb malaysia CH18

Cry18Aa1

CryBP1

X99049

Zhang et al

1997

Paenibacillus popilliae

Cry18Ba1

AF169250

Patel et al

1999

Paenibacillus popilliae

Cry18Ca1

AF169251

Patel et al

1999

Paenibacillus popilliae

Cry19Aa1

Y07603

Rosso & Delecluse

1996

Bt jegathesan 367

Cry19Ba1

D88381

Hwang et al

1998

Bt higo

Cry20Aa1

U82518

Lee & Gill

1997

Bt fukuokaensis

Cry21Aa2

I66477

Feitelson

1997

Cry21Ba1

AB088406

Sato & Asano

2002

Bt roskildiensis

Cry22Aa2

AX472772

Isaac et al

2002

Bt

Cry22Ab2

AX472764

Isaac et al

2002

Bt

Cry22Ba1

AX472770

Isaac et al

2002

Bt

Cry23Aa1

AAF76375

Donovan et al

2000

Bt

Cry24Aa1

U88188

Kawalek and Gill

1998

Bt jegathesan

Cry24Ba1

BAD32657

Ohgushi et al

2004

Bt sotto

Cry24Ca1

AM158318

Beron & Salerno

2005

Bt FCC-41

Cry25Aa1

U88189

Kawalek and Gill

1998

Bt jegathesan

Cry26Aa1

AF122897

Wojciechowska et al

1999

Bt finitimus B-1166

Cry27Aa1

AB023293

Saitoh

1999

Bt higo

Cry28Aa2

Bt finitimus

AF285775

Moore and Debro

2000

Cry29Aa1

AJ251977

Delecluse et al

2000

Cry30Aa1

AJ251978

Delecluse et al

2000

Cry30Ba1

BAD00052

Ikeya et al

2003

Bt entomocidus

Cry30Ca1

BAD67157

Ohgushi et al

2004

Bt sotto

Cry30Da1

EF095955

Shu et al

2006

Bt Y41

32

Cry30Ea1

EU503140

Fang et al

2007

Cry31Ab2

AB274825

Yasutake et al

2006

Bt 31-5

Cry31Ac1

AB276125

Yasutake et al

2006

Bt 87-29

Cry32Aa1

AY008143

Balasubramanian et al

2001

Bt yunnanensis

BAB78601

Takebe et al

2001

Bt

Cry32Ba1

CryE6L

Cry32Ca1

CryE6Q

BAB78602

Takebe et al

2001

Bt

Cry32Da1

CryE6S

BAB78603

Takebe et al

2001

Bt

Cry33Aa1

AAL26871

Kim et al

2001

Bt Dakota

Cry34Aa4

AY536897

Schnepf et al

2004

Bt PS185GG

Cry34Ab1

AAG41671

Moellenbeck et al

2001

Bt PS149B1

Cry34Ac3

AY536896

Schnepf et al

2004

Bt KR1369

Cry34Ba3

AY536898

Schnepf et al

2004

Bt PS201HH2

Cry35Aa4

AY536892

Schnepf et al

2004

Bt PS185GG

Cry35Ab3

AY536891

Schnepf et al

2004

Bt KR1369

Cry35Ac1

AAG50117

Ellis et al

2001

Bt PS167H2

Cry35Ba3

AY536893

Schnepf et al

2004

Bt PS201HH2

Cry36Aa1

AAK64558

Rupar et al

2001

Bt

Cry37Aa1

AAF76376

Donovan et al

2000

Bt

Cry38Aa1

AAK64559

Rupar et al

2000

Bt

Cry39Aa1

BAB72016

Ito et al

2001

Bt aizawai

Cry40Aa1

BAB72018

Ito et al

2001

Bt aizawai

Cry40Ba1

BAC77648

Ito et al

2003

Bun1-14

Cry40Ca1

EU381045

Shu et al

2008

Bt Y41

Cry40Da1

EU596478

Fang et al

2008

Bt

Cry41Aa1

AB116649

Yamashita et al

2003

Bt A1462

Cry41Ab1

AB116651

Yamashita et al

2003

Bt A1462

Cry42Aa1

AB116652

Yamashita et al

2003

Bt A1462

Cry43Aa2

AB176668

Nozawa

2004

P. popilliae popilliae

Cry43Ba1

AB115422

Cry43-like

AB115422

Cry44Aa

BAD08532

Ikeya et al

2004

Bt entomocidus INA288

Cry45Aa

BAD22577

Okumura and Saitoh

2004

Bt 89-T-34-22

Cry46Aa

BAC79010

Ito et al

2004

Bt Dakota

Cry46Ab

BAD35170

Yamagiwa et al

2004

Bt

Cry47Aa

AY950229

Kongsuwan et al

2005

Bt CAA890

Cry48Aa3

AM237206

Jones and Berry

2006

Bs NHA15b

Cry48Ab2

AM237208

Jones and Berry

2006

Bs 2173

Yokoyama and
Tanaka
Yokoyama and
Tanaka

33

2003

2003

P. lentimorbus
semadara
P. lentimorbus
semadara

Cry49Aa4

AM237204

Jones and Berry

2006

Bs 2173

Cry49Ab1

AM237202

Jones and Berry

2006

Bs LP1G

Cry50Aa1

AB253419

Ohgushi et al

2006

Bt sotto

Cry51Aa1

DQ836184

Meng et al

2006

Bt F14-1

Cry52Aa1

Bt Y41

EF613489

Song et al

2007

Cry53Aa1

EF633476

Song et al

2007

Bt Y41

Cry54Aa1

EU339367

Tan et al

2007

Bt MC28

Cry55Aa1

EU121521

Sun et al

2008

YBT 1518

Cyt1Aa6

ABC17640

Zhang et al

2005

Bt LLP29

ABB01172

Mahalakshmi

2007

Bt LDC-9

Cyt1Ab1

X98793

Thiery et al

1997

Bt medellin

Cyt1Ba1

U37196

Payne et al

1995

Bt neoleoensis

Cyt1Ca1

AL731825

Berry et al

2002

Bt israelensis

2001

Bt darmstadiensis73E10

Cyt1Aalike

Promdonkoy &

Cyt2Aa2

AF472606

Cyt2Ba9

AL731825

Berry et al

2002

Bt israelensis

ABE99695

Mahalakshmi et al

2007

Bt LDC-9

Cyt2Bc1

CAC80987

Delecluse et al

1999

Bt medellin

Cyt2B-like

DQ341380

Zhang et al

2005

Cyt2Ca1

AAK50455

Baum et al

2001

Cyt2Balike

Panyim

Bt

2.5.2. Genes que codifican protenas con actividad insecticida

Las protenas Cry son toxinas modulares que presentan actividades toxicas
altamente especficas para diferentes tipos de insectos. En la tabla 2 se presentan
31 protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto susceptible.

34

Tabla 2. Protenas Cry con actividad especfica contra un orden de insecto.

(Barloy et al., 1996; Zhang et al., 1997)

PROTENA

ORGANISMOS SUSCEPTIBLES

Cry1

Lepidpteros, algunas presentan actividad dual

Cry2

Actividad dual frente a lepidpteros y dpteros

Cry3

Colepteros

Cry4

Dpteros

Cry5

Nematodos, caros himenpteros

Cry6

Nematodos, caros

Cry7

Colepteros

Cry8

Dual colepteros y fidos

Cry9

Lepidpteros

Cry10

Dpteros

Cry11

Dpteros

Cry12

Dual dpteros y colepteros

Cry13

Nematodos

Cry14

Dpteros y colepteros

Cry15

Lepidpteros

Cry16

Dpteros

Cry17

Dpteros

Cry18

Colepteros

Cry19

Dpteros

Cry20

Dpteros

Cry21

Nematodos

Cry22

Himenpteros

Cry23

Colepteros

Cry24

Dpteros

Cry25

Dpteros

Cry26

Dpteros

Cry27

Dpteros

Cry28

Dpteros

Cry29

Dpteros

Cry30

Dpteros

Cry31

Dpteros

35

2.5.3. Organizacin y estructura tridimensional de las protenas Cry

Existen algunas regiones altamente conservadas a nivel de secuencia primaria entre
las protenas Cry, denominadas los 5 bloques conservados, que se localizan en la
regin que codifica para la toxina. La mayora de las protenas Cry se producen
como protoxinas de un tamao de 130-140 kDa (Hfte y Whiteley, 1989). Sin
embargo, Schnepf et al. (1998), describieron otros tres bloques conservados
localizados en la regin de la protoxina.

Los 5 bloques conservados de la estructura primaria de las protoxinas estn

localizados en regiones muy importantes dentro de la estructura tridimensional, y
estas corresponden a las regiones internas de los Dominios (Figura 4).

Figura 4. Estructura tridimensional de protena Cry1Aa.

I: Dominio I; II Dominio II; III Dominio III (De Maagd et al., 2001)

Las toxinas Cry presentan una organizacin similar entre ellas, compuesta de tres
dominios estructuralmente conservados: dominio I, II y III. Con base en estos
dominios se han llevado a cabo diferentes estudios de relaciones filogenticas de
las toxinas Cry, indicando un porcentaje de identidad no muy alto y diferente
especificidad a insectos (De Maagd et al., 2001) (Figura 4).

36

El dominio I, consiste en 7 hlices, donde una hlice esta rodeada por otras seis,
las cuales son anfipticas, su funcin est relacionada con la formacin del poro en
la membrana del insecto susceptible. Est formada aproximadamente por los
primeros 250 aminocidos de la toxina (De Maagd et al., 2003; Li et al., 1991;
Schneph et al., 1998).
El Dominio II, tambin llamado prisma est formado por tres lminas de estructura
simtricos anti paralelos, el cual participa en la interaccin con el receptor siendo
un factor importante de la especificidad. Est formado por aproximadamente los 300
aminocidos siguientes al dominio I (De Maagd et al., 2003; Jurat-Fuentes y Adang,
2001; Schnepf et al., 1998).
El Dominio III, es similar a un sandwich, al parecer est involucrado con la
especificidad, y tambin participa en la proteccin ocasionada por proteasas
intestinales, adems reconoce al receptor y acta en la ligacin (Burton et al., 1999;
De Maagd et al., 2003; Flores et al., 1997; Masson et al., 1998).

Este anlisis ha permitido distinguir 3 subgrupos de protenas Cry. Un primer

subgrupo est integrado por las clases Cry1, Cry3, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10,
Cry16, Cry17, Cry19 y Cry20 que se caracterizan por tener los 5 bloques
conservados en la regin de la toxina. Un segundo grupo est formado por las
clases Cry5, Cry12, Cry13, Cry14 y Cry22. Ests toxinas se caracterizan por tener
regiones homlogas a los bloques 1,2,3,4 y 5, sin embargo, el bloque conservado 3
presenta una homologa muy baja. El tercer subgrupo est integrado por las clases
Cry2, Cry11, Cry18, estas toxinas poseen el bloque conservado 1 y presentan una
variante del bloque 2 pero carecen de los bloques 4 y 5. Nuevas investigaciones
agrupan a las protenas Cry1, Cry4, Cry7, Cry8, Cry9, Cry5, Cry12, Cry14 y Cry21
(Figura 5).

37

Figura 5. Alineamiento de las protenas Cry que revela la posicin de los 5 bloques conservados.
Dominio I involucrado en la formacin del poro en la membrana de las clulas del insecto susceptible;
Dominio II participan en la interaccin con el receptor siendo un determinante importante de la
especificidad; Dominio III reconocimiento al receptor y ligacin (De Maagd et al., 2003).

2.5.4. Mecanismo de accin de las protenas insecticidas de cristal (ICPs)

Los estudios sobre el mecanismo de accin de las ICPs de B. thuringiensis, es
actualmente el rea donde se realiza mayor investigacin ya que se considera que
si este aspecto se llega a conocer en detalle, se podrn disear mejores
bioinsecticidas, ms txicos y de espectro de accin ms amplio (Figura 6).

38

Figura 6. Mecanismo de accin de las -endotoxinas.

1. Los insectos susceptibles consumen follaje tratado con B. thuringiensis. 2. Dentro de minutos la
toxina se liga al receptor especfico en la pared del intestino y el insecto detiene el alimento. 3. Dentro
de horas, por los agujeros de la pared del intestino, las esporas y bacterias del intestino entran en la
cavidad del cuerpo; la toxina se disuelve. 4. De 1-2 das, el insecto, muere de septicemia ya que las
esporas y las bacterias del intestino proliferan en su sangre. (Watkinson, 1994; De Maagd et al., 2001).

Las toxinas Cry difieren de las toxinas Cyt en su mecanismo de accin. Una vez el
insecto susceptible ingiere el cristal este se solubiliza en el ambiente alcalino y
reductor del intestino medio. Como la mayor parte de las protenas Cry se producen
como protoxinas, estas son activadas por accin de las proteasas (tripsina,
quimiotripsina, termolisina y catepsinas) del intestino medio de los insectos (Bravo et
al., 2002). Luego, las protenas activas se unen a sitios especficos localizados en
las microvellosidades apicales del intestino medio. (Rukmini et al., 2000; Aronson y
Shai, 2001). Una vez la toxina se encuentra activa, se inserta en la membrana como
consecuencia de un cambio conformacional drstico disparado por el receptor y
forma poros los cuales alteran el equilibrio de electrlitos y agua, interfiriendo en el
metabolismo celular normal. Diversos estudios han encontrado que las toxinas Cry
aumentan la permeabilidad de la microvellosidad apical tanto para cationes

39

monovalentes como para divalentes, aniones, agua y molculas de mayor tamao.

Esto causa tambin que colapse la diferencia de potencial y por tanto se pierda la
fuerza motriz que dirige la entrada de aminocidos al interior celular, as como la
redistribucin de los cationes entre el lmen y el citoplasma, obteniendo como
consecuencia la alcalinizacin del citoplasma y destruccin de las clulas
columnares y caliciformes (De Maagd et al., 2001). Al destruirse las clulas, las
esporas de B. thuringiensis tienen acceso a la hemolinfa del insecto y proliferan
dentro de esta (Van Rie et al., 1989; Knowles, 1993; De Maagd et al., 2001);
provocando en la larva parlisis del tracto digestivo, cese de la ingesta y por ltimo,
su muerte (Schnepf et al., 1998; Griffitts et al., 2005) (Figura 6).

Generalmente es asumido que los dems tipos de ICP`s emplean esencialmente la

misma ruta que las protenas Cry1. Por ejemplo muchos de los pasos anotados
arriba han sido observados en el caso de la toxina Cry3Aa. (Koller et al., 1992).
2.5.5. Aplicaciones biotecnolgicas
Entre las formulaciones biolgicas utilizadas para el control de insectos plaga en la
agricultura, se destaca B. thuringiensis (Hofte y Whiteley, 1989). La mayora de los
bioinsecticidas a base de B. thuringiensis son producidos utilizando aislamientos
nativos, y utilizan solo una pequea fraccin de las protenas Cry conocidas. La
manipulacin de los genes cry en B. thuringiensis ofrece un potencial en el
mejoramiento de la efectividad y la relacin costo beneficio de los productos a base
de B. thuringiensis.

B. thuringiensis es la bacteria entomopatgena ms ampliamente utilizada como

biopesticida, en la proteccin de especies vegetales, agricultura comercial y contra
dpteros vectores de enfermedades humanas (Clive, 2006). Desde que ocurri la
primera clonacin de un gen cry, que codifica para protenas insecticidas en Bt
(Schnepf y Whiteley, 1985) se han aislado muchos otros genes por lo cul se ha
establecido una clasificacin basada en la secuencia de la protena (Crickmore et
al., 1998).

40

Otra de las aplicaciones de B. thuringiensis es en cultivos biotecnolgicos. Hasta el

2006, de los 22 pases productores de transgnicos (Tabla 3), 11 constituyeron
pases industrializados, y 11 pases envas de desarrollo. Estos fueron, en orden de
hectreas de superficie: Estados Unidos, Argentina, Brasil, Canad, India, China,
Paraguay, Sudfrica, Uruguay, Filipinas, Australia, Rumania, Mxico, Espaa,
Colombia, Francia, Irn, Honduras, Repblica Checa, Portugal, Alemania y
Eslovaquia. Cabe notar que los primeros ocho pases de la lista cultivaron ms de
un milln de hectreas cada uno, lo que constituye una base amplia y estable para
la futura adopcin mundial de los cultivos biotecnolgicos.

En 2008, 13,3 millones de agricultores cultivaron 125 millones de hectreas con

variedades transgnicas. El aumento de hectreas cultivadas en 2008 supuso un
9,4% respecto a 2007.

Lo ms remarcable de 2008 es el comienzo de los cultivos biotecnolgicos en

pases africanos como Egipto y Burkina Faso. frica es considerada la barrera final
para los cultivos biotecnolgicos y quizs es el continente que puede verse ms
beneficiado por ellos. En 2008 se cultivaron en Egipto 700 hectreas de maz Bt y
en Burkina Faso se cultivaron 8.500 hectreas de algodn Bt. A estos dos pases se
une Sudfrica, donde se vienen cultivando desde 1998 algodn, maz y soja
genticamente modificados.

Las cosechas biotecnolgicas han hecho dos contribuciones importantes a la

seguridad global alimentaria. Primero han incrementado la productividad, lo que
aumenta asimismo la accesibilidad a los alimentos. Segundo, han reducido los
costos de produccin, lo que en ltima instancia ayuda a reducir los precios de los
alimentos. En 2050 9.200 millones de personas necesitarn comer. En este
escenario la biotecnologa juega un papel fundamental en satisfacer las
necesidades crecientes de alimentos.

Por esta razn, la adherencia a prcticas agrcolas adecuadas para los cultivos
transgnicos continuar a siendo tan importante como lo ha sido durante la primera
dcada, y una administracin responsable continuada tendr que ser ejercida, sobre

41

todo por los pases del Sur que sern los mayores productores de cultivos
transgnicos durante la prxima dcada (Clive, 2006).
Tabla 3. Superficie global de cultivos transgnicos en 2006: por pas (millones de hectreas)

2.6. Tcnicas moleculares

Dadas las caractersticas de B. thuringiensis como agente de control biolgico se ha
intensificado la bsqueda y establecimiento de colecciones de B. thuringiensis a
nivel mundial. El poder caracterizar dichas colecciones y encontrar nuevas endotoxinas ofrecen una alternativa para el control de insectos plaga en cultivos
econmicamente importantes. En este sentido es fundamental contar con un
sistema de anlisis que permita identificar cepas de B. thuringiensis que porten
genes ya conocidos o protenas conocidas, de aquellos que portan genes
completamente nuevos.

Entre los mtodos usados para la caracterizacin de B. thuringiensis se incluyen

electroforesis de protenas (SDS-PAGE) y caracterizacin molecular mediante PCR.

42

2.6.1. Electroforesis de protenas (SDS-PAGE):

La electroforesis en gel denaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE), es una
herramienta analtica y preparativa para la ciencia de las protenas, puede ser
utilizada para separar y comparar mezclas complejas de protenas, evaluar la
pureza de una protena durante el curso de su aislamiento, y proveer estimaciones
de caractersticas fsicas como la composicin de sus subunidades, punto
isoelctrico, peso molecular y carga. Por medio, del mtodo SDS-PAGE, las
protenas migran en respuesta a un campo elctrico a travs de poros en la matriz o
gel, la dimensin del poro, carga, forma y tamao, son factores que determinan la
migracin y la separacin de protena, que se basa en el peso molecular mientras
migran a travs del gel de poliacrilamida hacia el nodo.

Las protenas presentan una carga elctrica neta, si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es
proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor
carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin. La migracin de las
protenas no solo es proporcional a la carga neta sino tambin al tamao y forma de
las protenas (Laemmli et al., 1970; Sambrook et al., 2001).
2.6.2. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los avances en Biologa molecular han permitido desarrollar mtodos basados en
estudios de ADN capaces de diferenciar entre cepas cercanas con capacidad de ser
empleadas en control biolgico de plagas. Estos mtodos pueden ser empleados
para identificar la presencia o ausencia de genes especficos de -endotoxinas
(Bravo y Cern, 2004).

Una de estas tcnicas es la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), esta

tcnica fue descrita por Kary Mullis y colaboradores en 1980; la PCR es un mtodo
rpido y sencillo que puede amplificar fragmentos especficos de ADN a partir de
cantidades mnimas del ADN original. La PCR, es una tcnica que sirve para la
amplificacin in vitro de secuencias de ADN especficas, razn por la cual tambin

43

se le denomina clonacin acelular. La amplificacin del ADN se logra mediante la

extensin de oligonucletidos que son complementarios a secuencias situadas
hacia los dos extremos 3 del segmento bicaternario que se pretende amplificar
(Puerta y Uruea, 2005).

Por otra parte, se encuentra la PCR mltiple (M-PCR), que es un tipo especial de
PCR, donde se amplifica ms de una secuencia blanco, esto se logra agregando en
la reaccin ms de un par de oligonucletidos. Tiene la ventaja de ahorrar tiempo y
esfuerzo sin comprometer la efectividad de la prueba. Las condiciones de M-PCR se
asocian a la compatibilidad entre los oligonucletidos dentro de la reaccin y la no
interferencia son de gran importancia en esta tcnica. La M-PCR, debe evitar el uso
de oligonucletidos anidados, es decir, que requieren una segunda ronda de
amplificacin, debido, a que se pueden presentar falsos positivos, consecuencia de
la contaminacin generada (Elnifro et al., 2000). En la identificacin de B.
thuringiensis, la M-PCR, utiliza una mezcla de oligonucletidos que amplifiquen
fragmentos especficos de cada gen, que codifican las -endotoxinas (Cern et al.,
1994; Cern et al., 1995). Con los oligonucletidos especficos y la M-PCR se
pueden detectar directamente los genes cry conocidos de B. thuringiensis (Song et
al., 2003).

Ambas, tcnicas involucran la preparacin de ADN, la mezcla de oligonucletidos y

la deteccin de los productos de reaccin por medio de la repeticin de un ciclo
formado por tres etapas:
1. Desnaturalizacin del ADN de doble cadena: La doble hlice de ADN se
separa en dos hebras, para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas T
que oscilan entre 93-97C, de esta forma las cadenas se torna accesibles al
oligonucletido.
2.

Hibridacin:

Los

oligonucletidos

se

unen

hibridan

las

zonas

3complementarias logrando identificar la zona que se quiere amplificar, esto se

logra cuando la reaccin se enfra a temperaturas de 50-65C.

44

3. Elongacin o Extensin: En la tercera etapa se produce la sntesis de una

cadena

sencilla

producindose

un

fragmento

de

doble

cadena

por

la

complementariedad en la direccin 5a 3 mediante la enzima ADN polimerasa, la

cual incorpora los deoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la
cadena molde.

El proceso entero se repite una y otra vez, por lo que se dice que es un mtodo
repetitivo del mismo ciclo. Los componentes de ambas reacciones se presentan en
la tabla 4, se observan las condiciones que se emplean en PCR y PCR mltiple
Tabla 4. Condiciones empleadas en PCR y PCR mltiplex (Elnifro et al., 2000)
VARIABLES

PCR

PCR MULTIPLEX

MgCl2 mM

1.5

1.5

0.1-0.5

0.1-0.2

Buffer 1X

dNTPs M

200

200

Taq polimerasa U

2.5

1.25-2.5

Oligonucletidos
M

En cuanto a la cantidad y calidad de ADN son parmetros crticos en la reaccin de

PCR. La presencia de sustancias como SDS, etanol y urea pueden inhibir la accin
de la Taq polimerasa (Puerta y Uruea, 2005; Sambrook et al., 2001)

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es una herramienta que permite

identificar los genes especficos de diferentes cepas de B. thuringiensis, tambin
puede identificar nuevos genes cry que pueden ser efectivos contra una
determinada plaga (Arango et al., 2002), la identificacin de los genes codificantes
para -endotoxinas de B. thuringiensis por PCR, ha demostrado ser una
metodologa til y sensible, que permite distinguir su posible actividad biolgica
evitando emplear mltiples bioensayos, y la presencia de regiones conservadas y
variables en la secuencia de los genes cry ha facilitado el reconocimiento de familias
y sub familias que poseen generalmente el mismo espectro insecticida (JurezPrez, 2004).

45

3. FORMULACIN DEL PROBLEMA

El cogollero del tomate (Tuta absoluta) afecta la calidad del cultivo de tomate
causando prdidas entre un 40%-100% (Giustolin et al., 2001). Las perdidas
econmicas por Tuta absoluta

pueden llegar a ser muy altas entre 60-100%

(Niedmann et al., 2006).

Tuta absoluta tambin ataca hojas de papa, tabaco, pepino dulce y berenjena como
tambin especies silvestres de la familia solancea, el dao caracterstico en hojas
es el consumo total del mesfilo, dejando solo la epidermis por lo que la hoja
atacada se ve transparente. En frutos produce galeras y perforaciones, que los
hace perder su valor comercial (Estay, 2000). En Colombia las prdidas
ocasionadas por Tuta absoluta en plantas de tomate pueden llegar al 27 y 43% del
total de la produccin (Cely et al., 2006).

Para el manejo sanitario de esta plaga los cultivadores utilizan grandes cantidades
de agroqumicos, que adems de encarecer los costos de produccin, causan serios
daos al medio ambiente y pueden contaminar el producto, produciendo riesgos
sobre la salud de los consumidores y de los productores. Adicionalmente, los
insecticidas qumicos convencionales desarrollan altos niveles de resistencia
produciendo un problema ambiental grave.

46

4. JUSTIFICACIN

El tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) es uno de los cultivos ms importantes

en Colombia, esta hortaliza presenta gran demanda en la dieta alimenticia y genera
empleo e ingresos, no slo en el campo, sino tambin en la agroindustria. Las
variedades ms cultivadas son Milano y Chonto que crecen entre 600 y 1.200
m.s.n.m. Los principales departamentos productores de tomate son Cundinamarca,
Santander, Valle, Caldas, Huila, Risaralda, Boyac, Antioquia, Atlntico y Guajira
(Corporacin Colombia Internacional, 2006).

Tuta absoluta es uno de los principales insectos plaga ms devastador en plantas

de tomates Lycopersicum esculentum Mill. En Suramrica (Suinaga et al., 1999,
Torres et al., 2001), causando prdidas entre 50-100% de los cultivos. Es una polilla
pequea que tiene distribucin neotrpical (Razuri y Vargas, 1975; Moore, 1983;
Souza y Reis 1986) e infecta hojas, frutos, flores y tallos de la planta. El dao es
ocasionado cuando las larvas del insecto se alimentan del mesfilo de las hojas,
haciendo minas y afectando la capacidad fotosinttica de la planta, reduciendo la
produccin. Sin embargo, las larvas tambin pueden penetrar el fruto causando
rigurosas prdidas (Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria
CORPOICA, 2008).

Los insecticidas qumicos utilizados para el control de las plagas agrcolas, estn
produciendo una gran controversia, ya que generan el desarrollo de resistencia en
insectos, eliminacin de la fauna benfica, contaminacin de las fuentes de agua,
presencia de residuos txicos en los alimentos y el aumento en los costos de
produccin. En su lugar, desde hace algunos aos se promueven nuevas soluciones
que incluyen el empleo de agentes de control biolgico (Soberon y Bravo, 2000)
dentro de programas de manejo integrado de plagas, para el mejoramiento de la
produccin agrcola.

Dentro de estos programas se encuentra Bacillus thuringiensis una bacteria

entomopatgena, aerbica, Gram positiva que lidera el mercado mundial de

47

bioplagicidas desde hace mas de 50 aos (Schnepf et al., 1998). B. thuringiensis

posee alta especificidad sobre larvas de insectos de los ordenes lepidptera,
dptera, coleptera (Hofte y Whiteley, 1989), recientemente himenptera, hemiptera,
malfaga, ortptera, y otros grupos de organismos como nematodos, caros,
protozoarios (Feitelson, 1993), babosas y caracoles (Gao et al., 2008). Adems
otras toxinas no insecticidas ni hemolticas que presenta B. thuringiensis han
mostrado actividad sobre clulas cancergenas humanas. (Li et al., 2000; Mizuki et
al., 2000; Akio et al., 2004). B. thuringiensis es altamente inocuo para plantas,
mamferos, aves, anfibios y reptiles e inclusive otros insectos benficos (Akio et al.,
2004)

En la actualidad se conocen 424 genes cry, clasificados en 55 familias y 121

subgrupos, lo que demuestra la gran diversidad de estos genes. Los genes cry1,
son los ms frecuentes en todo el mundo, con variaciones entre diferentes regiones,
y codifican toxinas activas contra insectos lepidpteros (Wang et al., 2003). Existen
42 subgrupos que presentan actividad txica frente a este orden de insectos
(Crickmore, 2008).

Debido a la importancia que tiene el control de insectos plaga en cultivos agrcolas y

la necesidad eminente de proponer alternativas para el control de T. absoluta, la
bsqueda en Colombia de nuevos genes cry que codifiquen para nuevas y
novedosas delta-endotoxinas con un espectro de accin ms amplio, contina
siendo un proyecto de gran inters. En el presente trabajo, se aislaron y
caracterizaron genes especficos de la familia cry1, de B. thuringiensis con actividad
anti lepidptera provenientes de muestras de suelo de 14 municipios que cultivan
tomate en Colombia, identificando genes especficos para poder seleccionar
aislamientos nativos y realizar bioensayos sobre larvas de 2do instar de T. absoluta,
y de esta manera identificar aislamientos nativos potenciales para el control de esta
plaga. Adicionalmente se conform un banco de cepas caracterizadas a nivel
microscpico, bioqumico y molecular de acuerdo a la presencia de cristales, bandas
de protenas y genes cry, como un paso previo a la realizacin de ensayos
biolgicos, que son en ltimas los que permitieron confirmar la efectividad de las
cepas nativas en el control de T. absoluta.

48

Este trabajo fue apoyado por la direccin de investigaciones de la Universidad

Jorge Tadeo Lozano y el Centro de Investigaciones y Asesoras Agroindustriales
(CIAA), y fue desarrollado por los grupos de investigacin Gentica, Biologa
Molecular y Bioinformtica y Manejo Integrado de Plagas en Horticultura dentro de
las lneas de investigacin Identificacin Molecular y Biolgica de Agentes
Biocontroladores de fitopatgenos plaga de la agricultura en Colombia.

Este estudio se presenta como requisito parcial para optar al ttulo de Microbilogas
Industriales.

49

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Establecer una coleccin de aislamientos nativos de Bacillus thuringiensis
provenientes de muestras de suelo de cuatro departamentos de tomate en
Colombia, y caracterizarlas microscpica, bioqumica, molecular y biolgicamente
para determinar su toxicidad sobre larvas del cogollero del tomate Tuta absoluta
(Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae).
4.2. Objetivos especficos

Cuantificar y observar la forma y nmero de cristales por medio de tinciones

compuestas y diferenciales en los aislamientos nativos esporulados.

Determinar el perfil electrofortico de protenas totales a partir de extractos

crudos de cepas nativas de Bacillus thuringiensis esporuladas para
relacionarlas con su posible toxicidad sobre insectos plaga.

Determinar la biodiversidad de genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C y

cry1D activos contra insectos lepidpteros en cepas nativas aisladas de
suelos de cuatro departamentos productores de tomate en Colombia.

Seleccionar cepas nativas de Bacillus thuringiensis de acuerdo a las

caracterizaciones microscpicas, bioqumicas y moleculares para la
realizacin de bioensayos.

Determinar la concentracin letal 50 (CL50) de aislamientos nativos

seleccionados sobre larvas de 2do instar del cogollero Tuta absoluta
(Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae).

50

5. MATERIALES Y MTODOS

5.1. Ubicacin del sitio de trabajo

La presente investigacin se llev a cabo en los Laboratorios de Biologa Molecular
y de Entomologa en el Centro de Investigaciones y Asesoras Agroindustriales
(CIAA) de la Universidad Jorge Tadeo Lozano (UJTL), ubicados en Bogot y en
Cha Cundinamarca, respectivamente.

Adicionalmente, se realizaron experimentos puntuales en el Laboratorio Nacional de

Diagnstico Fitosanitario y Anlisis Molecular del Instituto Colombiano Agropecuario
(ICA) y en el Laboratorio de Epidemiologa Molecular del Instituto de Biotecnologa
de la Universidad Nacional en Bogot (IBUN).
5.2. Cepas de referencia
Para la estandarizacin de la metodologa y como control positivo se utilizaron
cepas de referencia de Bt var. kurstaki HD1, aislada del producto comercial Dipel,
que presenta los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ia3, cry2Aa, cry2Ab y Bt var.
aizawai HD137 que presenta los genes cry1Aa, cry1Ba, cry1Ca, cry1Da, del
producto comercial Xentari ambos de la casa comercial Valent Bioscience
Corporation (USA).
5.3. Obtencin de muestras de suelos, rea de estudio
Se escogieron como fuente de aislamientos de bacilos nativos esporulados
muestras de suelo, debido a que este es uno de los lugares en donde se ha
encontrado e identificado mayor cantidad de cepas de B. thuringiensis (Martn y
Travers, 1989), ya que las esporas son arrastradas por el viento y el agua donde
una vez enterradas en el suelo conservan su viabilidad al estar protegidas de la
radiacin ultra violeta (Bravo y Cern, 2004). Las muestras de suelos se obtuvieron
de diferentes regiones productoras de tomate por duplicado, dentro del territorio
Colombiano. En el mapa se presentan los sitios de recoleccin (Figura 7).

51

Figura 7. Zonas de recoleccin de muestras de suelo en Colombia.

Departamentos de Cundinamarca (Cha y Susa), Boyac (Rquira, Santa Sofa, Sutamarchn y Villa
de Leiva), Huila (Garzn) y Santander (Betulia, Floridablanca, Girn, Lebrija, Los Santos, Piedecuesta
y Rionegro).

Las muestras se recolectaron a 5 cm de profundidad utilizando esptulas

previamente esterilizadas de 12 cm de largo y 7 cm de ancho, descartando las
capas superficiales debido a que a esta profundidad se obtiene el mayor nmero de
esporas (Bravo y Cern, 2004), cada muestra fue adicionada a bolsas plsticas
estriles.

5.4. Procesamiento de muestras

Cada una de las muestras de suelo colectadas se proces en el Laboratorio de

Biologa Molecular (UJTL) as: Se adicion un gramo de suelo a nueve mililitros de
PBS (0.002 M NaH2PO4.H2O, 0.008 M Na2HPO4.anhidro, 0.02 M Na2HPO4.12H2O,
0.15 M NaCl) y se incubaron a 30C por 4 horas. Luego se realiz un choque

52

trmico a 80C durante 10 minutos para recuperar nicamente microorganismos

esporulados (Bernhard et al., 1997).
Despus del choque trmico se prepararon tres diluciones seriadas (10-1,10-2 y 10-3),
de las cuales se sembraron 100 l en cajas de petri en medio de cultivo Luria
Bertani (LB) (10 g/l triptona, 10 g/l NaCl, 5 g/l extracto de levadura, 13 g/l de agar) y
se incubaron a 30C durante 24 horas.

La seleccin de las colonias cultivadas en LB se bas en las caractersticas

macroscpicas de las mismas, teniendo en cuenta que las colonias tpicas de B.
thuringiensis son grandes, irregulares, blancas, cremosas y opacas. Una vez
seleccionadas las colonias que por sus caractersticas podran corresponder al
microorganismo de inters, se realiz una siembra por agotamiento en agar LB y se
incubaron a 30C por 24 horas.
5.5 Caracterizacin microscpica de aislamientos nativos
Se realizaron caracterizaciones microscpicas, inicialmente con una coloracin de
Gram de un cultivo de 24 horas de incubacin en medio LB, con el fin de confirmar
las caractersticas morfolgicas y la clasificacin de cada una de los aislamientos en
estudio. Posteriormente, se realiz una tincin diferencial (safranina-verde de
malaquita) de las colonias aisladas, que se incubaron en agar LB durante siete das
a 30C, para evidenciar la presencia de esporas y cristales, los cuales se
cuantificaron en tres campos pticos mediante observacin en microscopio ptico
Nikon (100X), asignando:
(+): 1-10 cristales y esporas por campo ptico.
(++): 10-20 cristales y esporas por campo ptico.
(+++): Ms de 20 cristales y esporas por campo ptico. (Hernndez, 1997).

Los aislamientos nativos que presentaron ms de 20 cristales por campo ptico, se

les realiz un segundo anlisis mediante observacin y registro fotogrfico en
microscopio contraste de fase (400X) realizado en el Laboratorio Nacional de

53

Diagnstico Fitosanitario y Anlisis Molecular del ICA (Instituto Colombiano

Agropecuario).
5.6. Caracterizacin bioqumica SDS-PAGE
Para la identificacin del perfil electrofortico de protenas totales en extractos
crudos de los aislamientos nativos y de cepas de referencia, se emple la
metodologa de Laemmli (1970). Para ello se realiz un gel de separacin al 14,8%
y el gel compactador al 5%. El corrido electrofortico se llev a cabo en una
cmara de electroforesis vertical Mini-PROTEAN TETRA-BIO RAD, y se utiliz el
Marcador de peso molecular de Protenas BROAD RANGE Proten Molecular
Weight Markert (Promega, USA) (Anexo 1). Los corridos electroforticos se llevaron
a cabo a 200 voltios durante 60 minutos y los geles se tieron con solucin
colorante de Azul de Coomassie R-250 al 0.1% durante una hora a 150 rpm en el
SHAKER marca LAB-LINE ORBIT ENVIRON-SHAKER, para posterior lavado y
decoloracin del fondo durante 4 horas en metanol cido actico (40%-10%).

Una vez decolorados los geles, se determin el peso molecular de las bandas de
protenas presentes en cada muestra segn el marcador de peso molecular
utilizado. Estos perfiles de protenas totales fueron comparados con los perfiles de
las cepa de referencia B. thuringiensis var. kurstaki HD1.
5.6.1. Obtencin de extractos crudos
Para la estandarizacin de la obtencin de los extractos crudos y la solubilizacin de
la protena de cristal, se realizaron los siguientes experimentos, utilizando dos
bacilos nativos escogidas al azar, y utilizando la cepa de referencia Bt var. kurstaki
HD1.
5.6.1.1 Medio de cultivo LB 7 das
Los bacilos nativos y la cepa de referencia se sembraron en medio de cultivo LB, y
se dejaron incubando a 30C durante 7 das. Al cabo de este tiempo toda la
biomasa presente en las cajas de petri, se resuspendi en agua destilada estril,
finalmente se realiz el procedimiento descrito por Laemmli (1970), en una

54

proporcin 1:1 (20 l de extracto crudo y 20 l de buffer laemmli). Posteriormente, la

mezcla se coloc en bao mara en ebullicin durante 30 minutos, y 20 l de cada
una de las muestras se sembraron en el gel (Numeral 5.6).
5.6.1.2 Medio de cultivo LB 20 das
Para cada aislamiento nativo y la cepa de referencia, se utilizaron tres repeticiones
(tres siembras en caja de petri), y se incubaron en el medio de cultivo LB a 30C
durante 7 das. Luego todas las cajas se dejaron a temperatura ambiente durante 13
das. Despus, toda la biomasa se resuspendi en agua destilada desionizada.
Finalmente se realiz el procedimiento descrito en el experimento 1. En una
proporcin 1:1 se mezclo el extracto crudo de protena y el buffer Laemmli, y se
coloc en bao mara en ebullicin durante 10 minutos. Finalmente, 20 l de cada
una de las muestras se sirvieron en el gel (Numeral 5.6).
5.6.1.3. Medio de cultivo LB y muestras con adicin de Urea, Na2CO3 y NaOH
Se seleccion un aislamiento nativo esporulado y una cepa de referencia, que
fueron incubados por triplicado en el medio de cultivo LB a 30C durante 7 das.
Despus, toda la biomasa presente en las cajas de petri se recogi, y se transfiri a
tres tubos eppendorf de 1,5 ml, realizando tres tratamientos a cada uno de los
tubos, en el primer tubo se resuspendi toda la biomasa en 500 l de agua destilada
desionizada adicionando 100 l de Urea 100 mM. En el segundo tubo, se
resuspendi toda la biomasa igual que el tubo 1 y se adicion 100 l de Na2CO3 100
mM. En el tercer tubo se procedi igual con la biomasa y se le adicion 100 l de
NaOH 100 mM. Finalmente, se realiz el procedimiento descrito en el experimento
1. Se mezclo 1:1 el extracto crudo de protena y el buffer Laemmli y esta mezcla se
coloc en bao mara en ebullicin durante 10 minutos, y 20 l de cada una de las
muestras se sirvieron en el gel (Numeral 5.6).

55

5.6.1.4. Medio de cultivo LB modificado con adicin de Sulfato de Amonio

Los aislamientos nativos y la cepa de referencia se sembraron en el medio de

cultivo LB modificado (10 g/l de triptona, 10 g/l NaCl, 5 g/l extracto de Levadura, 4 g/l
sulfato de Amonio, 13 g/l agar) (Pitre et al., 2008) y se incubaron a 30C, durante 7
das. Toda la biomasa celular se resuspendi en agua destilada desionizada y
posteriormente los extractos crudos fueron sonicados a una amplitud del 36% con
12 pulsos por 120 segundos, utilizando el equipo Sonics Vibra Cell, 750 W,
(Laboratorio de Epidemiologa Molecular en el Instituto de Biotecnologa de la
Universidad Nacional en Bogot, IBUN). Finalmente, se realiz el procedimiento
descrito por Laemmli (1970). Se mezclo 1:2 del extracto crudo de protena y el buffer
Laemmli y se coloco en bao mara en ebullicin durante 10 minutos. 20 l de cada
una de las muestras se sirvieron en los pozos del gel (Numeral 5.6).
5.7. Caracterizacin molecular
5.7.1. Extraccin de ADN
Para la obtencin de ADN plasmdico y ADN total, de buena calidad para ser
utilizado en la caracterizacin molecular por PCR, se utilizaron los kit; Extraccin
por Kit Ultra CleanTM 6 minuts mini plasmid prep kit para ADN plasmidico y Kit Ultra
CleanTM Microbial DNA Isolation Kit para ADN general de la casa comercial
fabricante (Bio-Line USA) (Anexo 2 y 3). 1 l de ADN obtenido de cada aislamiento
esporulado se sembr en el gel.
5.7.2. Amplificacin por PCR de genes cry1.

Para la caracterizacin molecular se utiliz la Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PCR (del Polymerase Chain Reaction). Para llevar a cabo esta reaccin, se
seleccionaron

pares

de

oligonucletidos

reportados

previamente

para

la

amplificacin por PCR de fragmentos de los genes de las familias cry1 (Bravo et al.,
1998) (Tabla 5)

56

Tabla 5. Secuencia y posicin de los oligonucletidos universales que reconocen 25 genes de la

familia cry1. (Bravo et al., 1998)

Primer

Posicin

General
cry1

1472-2029
1475-2032
1472-2035
1636-2194
1559-2115
1577-2131
2181-2723
1463-2056
1463-2017
1442-1984
1454-2011
1451-2005
1936-2490
1430-1987
1457-2005
2181-2723
1583-2140
1439-1993
1615-2172
2012-2565

Gen que
Reconoce
cry1Aa, cry1Ad
cry1Ab, cry1Ae
cry1Ac
cry1Af
cry1Ba
cry1Bb
cry1Bc
cry1Ca
cry1Cb
cry1Da, cry1Db
cry1Ea, cry1Fa
cry1Eb
cry1Fb
cry1G
cry1Ha
cry1Hb
cry1Ia, cry1Ib
cry1Ja
cry1Jb
cry1K

Peso pb
558
558
564
558
558
555
555
594
555
543
558
555
555
558
549
543
558
555
558
558

Secuencia

5 CTGGATTTACAGGTGGGGATAT 3
5 TGAGTCGCTTCGCATATTTGACT 3

Los aislamientos nativos esporulados positivos para la presencia de genes cry1

fueron sometidos a dos rondas de PCR mltiple a partir de 2 mezclas de 6
oligonucletidos cada una, reconociendo 3 genes especficos en cada reaccin de
PCR. Los oligonucletidos, que se emplearon en la PCR mltiple, fueron diseados
en secuencias conservadas para cada gen especfico (Cern et al., 1994) (Tabla 6).

57

Tabla 6. Secuencia y posicin de los oligonucletidos especficos, diseados en secuencias

conservadas para cada gen especfico, se presenta el tamao del producto amplificado (Cern et al.,
1994).

Peso del

Genes

Secuencia

Posicin

reconoce

CJ 1

5 TTATACTTGGTTCAGGCCC 3

CJ 2

5 TTGGAGCTCTCAAGGTGTAA 3

CJ 4

5 AACAACTATCTGTTCTTGAC 3

CJ 5

5 CTCTTATTATACTTACACTAC 3

CJ 6

5 GTTAGATTAAATAGTAGTGG 3

CJ 7

5 TGTAGCTGGTACTGTATTG 3

CJ 8

5 CTTCATCACGATGGAGTAA 3

CJ 9

5 CATAATTTGGTCGTTCTGTT 3

CJ 10

5 AAAGATCTGGAACACCTTT 3

CJ 11

5 CAAACTCTAAATCCTTTCAC 3

CJ 12

5 CTGCAGCAAGCTATCCAA 3

CJ 13

5 ATTTGAATTGTCAAGGCCTG 3

cryI Aa

fragmento
PCR (pb)

1105-1125

246

1332-1351
cryI Ab

1133-1153
1328-1348

cryI Ac

cry1B

cry1C

cry1D

1495-1514
1656-1674
1007-1025
1355-1374
1306-1325
1416-1436
837-856
1107-1127

216

180

367

130

290

*N: Nombre de la secuencia.

5.7.3. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1

Para la amplificacin por PCR de genes cry1 se utiliz ADN extrado de la cepa de
referencia Bt var. kurstaki HD1 y se llevaron a cabo diferentes experimentos
variando las concentraciones del oligonucletido desde 0,4 M a 1,0 M, cloruro de
magnesio desde 2,0 mM a 3,0 mM y Taq Polimerasa.
5.7.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos
Para la amplificacin de los genes cry1 especficos se prepararon las mezclas como
aparecen en la Tabla 6. En la mezcla A (CJ1-CJ7), se utiliz ADN de la cepa de
referencia Bt var. kurstaki HD1, porque contiene los genes especficos cry1Aa,
cry1Ab y cry1Ac, y para la mezcla B (CJ8-CJ13) (Tabla 6), se utiliz ADN de la cepa
de referencia Bt var. aizawai HD137, porque contiene los genes cry1B, cry1C y
cry1D, y se llevaron a cabo diferentes ensayos variando las concentraciones de
oligonucletidos, Taq Polimerasa y cloruro de magnesio.

58

Las condiciones preliminares de amplificacin para las dos Mezclas de

oligonucletidos (A y B) fueron: Una denaturacin inicial a 94C por 5 minutos, 35
ciclos de amplificacin (con un ciclo que consista en la denaturacin a 94C por 1
minuto, hibridacin a 55C por 1 minuto, elongacin a 72C por 1 minuto), y una
elongacin final a 72C por 10 minutos.

Cada una de las amplificaciones del ADN se llev a cabo en un Termociclador de

bloque PTC-100TM Pelrtier Thermal Cycle (M.J. Research, USA). El volumen final
utilizado fue de 20 l para todas las reacciones.
5.7.5. Electroforesis de ADN en gel de agarosa
Para evidenciar la presencia de los genes amplificados cry1 por PCR, se realiz
una electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, y para los genes amplificados cry1
especficos (mezclas A y B) se realiz una electroforesis en gel de agarosa al 3%,
ambas en tampn TBE 0,5 X, y se corrieron en una cmara Horizontal Gel XL Ultra
V-2 Labnet International. Los productos amplificados se tieron con bromuro de
etdio. La electroforesis se llev a cabo a 100 voltios durante 60 minutos, y los
productos de amplificacin se fotografiaron en el fotodocumentador UVP Gel-DocITTM Imaging System (UVP LSC. USA) (Anexo 4).
5.8. Cuantificacin de Protenas de Extractos crudos
5.8.1. Obtencin de Extractos crudos

Para obtener mayor produccin de esporas y cristales de los extractos crudos de los
aislamientos nativos seleccionados para el bioensayo, los bacilos se cultivaron en
100 ml de medio de cultivo leche peptonizada modificada (triptona 10 g, dextrosa
10 g, extracto de levadura 2 g, MgSO47H2O 0,3 g, FeSO47H2O 20 mg,
ZnSO47H2O 20 mg, MnSO4 20 mg, 1 litro de agua, pH: 7,2), con agitacin a 340
rpm en el Shaker LAB-LINE Orbit Environ-Shaker a 28C durante 72 horas,
hasta su completa autolisis (Ramos et al., 2004).

59

Despus de la incubacin los bacilos nativos se trasladaron a tubos nalgene y se les

adicion 4 l de 100 mM de PMSF (Fluoruro de fenilmetl sulfonilo), y 5 ml de agua
destilada desionizada, se agitaron en vrtex por 10 segundos y se centrifugaron a
10.000 rpm por 10 minutos. La centrifugacin se repiti tres veces, lavando solo con
agua destilada desionizada para eliminar los residuos del medio de cultivo.
Seguidamente se adicion a la muestra 2936 l de Carbonato de Calcio (CaCO3),
60 l de DTT (Ditiotreitol, reductor de di-sulfuros) y 4 l de PMSF, y se dejaron en
shaker a 200 rpm a temperatura ambiente durante toda la noche. Finalmente el
sobrenadante se translado a tubos eppendorf de 1,5 ml y se centrifug a 14.000 rpm
por 15 min (4C), para eliminar los residuos de Carbonato de Sodio (amortiguador
que permite la solubilizacin de las protenas totales), DTT y PMSF (Lpez et al.,
2002; Bravo y Cern, 2004). El sobrenadante se coloc en un tubo eppendorf nuevo
y se guard (4C) para su anlisis posterior.
5.8.2. Cuantificacin de protenas totales en los extractos crudos por la
tcnica de Bradford

Para cuantificar las concentraciones de protena total en los extractos crudos de los
aislamientos nativos, se realiz con una curva de albmina srica bovina (BSA). Las
concentraciones empleadas para el control fueron de 100-1000 gml-1 de BSA,
preparado seis diluciones (Anexo 5). Para el anlisis del extracto crudo se tom 0,1
ml y se transfir a tubos de 16 x 100 mm segn la metodologa descrita por Bradford
(1976).

5.9. Caracterizacin Biolgica

5.9.1. Cra de Tuta absoluta
Plantas utilizadas: Se utilizaron semillas de tomate variedad Milano Tropic
(Impulsemillas). Se sembraron en bandejas con celdillas de 15 cm de profundidad
conteniendo turba (material orgnico), se colocaron por 5 das en cuarto oscuro a
una temperatura de 25C, hasta la germinacin. Posteriormente, se dejaron a
temperatura ambiente en el semillero por tres semanas. Las plntulas desarrolladas
se trasplantaron a materas de 18 cm de alto.

60

Condiciones de cra del insecto plaga Tuta absoluta: La cra del insecto plaga se
realiz en los invernaderos y cuarto de cra ubicados en el Laboratorio de
Entomologa del Centro de Investigaciones y Asesoras Agroindustriales (CIAAUJTL), sobre plantas de tomate Lycopersicum esculentum Mill, bajo condiciones de
invernadero. Para llevar a cabo este procedimiento, se recolectaron polillas adultas
de

Tuta

absoluta

en

Cha,

Cundinamarca,

Colombia

(45200.01

N,

740357.31O) en cultivos de tomate mantenidos en condiciones controladas de

invernadero. Se estableci una cra en jaulas de 80 X 60 X 60 cm, recubiertas con
velo suizo. En una jaula se colocaron tres materas con plantas de tomate con
aproximadamente 60 adultos en proporcin sexual 1:1. Las plantas con las posturas
de huevos se trasladaron a otra jaula. Despus de la eclosin, las larvas se
clasificaron de acuerdo a su ciclo metamrfico en 1ro, 2do, 3ero y 4to instar (Figura
8). Las larvas de 4to instar se utilizaron para infestar nuevas plantas de tomate
dentro de jaulas, y de esta forma mantener la cra (Gonzlez, 1989). Larvas de 2do
instar se utilizaron para la realizacin de los bioensayos.

Figura 8. Cmara de cra del insecto Tuta absoluta.

A) Plantas infestadas con huevos; B) Plantas infestadas con larvas; C) Plantas infestadas con adultos.

61

Monitoreo de condiciones ambientales: Se llev un registro de las condiciones

ambientales (Temperatura y Humedad relativa) con el instrumento Cox Tracer
Datalogger 8000 data 2 sensores.
Monitoreo sanitario de las plantas: Frecuentemente se monitoreaba la presencia
de otras plagas o enfermedades y se realizaron las limpiezas sanitarias pertinentes.

5.9.2. Experimentos para la estandarizacin del sistema de bioensayo

Se utilizaron tres productos comerciales Dipel, XenTari y Turilav. Dipel y
XenTari son producidos por la casa comercial Valent BioSciences Corporation
(USA) y constituidos por las cepas de Bacillus thuringiensis var. kurstaki y aizawai
respectivamente. Turilav es producido por la empresa Laverlam S.A (Cali,
Colombia), constituido por la cepa Bacillus thuringiensis var. kurstaki.

Los tres insecticidas biolgicos comerciales se prepararon disolviendo 2,5 g de

producto en 500 ml de agua. En los experimentos se utilizaron estas diluciones en
un diseo completamente al azar. Se utilizaron 5 larvas con 4 repeticiones. La
mortalidad se evalu cada 24 h por 8 das utilizando un estereoscopio ADVANCED
OPTICAL y se corrigi utilizando la frmula de Henderson y Tilton (1955). La
mortalidad corregida se someti a un Anlisis de Varianza (ANOVA) y prueba de
comparacin de medias de Tukey al 95% de confianza.

Los experimentos se realizaron en condiciones controladas en cuarto de cra a una

temperatura de 21 2C, humedad relativa 70 10% y fotoperiodo 12 h L:O. La
lectura del bioensayo se realiz diariamente contando el nmero de larvas vivas y
muertas para cada uno de los tratamientos evaluados.

Los 5 mtodos para la estandarizacin del bioensayo fueron:

62

5.9.2.1. Inmersin de la hoja:

Hojas de tomate fenolgicamente similares se lavaron, secaron y se sumergieron en

las diluciones insecticidas por separado. Luego se dejaron secar a temperatura
ambiente y se introdujeron en cajas de petri, sobre papel absorbente hmedo. Para
mantener hidratada la hoja se coloc un algodn hmedo en el foliolo. Despus, las
hojas se infestaron con 5 larvas de 2do instar utilizando un pincel de pelo de marta.
Se utiliz un grupo control sin tratamiento (testigo absoluto) (adaptado de Niedman y
Meza-Basso, 2006) (Figura 9).

Figura 9. Experimento 1: inmersin de hojas de plantas de tomate en diluciones de los productos

comerciales Dipel, Xentari y Turilav. A) Procedimiento para homogenizar la preparacin de los
insecticidas biolgicos por inmersin total. B) Montaje de los tratamientos en cajas de petri.

5.9.2.2. Aspersin por aergrafo a hojas de tomate:

Este experimento se realiz igual que el experimento anterior variando nicamente

la forma de aplicacin de los bioinsecticidas sobre las hojas en los diferentes
tratamientos. Se utiliz un aergrafo con el que se aplic 1 ml de la dilucin de los
tres bioinsecticidas por separado sobre el haz y el envs de las hojas de tomate a
una distancia de 15 cm, procurando cubrir toda la superficie (Figura 10).

63

Figura 10. Experimento 2: aspersin con aergrafo de hojas de tomate, con las diluciones de los
insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. A) Aplicacin de los productos en hojas de tomate con
aergrafo. B) Montaje de los tratamientos en cajas de petri.

5.9.2.3. Frascos con foliolos de plantas de tomate:

Foliolos de plantas de tomate (hojas con un tallo pequeo), se colocaron a manera

de florero en el interior de otro frasco plstico pequeo, el cual fue cubierto con un
dedo de guante quirrgico para evitar que las larvas cayeran al agua. Los productos
biolgicos a evaluar se sirvieron por inmersin de las hojas de la misma forma que
en el primer experimento (numeral 5.9.2.1). Luego, los frascos se colocaron dentro
de otro recipiente plstico y se sellaron con tapa. Cada florero se infest con 5
larvas de 2do instar (Figura 11).

64

Figura 11. Experimento 3: Frascos con foliolos de plantas de hojas de tomate colocadas a manera de
florero, con las diluciones de los insecticidas biolgicos Dipel, Xentari y Turilav. A) Montaje de los
frascos a manera de florero. B) Montaje de los tratamientos en frascos.

5.9.2.4. Medio de cultivo extracto de hojas de tomate:

Se prepar una dieta artificial utilizando 20 g de hojas de tomate, 0,65 g agar, 1,65
g cido ascrbico, 1,65 g cido ctrico y 0,25 g Dipel y se disolvieron en 50 ml de
agua destilada. Esta mezcla se homogeniz en una licuadora Osterizer y luego se
sirvi en cajas de petri. Los dems procedimientos se realizaron igual que en el
primer experimento (numeral 5.9.2.1). Se utiliz nicamente la dilucin del producto
comercial Dipel (Figura 12).

Figura 12. Experimento 4: Medio de cultivo extracto de hojas de tomate.

Dieta artificial a base de extracto de hoja, conservante y agar.

65

5.9.2.5 Recipientes plsticos como unidades experimentales

Este ensayo es una variacin del experimento 1 (5.9.2.1). Se utilizaron recipientes

plsticos de 28 cm de largo por 16 cm de ancho y 4 cm de profundidad, para evitar
la gran cantidad de cajas petri y facilitar la lectura del bioensayo. El sistema de
aplicacin de los productos empleados fue inmersin (Figura 13 A). Despus las
hojas se dejaron secar a temperatura ambiente y con un pincel de pelo de marta se
colocaron 21 larvas por tratamiento. Se utilizaron 3 recipientes plsticos por
tratamiento (3 repeticiones) incluyendo el testigo absoluto (control) (Figura 13).

Figura 13. Experimento 5: inmersin de hojas de plantas de tomate en dilucin de los productos
comerciales Dipel, xentari y Turilav. A) Procedimiento para homogenizar la preparacin de los
insecticidas biolgicos por inmersin total. B) Montaje de los tratamientos en recipientes plsticos

5.9.3. Evaluacin de bacilos nativos preseleccionados

Los individuos del insecto plaga utilizados en el bioensayo fueron larvas de 2do
instar de Tuta absoluta. De acuerdo a la metodologa estandarizada se escogieron
hojas de tomate fenolgicamente iguales y se lavaron con agua, se secaron con
papel absorbente, previo a los ensayos biolgicos. Para la evaluacin de los
tratamientos se emple un diseo completamente al azar (CA) con tres repeticiones.
Cada repeticin estaba constituida por una unidad experimental, que contena 3
larvas de Tuta absoluta sobre 7 hojas de tomate iguales. En cada bioensayo se
incluy un testigo absoluto (hoja y larvas), un control positivo: hojas tratadas con la

66

cepa de referencia (HD1) y tratamientos con bacilos nativos esporulados. En cada

bioensayo se utilizaron 3 recipientes con 21 larvas por unidad experimental
(triplicado) para un total de 63 larvas por tratamiento.

Los ensayos se realizaron comparando la actividad txica de los extractos crudos de

bacilos nativos esporulados como factor de mortalidad sobre larvas de T. absoluta.
Inicialmente se realizaron bioensayos discriminatorios con los bacilos nativos
preseleccionados (extracto crudo), utilizando una concentracin igual para todos los
tratamientos de 0,8 g/ml, a fin de identificar los bacilos nativos esporulados de
mayor potencial patognico sobre larvas de Tuta absoluta.

La mortalidad se evalu cada 24 h, por 8 das utilizando un estereoscopio

ADVANCED OPTICAL y se determin el porcentaje de mortalidad corregida
utilizando la formula de Henderson y Tilton que permite cuantificar y corregir la
mortalidad originada por el tratamiento con relacin a la obtenida en el testigo. La
mortalidad corregida se someti a un Anlisis de Varianza (ANOVA) y prueba de
comparacin de medias de Tukey al 95% de confianza.
5.9.4. Determinacin de la concentracin letal 50 (CL50)
El anlisis inicial Evaluacin de bacilos nativos preseleccionados, permiti escoger
los bacilos ms promisorios para someterlos a continuacin a bioensayos con dosis
seriadas para determinar la concentracin letal 50 (CL50).
Para determinar la concentracin letal 50, se parti de una suspensin de extracto
crudo de bacilos nativos esporulados con una concentracin estndar para todos los
bacilos a evaluar. A partir de esta concentracin inicial alta, se realizaron 6
diluciones seriadas (0,8 g/ml; 1,6 g/ml; 2,4 g/ml; 3,2 g/ml; 4 g/ml y 4,8 g/ml),
que se evaluaron como tratamientos (Jimenz, 1992). La mortalidad se registr
como se indic anteriormente. Para el anlisis de regresin se utilizo la
transformacin PROBIT, utilizando el programa computacional Biostat 2007.
Mediante analisis de regresin a travs del mtodo Probit (Finney, 1971), uno de los
problemas que debe enfrentar el investigador para realizar bioensayos adecuados

67

para la estimacin de la CL50 con concentraciones seriadas, es disponer de un

nmero alto de larvas de 2do instar que permita realizar el diseo experimental
necesario para obtener resultados estadsticamente aceptables. Para resolver el
limitante de disponer de cohortes de larvas numerosas, que son practicamene
imposibles de obtener en una cra normal, se sigui un metodo secuencial de
bioensayos que permitio escoger los aislamientos promisorios en bioensayos
discriminatorios previos a aquellos necesarios para estimar la CL50.
Por ultimo, se llevo a cabo una prueba de confirmacin, para determinar si la muerte
de las larvas era producida o no por la accin de los bacilos nativos esporulados, o
por efecto de la manipulacin, o de otro agente patgeno externo. Esta prueba
consisti en realizar un macerado de las larvas muertas de las diferentes dosis
evaluadas, el macerado se resuspendi en 1 ml de agua destilada estril y 100 l de
esta suspensin, se incub en agar LB a 30C por 24 horas, luego se determin
macroscpicamente la presencia de colonias de B. thuringiensis.
5.10. Conformacin de un Banco de Bacilos Nativos Esporulados
Una alcuota de 50 l de un cultivo lquido de cada uno de los aislamientos nativos
se utiliz para impregnar un tira de papel filtro previamente esterilizado dentro de
una ampolleta color mbar que inmediatamente despus se sell al calor con un
mechero, esto se realiz por triplicado para cada una de las cepas. Despus, estas
ampolletas se guardaron en el refrigerador a 4C hasta su nueva utilizacin. El
cdigo asignado a cada ampolleta estuvo compuesto por la zona muestreada, que
corresponda al departamento (ZC; zona Cundinamarca, ZB; zona Boyac, ZH; zona
Huila y ZS; zona Santander), segudo de las iniciales de la Universidad Jorge Tadeo
Lozano (UJTL), y el nmero de la cepa (1). El cual variaba dependiendo del
departamento y la cantidad de cepas.

68

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1. Aislamiento de cepas a partir de muestras de suelo en 4 departamentos

de Colombia

Se recolectaron 28 muestras de suelo de 14 municipios de Colombia en los

departamentos de Cundinamarca, Boyac, Huila y Santander. Se aislaron 99
aislamientos nativos, que presentaron colonias caractersticas del gnero Bacillus
sp., las colonias presentaron color crema, borde irregular y redondeado (Anexo 6)
(Figura 14), indicando la diversidad de este microorganismo en el ambiente.
Schnepf y Whiteley (1985), argumentan que la amplia distribucin de B.
thuringiensis en el ambiente no solo se debe a factores abiticos, sino tambin a
que los insectos que ingieren esporas de B. thuringiensis y mueren a causa de la
infeccin, liberan al medio ambiente la forma vegetativa de estas bacterias que
posteriormente esporulan, permaneciendo en este estado vegetativo hasta que
puedan encontrar condiciones apropiadas para su multiplicacin.

Figura 14. Cultivo por aislamiento de un bacilo nativo esporulado.

La Tabla 7, presenta el nmero de aislamientos de bacilos nativos esporulados

aislados a partir de las muestras de suelo analizadas de los diferentes municipios.

69

Tabla 7. Departamento, municipio y nmero de aislamientos nativos, a partir de las muestras de suelo
analizadas.
Muestras

Cepas de Bacillus sp.

Analizadas

aisladas

Cha

Susa

Raquir

Santa Sofa

Villa de Leyva

Sutamarchn

Garzn

11

Betulia

Piedecuesta

10

Lebrija

Girn

Rionegro

Floridablanca

Total

28

99

Departamento

Municipio

Cundinamarca

Boyac

Huila

Mesa de los
Santos
Santander

Total

15

29

11

44

99

Se aislaron entre 3-11 bacilos nativos esporulados, en las diferentes muestras de

suelo de cada uno de los municipios. Las muestras de suelo de los municipios de
Garzn, Piedecuesta y Sutamarchn, fueron donde ms bacilos se aislaron con 11,
10 y 9 aislamientos respectivamente.

Por el contrario, en los municipios Floridablanca, Villa de Leyva, Rionegro y Mesa de

los Santos, se aisl una cantidad de bacilos nativos esporulados menor con 3, 4, 5 y
5 respectivamente.
Esta variabilidad en las muestras analizadas, puede deberse a las condiciones
clmaticas, que pueden determinar la distribucin en ciertas areas ms que en otras
del microorganismo (Uribe et al., 2003), en el presente estudio, en los municipios:

70

Garzn (26C), Piedecuesta (23C), Sutamarchn (20C), Raquira (13C), Santa

Sofa (19C) y Susa (14C), con temperaturas variables, se encontr el mayor
nmero de bacilos esporulados (Tabla 7).

De igual manera Silvia (1999), reporta que las caractersticas fsico qumicas del
suelo son importantes y que no todos los microorganismos esporulados tienen los
mismos requerimientos ambientales para llevar a cabo la transicin del estado de
esporulacin a la fase vegetativa, lo que influye en la facilidad para recuperarlos.
As, por ejemplo, en los suelos francos arcillosos y arenosos, se dice que se
encuentran la mayora de bacilos esporulados, mientras que en los suelos de
composicin limo se encuentra en menor cantidad. No obstante, es necesario
conocer las caractersticas fsico qumicas (pH, materia orgnica, textura entre
otros) de los suelos y los factores climticos de las zonas muestreadas para poder
entender mejor que relacin podra existir entre la presencia de estos
microorganismos y el suelo del cual fueron aislados (Ortiz y Ortiz, 1980). Variables
que en la presente investigacin no fueron estudiadas.
6.2. Caracterizacin microscpica
La caracterizacin microscpica por tincin de Gram, confirm la presencia de
bacilos esporulados Gram positivos como caracterstica de los aislamientos, lo cual
indic que estas posiblemente pertenecen al genero Bacillus sp (Holt et al., 2000).
La morfologa observada de los bacilos esporulados fue variable, encontrando
aislamientos con formas diferentes desde bacilos largos, cortos y con formacin en
cadena, su grosor tambin vari (Anexo 6), indicando la diversidad de los
asilamientos obtenidos. Por lo tanto, fue necesario visualizar la forma y nmero de
cristales por campo ptico para cada uno de los 99 aislamientos. Esta caracterstica
es fundamental en la especie Bacillus thuringiensis. Para llevar a cabo este
procedimiento, los 99 bacilos nativos esporulados se tieron con safranina-verde de
malaquita, tindose las esporas de verde y los cristales de rojo (Hernndez, 1997;
Ammons et al., 2002) (Anexo 7).

71

Con la cuantificacin de cristales realizada se encontr que el 50% de los bacilos

nativos esporulados presentaron entre 1 a 10 cristales por campo ptico.
10% de los bacilos nativos presentaron entre 10 a 20 cristales por campo ptico. Y
nicamente un bacilo nativo esporulado present ms de 20 cristales.
Adems, se encontraron que en el 38% de los bacilos nativos esporulados se
presentaron las tres clasificaciones del conteo en los tres campos evaluados,
mostrando la alta variabilidad en la produccin de cristales en los aislamientos
evaluados.

La observacin por microscopia ptica, permiti identificar igualmente diferentes

morfologas de cristales encontrando formas, redondas (Rd), amorfas (Am),
bipiramidal (Bp), triangular (Tr) y cuadradas (Cd) en porcentajes de 37.8%, 26.7%,
22.1%, 7.6% y 5.8% respectivamente. En la Figura 15, se observa que la forma
redonda fue la ms observada en la evaluacin de los aislamientos nativos, siendo
la forma triangular y cuadrada las formas que menos se evidenciaron.

Figura 15. Porcentaje de las diferentes formas de cristales observadas en los bacilos nativos
esporulados. La evaluacin se realiz por microscopia ptica con tincin safranina verde de malaquita.

72

Es importante anotar, que en algunos bacilos nativos esporulados aislados se

encontraron desde una forma de cristal hasta cuatro formas diferentes,
observndose casi todas las combinaciones entre ellas, por lo que, se establecieron
18 perfiles diferentes asociados a los 99 bacilos nativos esporulados analizados.

Por lo anterior, fue necesario agrupar los bacilos nativos esporulados de acuerdo a
las formas de cristales observados en cada uno. Los 18 grupos o perfiles
establecidos son: I) Amorfa; II) Amorfa, bipiramidal y redonda; III) Amorfa y
cuadrada; IV) Amorfa y redonda; V) Amorfa, redonda y cuadrada; VI) Bipiramidal;
VII) Bipiramidal y redonda; VIII) Bipiramidal y triangular; IX) Cuadrado; X) Cuadrado,
bipiramidal y triangular; XI) Cuadrado, redondo y bipiramidal; XII) Cuadrado,
redondo, bipiramidal y amorfo; XIII) Redondo; XIV) Redondo, amorfo y triangular;
XV) Redondo, bipiramidal y triangular; XVI) Redondo y triangular; XVII) Triangular y
XVIII) Triangular, amorfo y bipiramidal (Figura 16).

Figura 16. Grupo o perfiles de los bacilos nativos esporulados de acuerdo a la forma del cristal
observado. I) Am; II) Am, bp y rd; III) Am y cd; IV) Am y rd; V) Am, rd y cd; VI) Bp; VII) Bp y rd; VIII) Bp
y tr; IX) Cd; X) Cd, bp y tr; XI) Cd, rd y bp; XII) Cd, rd, bp y am; XIII) Rd; XIV) Rd, am y tr; XV) Rd, bp y
tr; XVI) Rd y tr; XVII) Tr y XVIII) Tr, am y bp.

73

Con la clasificacin anterior (Figura 16), se observa que en los aislamientos nativos
las formas ms representativa, fueron las amorfas (grupo I), presente en 18 (18%)
bacilos

nativos

esporulados.

Estos

aislamientos

nativos

presentaron

dos

caractersticas en comn, ya que dentro de la cuantificacin de cristales se encontr

que presentaron entre 1 a 10 cristales por campo ptico y fueron independientes de
los municipios muestreados. La forma redonda de los cristales (grupo XIII), fue
observado en 17 (17%) bacilos nativos esporulados.

Las formas menos observadas fueron los grupos III (amorfo y cuadrado),
X (cuadrado, bipiramidal y triangular), XI (cuadrado, redondo y bipiramidal),
XII (cuadrado, redondo, bipiramidal y amorfo), XVII (triangular) y XVIII (triangular,
amorfo y bipiramidal), estos ltimos bacilos, tambin presentaron una caracterstica
en comn, ya que en la cuantificacin de cristales presentaron las tres
clasificaciones del conteo en los tres campos evaluados (menos de 10, entre 11 y
20 y ms de 20 cristales) y no se encontr relacin entre formas, cantidad de
cristales y muestras de suelos (municipios muestreados).

Los resultados obtenidos, permitieron concluir que con respecto al nmero y forma
de cristal, los 99 bacilos nativos esporulados presentan alta diversidad, por lo menos
en las variaciones observadas, y que existe un potencial muy grande en nuestro
pas para descubrir y obtener biodiversidad en bacilos nativos esporulados, que
eventualmente podran evaluarse exitosamente como biopesticidas para el control
de diferentes insectos plaga (Tabla 8).

74

Tabla 8. Municipio, nmero y grupo de cristales de bacilos esporulados aislados presentes en

muestras de suelo analizadas. I) Am; II) Am, bp y rd; III) Am y cd; IV) Am y rd; V) Am, rd y cd;
VI) Bp; VII) Bp y rd; VIII) Bp y tr; IX) Cd; X) Cd, bp y tr; XI) Cd, rd y bp; XII) Cd, rd, bp y am;
XIII) Rd; XIV) Rd, am y tr; XV) Rd, bp y tr; XVI) Rd y tr; XVII) Tr y XVIII) Tr, am y bp.

Cha

No de
aislamientos
7

Grupo de cristales,
presentes en los bacilos nativos
XIII, I, XI, IV, XIII, VII, II

Susa

Raquir

IV, IV, II, VII, VI, IX, XII, XV

XIII, X, VII, XV, VIII, XVII, XVI, IV

Santa Sofa

Villa de Leyva

Sutamarchn

Garzn

11

Betulia

Mesa de los
Santos

Piedecuesta

10

Lebrija

II, XIII, I, I, XIII, XIII, I

Girn

IV, VII, I, IV, XIII, I, VI

IX, IX, IX, IX, XIII

I, II, IV

Municipio

Rionegro
Floridablanca

II, XIII, I, XIII, I, VII, I, XIII

VII, VII, XIV, VII, I
XV, VIII, XVIII, XIII, VI, I, VIII, XVI
XIII, VII, IV, VII, VII, XIII, V, I, II,
IV, I
VI, I, XIII, III, VII, I, II
XIV, VII, XIII, I, XIII, VII
II, II, V, I, II, IV, VII, IV, IV

Los bacilos nativos esporulados que contenan entre 10-20 y ms de 20 cristales por
campo ptico, se sometieron a un anlisis microscpico en contraste de fases
(400X), encontrando bacilos nativos esporulados con una, dos, cuatro formas de
cristales (Figura 17).

75

Figura 17. Diferentes formas de cristal observadas en los bacilos nativos esporulados aislados.
Se observan aislamientos con una forma de cristal (A, F, G, H y K) y asociaciones de 2,3 y 4 (B, C y D)
formas de cristales en bacilos nativos esporulados.

76

Con los resultados presentados anteriormente, se puede concluir que los bacilos
nativos esporulados, presentan diversidad en el ambiente, y esta diversidad de los
cristales proteicos, se debe posiblemente a la capacidad de B. thuringiensis de
llevar a cabo intercambio intra e interespecfico, de informacin gentica mediante
un proceso tpico a nivel bacteriano llamado conjugacin, con lo que podran
intercambiar genes especficos que codifican para las protenas Cry, que son las
que conforman los cristales paraesporales. Los bacilos nativos esporulados
utilizados en este estudio contienen entre 4 a 6 genes cry diferentes, lo que apoya
esta idea (resultado presentado ms adelante) (Madigan, et al., 2003).

Anteriormente, se relacionaba la forma del cristal presente en los aislamientos

nativos con su actividad biolgica potencial (Hofte y Whiteley, 1989), de esta forma,
los cristales redondos se han asociado con actividades insecticidas frente al orden
dptero (Ibarra y Federici, 1896; De Barjac, 1982), los cuadrados contra insectos
dpteros y lepidpteros (Yamamoto y McLaughlin, 1981), las formas bipiramidales se
han asociado con actividades en contra de insectos colepteros y lepidpteros
(Aronson et al., 1986; Lecadet et al., 1998). Sin embargo, Mrquez et al. (1996),
afirma que la correlacin entre la forma del cristal y su actividad biolgica frente a
determinado tipo de insecto, no se cumple, debido a que la visualizacin del cristal
depende del medio de cultivo en donde se cultivan las cepas.

Si se tienen en cuenta estas apreciaciones, en el presente estudio se presentaron

bacilos con actividades potenciales frente a insectos lepidpteros, dpteros y
colepteros, en una sola cepa que contena cuatro formas de cristal, esto puede
confirmarse con las caracterizaciones bioqumicas y moleculares y pruebas
biolgicas para encontrar si existe tal relacin.
6.3. Caracterizacin bioqumica
La electroforesis de protenas se basa en la migracin de protenas a travs de un
campo elctrico. Esta tcnica es til como un mtodo analtico, ya que las protenas
pueden ser separadas y visualizadas, en su conformacin nativa como denaturada.

77

La electroforesis permite determinar el peso molecular de una protena o si est

formada por varias subunidades (Sambrook et al., 2001).
Las protenas Cry de B. thuringiensis pueden llegar a conformar hasta el 25% del
peso seco de clulas esporuladas (Lecadet y Dedonder, 1971; Aronson, 1986), por
lo tanto, la tcnica de SDS-PAGE de extractos crudos en fase estacionaria de
crecimiento, permite establecer la presencia y abundancia relativa de las protenas
del cristal que son de gran importancia potencial, dada la alta variabilidad de
protenas insecticidas del cristal con actividad biolgica diferentes (Hernndez,
1997).
6.3.1. Estandarizacin
poliacrilamida

de

electroforesis

de

protenas

en

geles

de

Para la obtencin del perfil electrofortico de protenas totales de los bacilos nativos
esporulados, se evaluaron 4 mtodos. En el primer mtodo (ver metodologa,
numeral 5.6.1. Medio de cultivo LB 7 das), no se visualizaron bandas
electroforticas de protenas, en las cepas evaluadas (dos bacilos nativos
esporulados escogidas al azar, y la cepa de referencia Bt var. kurstaki HD1),
(resultado no presentado), posiblemente las cepas evaluadas necesitan de un
tiempo mayor a 7 das de cultivo, esto con el fin de que se presente esporulacin y
posteriormente se produzcan los cristales paraesporales debido a que se presenta
latencia en los bacilos nativos esporulados (Sobern y Bravo 2000). Por otra parte,
el tiempo de calentamiento de las muestras en bao mara en ebullicin por ms de
30 minutos, causa no solo lisis bacteriana sino denaturacin de protenas
ocasionando que solo entre el 0 y el 30% de estas protenas constituyentes del
cristal se solubilicen y sean visualizadas en el montaje de electroforesis (Delafield et
al., 1965).

Por lo tanto, fue necesario cultivar los bacilos nativos esporulados, por ms tiempo.
Adems, disminuir el tiempo de calentamiento en bao mara en agua en ebullicin
a 10 minutos (empleando el segundo mtodo ver metodologa, numeral 5.6.1. Medio
de cultivo LB 20 das). El resultado para los dos bacilos nativos esporulados
escogidos al azar fue negativo, debido, a que no se revelaron protenas similares a
las protenas Cry, sin embargo, la preparacin cruda de la cepa de referencia Bt

78

var. kurstaki HD1, mostr bandas tenues, con pesos similares a las protenas Cry
(Figura 18). Lo anterior posiblemente se debi a que los bacilos nativos esporulados
evaluados, presentan una fuerte latencia, porque han permanecido tiempos
prolongados en el suelo, sin pasar del estado vegetativo al reproductivo
(esporulacin) (Bechtel y Bulla, 1976).

Figura 18. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Bacilos nativos esporulados y cepa de
referencia HD1 cultivados en medio LB 20 das. Carril 2 y 3) aislamientos nativas; carril 4) HD1; MP)
Marcador de peso molecular Protenas BROAD RANGE (Promega USA).

Ya que no existen condiciones para que los bacilos nativos esporulados pasen del
estado vegetativo al reproductivo al cultivarlas en el medio LB, debido a que la
esporulacin y el tiempo para que esto se de, es diferente en cada uno de los
aislamientos, se evalu un tercer mtodo (ver metodologa, numeral 5.6.1. medio LB
con adicin de Urea, Na2CO3, NaOH), con un bacilo nativo esporulado escogido al
azar y la cepa de referencia Bt var. kurstaki HD1, Se emple toda la biomasa
resuspendida en agua destilada desionizada. El extracto crudo del bacilo nativo
esporulado no revel protenas con pesos similares a las protenas Cry en ninguno
de los tres tratamientos. Por el contrario, la cepa de referencia Bt var. kurstaki HD1,
en los tres tubos tratados con estas soluciones (Urea, Na2CO3 y NaOH), si revel
bandas con pesos similares a las protenas Cry (Figura 19, carril 5,6 y 7).

79

Figura 19. Electroforesis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, un bacilo nativo

esporulado y una cepa de referencia HD1 cultivados en medio LB por triplicado con tres tramientos
distintos Urea, Na2CO3 y NaOH. Carril 2) bacilo nativo esporulado Urea; carril 3) bacilo nativo
esporulado Na2CO3; carril 4) bacilo nativo esporulado NaOH; carril 5) HD1 Urea; carril 6) HD1
Na2CO3; carril 7) HD1 NaOH; MP) Marcador de peso molecular Protenas BROAD RANGE (Promega
USA).

Los anteriores resultados indicaron, que adems de un ambiente alcalino que

permita la solubilizacin de cristales, se necesitan factores que aumenten la
esporulacin, dentro de estos factores se encuentran los medios de cultivo con
adicin de micronutrientes tales como los iones manganeso, magnesio y calcio,
adems de otras fuentes de nitrgeno que permitan el crecimiento de la bacteria
(Arcas, 1984). Por lo tanto, se plante un nuevo experimento metodologa nmero 4
(ver metodologa, numeral 5.6.1. Medio de cultivo LB modificado) (Pitre et al., 2008).
Con este mtodo se revelaron en los geles de poliacrilamida bandas tenues de
protenas con pesos similares al de las protenas Cry, tanto en la cepa de referencia
como en los bacilos nativos esporulados (Figura 20). La realizacin de esta
metodologa utilizando este medio de cultivo, permiti optimizar la produccin de
cristales en corto tiempo, ya que este medio fue suplementado con dos fuentes de
nitrgeno: extracto de levadura y sulfato de amonio. La fuente de nitrgeno orgnica
(extracto de levadura) le confiere a la bacteria los aminocidos necesarios para la
esporulacin y la fuente de nitrgeno inorgnica (sulfato de amonio) aumenta la
produccin de esporas (Galn et al., 1996).

80

Este comportamiento tambin lo observ Fernndez-Larrea (1999), al evaluar estas

fuentes de nitrgeno obteniendo un aumento en la produccin de esporas. Bravo y
Cern (2004), sugieren que la combinacin de factores nutricionales orgnicos e
inorgnicos son el mayor requerimiento nutricional en la sntesis de las
-endotoxinas.

Figura 20. Electroforesis de protenas en gel de poliacrilamida SDS-PAGE, medio de cultivo LB

modificado. Carril 2) HD1; Carril 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) bacilos nativas esporulados; MP) Marcador de
peso molecular Protenas BROAD RANGE (Promega USA).

Como se observa en la Figura 20, el aumento de la esporulacin en los bacilos

nativos esporulados, no fue suficiente, para revelar protenas totales con pesos
similares a las protenas Cry. Por lo tanto, el siguiente paso en el tratamiento fue
utilizar toda la biomasa y realizar tres lavados consecutivos para ser procesadas en
un sonicador. Por medio de este mtodo alternativo se mejor la solubilizacin de
cristales y la lisis bacteriana, y por lo tanto, el revelado de bandas en los geles
teidos de los bacilos nativos esporulados. Este mtodo fue estandarizado y
escogido para caracterizar los 99 bacilos nativos esporulados aislados (ver
metodologa, numeral 5.6.1. medio de cultivo LB modificado).

81

En la Figura 21, se observa la presencia de bandas con pesos moleculares similares

a los de las Protenas Cry. Adems al adicionar una proporcin mayor del buffer de
carga se aument la unin del SDS a la protenas, aumentando de esta forma las
cargas negativas en las protenas, y por ende, mejor el corrido electrofortico de
las protenas, resultado que directamente influye en el revelado de estas (Laemmli,
1970).
6.3.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida de los extractos crudos de los
bacilos nativos esporulados

Para la caracterizacin bioqumica de los 99 bacilos nativos esporulados (Anexo 7),

se sigui la metodologa cuatro. En la Figura 21, se observan las protenas totales
reveladas a partir de los bacilos nativos esporulados. En el carril 4 se pueden ver
dos bandas bastantes gruesas, parecidas a las bandas que revela la cepa de
referencia HD1 (carril 2), que revela la protena Cry1 y Cry2 con pesos de 135 y 70
kDa respectivamente. Y otra protena con relativa abundancia con un peso menor
cercano a los 50 kDa. Las dems muestras (carriles 2, 5, 6, 7 y 8) revelaron bandas
tenues de protenas de variado peso molecular.

Figura 21. Perfil electrofortico de protenas SDS-PAGE en cepas de referencia Bt var. kurstaki HD1,
y algunos bacilos nativos esporulados. Carril 2) Bt var. kurstaki HD1; carriles 3, 4, 5, 6, 7 y 8) bacilos
nativos esporulado; MP) Marcador de peso molecular Protenas BROAD RANGE (Promega USA).

82

Por medio de la caracterizacin bioqumica de los 99 bacilos nativos esporulados

evaluados, se encontr que las bandas de protenas mas visibles (bandas gruesas)
visualizadas en los geles de poliacrilamida, presentaron pesos que varan entre 10150 kDa, por lo tanto, se realiz una clasificacin en siete (7) grupos de acuerdo a
su posible actividad biolgica sobre insectos plaga (Chilcott and Wigley, 1993)
(Anexo 7), tomando como base que las protenas Cry representan entre el 25 al
30% de protena total (Lecadet y Dedonder, 1971; Aronson, 1986), esta clasificacin
se estableci de la siguiente forma:

El grupo I, constituido por bandas electroforticas de protenas cuyo peso molecular

vara entre 10-20 kDa, peso no asociado a ninguna protenas Cry conocida. El grupo
II, con bandas electroforticas de protenas con pesos moleculares de 25-30 kDa,
asociado a protenas Cyt (Protenas Citolticas), con actividad frente a insectos
lepidpteros y dpteros (Gough et al., 2005). El grupo III, con bandas proteicas de
pesos moleculares de 35-50 kDa, asociado a protenas Cry1, Cry3, Cry6, Cry34,
Cry35 y Cyt1A con actividad biolgica frente a insectos lepidpteros, colepteros,
himenpteros y a organismos como nematodos y caros (Barloy et al., 1996; Zhang
et al., 1997). El grupo IV, con bandas electroforticas de pesos moleculares de 6075 kDa, asociado a protenas Cry2 y Cry3, con actividad biolgica dual frente a
insectos lepidpteros dpteros y colepteros (Zhang et al., 1997; Arango et al.,
2002). El grupo V, con bandas electroforticas de protenas de pesos moleculares
de 80-85 kDa, asociado a protenas Cry1Ia, con actividad biolgica frente a insectos
lepidpteros y dpteros (Arango et al., 2002). El grupo VI, con bandas
electroforticas de protenas de pesos moleculares de 100-150 kDa, asociado a
protenas Cry1, Cry32Aa, con actividad biolgica frente a insectos lepdopteros y
actividad dual frente a colepteros (Hofte and Whiteley, 1989) y del tipo Cry4 con
actividad frente a dpteros (Barloy et al., 1996; Zhang et al., 1997). El grupo VII
constituido para aquellos bacilos nativos esporulados que no revelaron bandas de
protenas.

Con la determinacin de los perfiles electroforticos de protenas se puede

evidenciar la diversidad de aislamientos nativos que pueden existir en un

83

determinado ecosistema (Bravo y Cern, 2004), y esta comparacin de bandas

proteicas permite identificar una posterior relacin con su actividad biolgica.

Se encontraron bacilos nativos esporulados, que revelaron desde una protena en

su patrn electrofortico hasta 5 protenas. Por lo tanto, fue necesario realizar una
clasificacin en donde se agruparan individualmente cada protena o grupo de
protenas con los respectivos bacilos nativos y con el grupo que present su posible
actividad biolgica, para esta clasificacin solo se tuvieron en cuenta las protenas
prominentes. En la Tabla 9 se identifican los 28 grupos encontrados.
Tabla 9. Relacin entre los pesos moleculares de las protenas reveladas en cada uno de los bacilos
nativos esporulados y el/o los grupos de actividad biolgica establecidos.

Perfil electrofortico de Protenas

(Bandas en kDa)

Nmero de Bacilos
nativos esporulados

Grupo con posible

actividad biolgica

28
35
50
75
130
10;20
10;75
28;35;50
28;35;50;100;150
28;35;50;75; 100
28;35;50;85
28;35;75
28;35;85
28;50
28;50;75
28;75
28;75;100
28;80
35;50;75
35;50;100;150
35;50;75;100;150
35;50;75;85
35;75
35;85
50;75;100
75;100
75;100;150
NP

5
3
5
1
1
1
1
12
1
6
1
2
1
4
1
4
1
2
24
2
4
1
2
2
1
2
1
8

II
III
III
IV
VI
I
I,IV
II,III
II,III,VI
II,III,IV
II,III,V
II,III,IV
II,III,V
II,III
II,III,IV
II,IV
II,IV,VI
II,V
III, IV
III,VI
III,IV,VI
III,IV,V
III,IV
III,V
III,IV,VI
IV,VI
IV,VI
VII

Grupo I: 10-20 kDa; Grupo II: 20-30 kDa; Grupo III: 35-50 kDa; Grupo IV: 60-75 kDa; Grupo V: 80-85
kDa; Grupo VI: 100-150 kDa; Grupo VII: No revelaron bandas (NP).

84

En la Tabla 9, se observa que la mayora de bacilos nativos esporulados

evidenciaron bandas electroforticas, indicando que producen los cristales
necesarios para ser revelados en geles de poliacrilamida. Tambin, se encontr que
existe relacin entre los perfiles de cristales y las protenas, ya que se encontraron
bacilos nativos esporulados con: una forma de cristal y una protena, dos formas de
cristal y 2 protenas, 2 formas de cristal en cinco protenas. Adems se encontr que
bacilos nativos esporulados que en la cuantificacin presentaron entre 1 a 10
cristales por campo ptico (8 bacilos nativos esporulados), que se clasificaron en el
grupo NP (no presentaron bandas de protenas), relacin que puede posiblemente
deberse a que no produjeron la cantidad suficiente de cristales para revelar
protenas en los geles.

Por otra parte, el mayor nmero de bacilos nativos esporulados, con la clasificacin
establecida en la caracterizacin bioqumica (Tabla 9), predijo que estas cepas
presentan una posible actividad biolgica frente a insectos lepidpteros,
colepteros, himenpteros y a organismos como nematodos y caros. No obstante,
en la caracterizacin microscpica las morfologas ms representativas fueron los
cristales de forma amorfa y redonda, que presentan posible actividad frente a
insectos dpteros (Barloy et al., 1996; Zhang et al., 1997; Marquz et al., 1996).

Adems, esta diversidad de protenas presentes en los 99 bacilos nativos

esporulados, puede ser coherente si se tiene en cuenta, que existen muchas cepas
de B. thuringiensis que producen inclusiones cristalinas que contienen mezclas de
delta-endotoxinas. Por ejemplo, Bt var. kurstaki HD1 contiene 3 protenas tipo Cry1
(130-140 Kda) y 2 tipo Cry2 (70 Kda) en el mismo cristal proteco (Carreras et al.,
2004). Bt var israeliensis presentan genes que codifican para las protenas Cry4,
Cry11 y Cyt1A, en el mismo cristal proteico (Hernndez, 1997) (Tabla 9).

La presencia de los bacilos nativos esporulados, y su clasificacin con el perfil

electrofortico de protenas, tambin fue independiente del lugar de origen, ya que
se encontraron bacilos nativos esporulados con ms de un grupo de clasificacin en
las distintas regiones muestreadas.

85

Ellis et al. (2002), Porcar y Juarez (2003), afirman que las protenas de bajo peso
molecular en donde se clasifican la mayora de los aislamientos (Tabla 9), pueden
ser un grupo nico debido a su actividad sinrgica, ya que el sinergismo brinda la
actividad antagnica de las delta endotoxinas, en algunas especies de insectos, y
puede ser un criterio para seleccionar las cepas que pueden controlar al insecto
lepidptero Tuta absoluta, y otro tipo de plagas que pueden afectar los cultivos
agrcolas.

Adems, 42 genes cry1 con diferente actividad biolgica sobre insectos lepidpteros
que codifican para la delta-endotoxina, han sido identificados a la fecha, de ah la
importancia de determinar el tipo de gen que contienen los bacilos nativos
esporulados al presentar un patrn de protenas Cry tan diverso

antes de

seleccionarlos para los bioensayos que en ltimas definen su actividad biolgica

potencial (Carreras et al., 2004).
6.4. Caracterizacin Molecular
6.4.1. Extraccin de ADN

Los genes que codifican para las protenas Cry son generalmente de origen
plasmdico, sin embargo, se han encontrado tambin en el ADN total bacteriano
(Schnepf et al., 1998; Jurez-Prez, 2004).

En el presente estudio, se obtuvo ADN general y plasmdico de los 99 bacilos

nativos esporulados. Se observaron bandas de ADN de alto peso molecular visibles
en gel de agarosa al 1% (Figura 22). El ADN total bacteriano se diferencia del ADN
plasmdico porque posee mayor peso molecular, y por lo tanto, presenta menor
velocidad de migracin en el gel de agarosa (Figura 22 a), mientras que en el ADN
plasmdico que tambin es circular, presenta menor tamao molecular y una mayor
velocidad de migracin (Figura 22 b) (Puerta y Uruea, 2005).

La calidad del ADN es un factor determinante para obtener buenos resultados

cuando se lleven a cabo las reacciones de amplificacin por PCR (Gibbs et al.,

86

1992). En la Figura 22, se observan bandas gruesas que indican que en las
muestras haba una alta concentracin de ADN total bacteriano aprximadamente
entre 100-200 ng/l (Figura 22 a) y para el ADN plasmdico aproximadamente entre
40-120 ng/l (Figura 22 b). La ausencia de barrido y bandas adicionales permiten
comprobar que el ADN extrado es de buena calidad y pureza. Por medio de los kit
utilizados, la metodologa de extraccin fue rpida y eficiente, adems, por medio de
la utilizacin de estos kits comerciales, el ADN obtenido se puede mantener por
largos perodos de tiempo a -20C y/o -80C, para su posterior uso, debido a que no
se degrada fcilmente.

a.

b.
Figura 22. a) ADN general de bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo Kit ULTRA
TM
CLEAM Microbial isolation Kit b. ADN plasmdico. Bacilos nativos esporulados (1-11), con el mtodo
TM
Kit ULTRA CLEAM Microbial isolation Kit. Gel de agarosa al 1% teida en bromuro de etdio.

6.4.2. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1

En este estudio se identificaron los genes cry1, con posible actividad frente a
insectos plaga del orden lepidptera, utilizando oligonucletidos generales que
amplifica a la mayora de genes de la familia cry1 (Bravo et al., 1998). Estos
oligonucletidos se basan en secuencias homolgas a una regin especfica comn

87

a todos los genes pertenecientes a un mismo grupo, y reconocen 25 genes cry1

(Tabla 5). Con estos oligonucletidos el tamao del producto de amplificacin
esperado vari entre 543 y 594 pb.

Para estandarizar las mejores condiciones de amplificacin, se realiz un primer

ensayo teniendo en cuenta el protocolo descrito por Bravo et al. (1998), utilizando
las siguientes concentraciones: 2,0 mM de MgCl2, 1 M de oligonucletidos y 2,5 U
de Taq Polimerasa. 200 M de dNTPs, 1X de buffer. El volumen final fue 20 l, el
programa de amplificacin consisti en un primera denaturacin inicial a 95C por 2
minutos, para 30 ciclos de amplificacin (con un ciclo que consista en la
denaturacin a 95C por 1 minuto, hibridacin a 51C por 1 minuto, elongacin a
72C por 1 minuto), y una elongacin final a 72C por 5 minutos.

Con estas condiciones no se obtuvo ningn producto de amplificacin. Por lo tanto,

se realiz un segundo ensayo variando las concentraciones de Taq polimerasa,
cloruro de magnesio y oligonucletidos, las dems condiciones se mantuvieron
igual, y se utiliz ADN de las cepas de referencias Bt. var aizawai y Bt var kurstaki
HD1, adems de dos cepas nativas de B. thuringiensis escogidas al azar, las
concentraciones empleadas fueron las siguientes: 3.0 mM de MgCl2, 0,4 M de
oligonucletidos y 2U de Taq Polimerasa. El volumen final fue 20 l, y el programa
de amplificacin se le cambio la temperatura de hibridacin a 52C por un minuto.

Con estas nuevas variables se obtuvieron los productos de amplificacin del tamao
esperado (543-594 pb), sin mostrar bandas inespecficas (Figura 23), indicando que
una mayor concentracin de MgCl2, produce ms iones Mg+2 en complejos solubles
con los dNTPs, que se incorporan durante la reaccin y estimulan la actividad de la
Taq polimerasa (Puerta y Uruea, 2005).

Segn Saiki. (1992) y Williams et al. (1993), en una reaccin estndar de PCR, la
concentracin de MgCl2 utilizada es de 1.5 mM, los oligonucletidos se encuentra
entre 0.1- 0.5 M, y de Taq ADN polimerasa se utiliza aproximadamente 2.5 U en
50-100 l de mezcla de reaccin. Sin embargo, con las concentraciones empleadas

88

en el presente estudio se obtuvieron los productos de amplificacin del tamao

esperado (543 y 594 pb) en forma especfica.

En cuanto a las temperaturas de hibridacin de los oligonucletidos con el ADN

blanco depende de su longitud y contenido de GC. Regularmente, las temperaturas
de hibridacin se determinan empricamente para cada mezcla de oligonucletidos.
Segn Myers et al. (1992), Saiki. (1992) y Gibbs et al. (1992), a mayor temperatura
la especificidad y la astringencia en la hibridacin de los oligonucletidos es mayor y
con esta la especificidad de la PCR. Cuando se emplea una temperatura de
hibridacin de 52C, se obtienen bandas especficas, con el tamao molecular
esperado. No obstante, en estudios previos (Hernndez, 1997), se determin que a
bajas temperaturas de hibridacin, adems de amplificar los productos esperados
se obtienen bandas inespecficas, las cuales a medida que se aumenta la
temperatura de hibridacin desaparecen, sin embargo cuando se realiz el ensayo a
una temperatura de 55C, la intensidad del tamao esperado disminuy. Por lo
tanto, la temperatura de hibridacin empleada en este estudio confirma los estudios
realizados por Hernndez (1997).

El protocolo estandarizado present que las concentraciones adecuadas son: 3.0

mM de MgCl2, 0,4 M de oligonucletidos y 2 U de Taq Polimerasa y las dems
condiciones se mantuvieron. El volumen final fue 20 l, y las temperaturas
empleadas fueron las mismas a Bravo et al. (1998) (Figura 23).
6.4.3. Amplificacin de genes cry1 en bacilos nativos esporulados
Se caracterizaron 99 aislamientos nativos de B. thuringiensis a travs de la mezcla
del ADN genmico y plasmdico (0,5 l de cada uno) (Anexo 7) (Figura 23), con la
mezcla se busco que los genes que no se encuentran el ADN genmico y se
presenten en el ADN plasmdico fueran igualmente amplificados. Schnepf et al.
(1998) sugieren que la mayora de los genes cry1 se encuentran en el plsmido y
Porcar y Jurez-Prez (2004), que se encuentran en el ADN total bacteriano. En
este estudio se identificaron 35 bacilos nativos esporulados con presencia del gen

89

cry1 (Tabla 10). En la Figura 23 se observan bandas con pesos moleculares que
varan entre 543 y 594 pb.

Figura 23. Amplificacin de fragmentos por PCR de genes cry1 utilizando los oligonucletidos
universales Bravo et al. (1998). 2) Bt var. kurstaki HD1; 3) Control Negativo; carril 4-11 cepas nativas
de Bt 4,11, 24, 39, 57, 75, 76, 77; MP) Marcador de peso molecular Hypper Ladder II; Gel de Agarosa
al 1% teido en Bromuro de Etdio.

La familia de genes cry es la que agrupa el mayor nmero de genes descritos

clasificados en 55 familias y 121 subgrupos (Crickmore, 2008).

En el presente estudio, de las 99 cepas de B. thuringiensis el 35,4% presentaron

genes pertenecientes a la familia de genes cry1, porcentaje de presencia inferior al
ser comparado con los resultados obtenidos en diferentes lugares del mundo como
Taiwan, China y Mexico. En donde se ha reportado con detalle la caracterizacin en
trminos del contenido de genes cry (Ben-Dov et al., 1996; Bravo et al., 1998; Chack
et al., 1994; Ferrandis et al., 1999; Kim et al., 1998). En Taiwn, encontraron que de
225 aislamientos analizados el 98,2%, contenan genes de la familia cry1 (Chack et
al., 1994); Gao et al. (2008), en China, al analizar 570 aislamientos encontraron un
porcentaje del 46,5%, de aislamientos que presentaron genes de la familia cry1.
Bravo et al. (1998), en Mxico, reportaron en 246 aislamientos analizados que el
49,6% presentaban genes cry1.

90

Sin embargo, Ben-Dov et al. (1996) en un estudio realizado en Israel, Kazakihstan y

Uzbekistan reportaron la presencia de genes cry1 en un 33,5% de 215 aislamientos.
En pases como Filipinas y Nueva Zelanda los aislamientos de suelos positivos para
la presencia de genes cry1 se encuentran entre un 24-45% (Bernhard et al., 1997;
Thenius et al., 1998). Resultado similar a lo observado en el presente estudio, lo que
sugiere que posiblemente los 99 aislamientos de B. thuringiensis presenten genes
diferentes a la familia cry1.

Adems la variabilidad y distribucin de B. thuringiensis en cada pas depende de

las diferencias ecolgicas del lugar de origen y la relacin de co-evolucin con las
diferentes especies de insectos blanco, que favorece la expresin de diferentes
genes cry (Uribe et al., 2003). Cabe anotar que la recoleccin de muestras en el
presente estudio, se realiz nicamente en suelos, mientras que en otros estudios la
recoleccin de muestras se ha realizado en insectos muertos, hojas, cultivos
agrcolas, praderas, desiertos, bosques, entre otros (Chack et al., 1994; Gao et al.,
2008; Bravo et al., 1998; Ben-Dov et al., 1996).

En la tabla 10 se presenta el nmero y porcentaje de bacilos nativos esporulados,

que presentaron fragmentos amplificados de genes cry1 en cada uno de los
municipios en donde se realiz el muestreo. Los bacilos nativos esporulados
aislados de los municipios de Susa y Piedecuesta en los departamentos de
Cundinamarca y Santander, presentaron el mayor nmero de bacilos nativos
esporulados con genes cry1 con 14,3% y 17,1% respectivamente. Por otra parte, los
bacilos nativos esporulados aislados de los municipios de Garzn (2,9%), Lebrija
(2,9%), Girn (2,8%), Rionegro (2,9%) y Floridablanca (2,9%), presentaron
nicamente un aislamiento con presencia del gen tipo cry1. Los resultados
observados en el presente estudio indican que en todos los municipios en donde se
realiz el muestreo, se identificaron aislamientos nativos que contienen genes de la
familia cry1 (Tabla 10).

91

Tabla 10. Porcentaje de cepas con presencia del gen cry1 por municipio en cada departamento.

Departamento

Nmero de Bacilos

Nmero de bacilos

nativos esporulados

que amplifican genes

aislados

cry1

Cha

8,5

Susa

14,3

Raquira

5,7

Santa Sofa

5,7

Villa de Leyva

8,6

Sutamarchan

5,7

Garzn

11

2,9

Betulia

8,6

Mesa de los Santos

11,4

Piedecuesta

10

17,1

Lebrija

2,9

Girn

2,9

Rionegro

2,9

Floridablanca

2,9

Total

99

35

100

Municipio

Cundinamarca

Boyac

Huila

Santander

6.4.4. Estandarizacin de la amplificacin de genes cry1 especficos

La PCR mltiple se utiliza para identificar varios genes en una sola reaccin. En
esta reaccin, se utiliza una mezcla de oligonucletidos para amplificar fragmentos
especficos de cada gen, en el caso B. thuringiensis los diferentes genes cry que
codifican para distintas -endotoxinas (Cern et al., 1994; Cern et al., 1995). Con
los oligonucletidos especficos y la PCR mltiple se pueden detectar directamente
los genes cry conocidos en bacilos nativos esporulados (Song et al., 2003).

Para la amplificacin de los genes cry1 especficos se prepararon las mezclas A y B:

la mezcla A que amplifica fragmentos de los genes cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac con
pesos moleculares en pares de bases de 246, 216 y 180 respectivamente, para
estandarizar esta mezcla se empleo ADN de la cepa de referencia Bt var. kurstaki
HD1. La mezcla B que amplifica fragmentos de los genes cry1B, cry1C y cry1D con

92

pesos moleculares en pares de bases de 367, 130 y 290 respectivamente, se utiliz

ADN de la cepa de referencia Bt var. aizawai HD137 (Cern et al., 1994).

Para llevar a cabo estas amplificaciones se realiz un primer ensayo con las dos
mezclas empleando las condiciones descritas por Cern et al. (1994), donde
emplearon 2,5 U de la enzima ADN Taq polimerasa, 0,5 mM de dNTPs, y 0,5 M
de oligonucletidos para un volumen final de 50 l. El programa de amplificacin
consisti en una denaturacin inicial a 92C por 1 minuto, y 25 ciclos de
amplificacin (con un ciclo que consista en una primera denaturacin a 92C por 1
minuto, hibridacin a 53C por 1 minuto, elongacin a 72C por un minuto), y una
elongacin final a 72C por 10 minutos (Cern et al., 1994). Bajo estas condiciones,
se amplificaron bandas diferentes a los pesos pares de bases (pb), esperadas.
(Figura 24).

Figura 24. Productos amplificacidos por PCR mltiple para identificar fragmentos de genes cry1Aa
(246 pb), cry1Ab (216 pb), cry1Ac (180 pb) (Mezcla A) y cry1B (367 pb), cry1C (130pb), cry1D (290 pb)
(Mezcla B). Carril 2) Cepa de referencia Bt var kurstaki HD1; 3) Control Negativo; Carril 4) Bacilo nativo
esporulado 11; Carril 5) Control Negativo; Carril 6) Cepa de referencia Bt var aizawai HD137; Carril 7)
Bacilo nativo esporulado 11; MP). Marcador de peso molecular Hyper Ladder II. Gel de Agarosa al 3%
teido en Bromuro de Etdio.

93

Por lo tanto, se realizaron ensayos para estandarizar la metodologa. Se variaron las

concentraciones de MgCl2 entre 3,0-3,75 mM y concentracin de Taq ADN
polimerasa entre 1,0, 2,0 y 2,5 U. Las dems variables empleadas en los ensayos
fueron: 1X de buffer, 0,4 M de los oligonucletidos, 200 M de dNTPs, en un
volumen final de 20 l y la temperatura de hibridacin se aumento a 55C, los otros
paramtros fueron iguales (Figura 25).

Figura 25. Productos amplificados de ADN por PCR para genes cry1 especficos en cepas de
referencia. 2) Control Negativo; Ensayo 1, carril 3 y 4 3) Bt var kurstaki; 4) Bt var aizawai; Ensayo 2,
carril 5 y 6, 5) Bt var kurstaki; 6) Bt var aizawai; Ensayo 3, carril 7 y 8, 7) Bt var kurstaki ; 8) Bt var
aizawai HD137; MP). Marcador de peso molecular Hyper Ladder II. Gel de Agarosa al 3% teido en
Bromuro de Etdio.

En el ensayo 1, utilizando 3,75 mM MgCl2 y 1U de Taq polimerasa (Figura 25 carril

3), se observan 7 bandas de tamaos moleculares de 1200 pb, 800 pb, 700 pb, 600
pb, 500 pb, 400 pb y 200 pb aproximadamente, todas inespecficas, y en el carril 4
se observan bandas de tamaos moleculares de 700 pb, 500 pb, 400 pb y 100 pb
aproximadamente, tambin bandas inespecficas.

En el ensayo 2 (Figura 25, carril 6) se aument la concentracin de Taq polimerasa

a 2 U y se bajo el MgCl2 a 3mM, los resultados fueron existosos para la mezcla B
(carril 6) con ADN de la cepa de referencia Bt. var. aizawai HD137, ya que se
amplificaron 3 bandas con los pesos esperados de 367, 130 y 290 pb que

94

corresponden a los genes cry1B, cry1C y cry1D. Sin embargo, en la mezcla A

Figura 25 carril 5, con ADN de la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1, no se
revelaron bandas de amplificacin con los pesos esperados, ya que se observa
pesos que varian desde 800 pb a 300 pb.

En el ensayo 3 (Figura 25, carril 7 y 8) con una mayor concentracin de la enzima

Taq polimerasa (2,5 U) y la misma concentracin de MgCl2 (3 mM), tanto en el carril
7 y 8, se observan bandas inespecficas. Por lo tanto, se realiz un cuarto
experimento, para la mezcla A disminuyendo la concentracin de oligonucletidos a
0,4 M y aumentando la concentracin de MgCl2 a 3,2 mM, esta amplificacin fue
positiva para la Mezcla A debido a que se amplificaron bandas con pesos
moleculares aproximados a 246 pb, 216 pb y 180 pb (Figura 26, carril 2),
producindose tambin una banda inespecfica de aproximadamente 500 pb, esta
banda

aparece

en

publicaciones

previas

en

donde

se

utilizaron

estos

oligonucletidos (Ceron et al., 1994, Ceron et al., 1995).

En una PCR multiple, los oligonucletidos presentan un papel importante, debido a

que se necesitan las condiciones necesarias de amplificacin para cada
oligonucletido, con el fin de que los tamaos de productos esperados se produzcan
de forma especfica, adems necesita de temperaturas adecuadas que permitan
que los oligonucletidos empleados en M-PCR funcionen bajo las mismas
condiciones (Tomoyuki et al., 2006). Las bandas inespecficas que pueden aparecer
se debe a que los oligonucletidos encuentran sitios de unin en otras regiones del
genoma que pueden tener homologas menores pero sin embargo amplifican. Por
estas razones las variables utilizadas deben ser muy bien estandarizadas.

No obstante, cuando se amplificaron algunas de las extracciones de ADN de los

bacilos nativos esporulados, no se observaron resultados similares (Figura 26, carril
4, 5, 6, 7, 10, 11, 12 y 13), debido a la cantidad de bandas amplificadas que se
observan en el gel de agarosa. Esto pudo suceder por la variabilidad de genes
presentes en las cepas, y que el oligonucletido reconoce.

95

Figura 26. Productos de amplificacin por PCR de genes cry1 especficos en cepas de referencia y
cepas nativas. Mezcla A cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac con pesos moleculares en pb de 246, 216 y 180 pb,
y Mezcla B con pesos moleculares en pb de 367, 130 y 290 pb, de los genes cry1B, cry1C y cry1D. 2)
HD1; 3) Control Negativo; carril 4-7) cepas nativas 8) HD137; 9) Control Negativo; carril 10-13 cepas
nativas. MP) Marcador de peso molecular Hyper Ladder II. Gel de Agarosa al 3% teido en Bromuro de
Etdio.

Por lo tanto, se realiz un cuarto experimento para la mezcla A de oligonucletidos,

disminuyendo la concentracin de oligonucletidos a 0,3 M y aumentando la
concentracin de MgCl2 a 3,5 mM (Tabla 11), esta amplificacin fue positiva para la
Mezcla A debido a que se amplificaron bandas con pesos moleculares aproximados
a 246 pb, 216 pb y 180 pb, mientras que para la Mezcla B, se realiz un quinto
ensayo, aumentando nicamente la concentracin de MgCl2 a 3,5 mM, para un
volumen final de 20 l (Tabla 11), con estas condiciones se amplificaron los
fragmetos de pesos moleculares aproximados de 367pb, 130pb y 290 pb. En las
Figuras 27 y 28 se observa el resultado de estos ensayos.

96

Tabla 11. Variables utilizadas en los experimentos 4 y 5, para la estandarizacin de las condiciones de
la M-PCR para la mezcla de oligonucletidos A y B
VARIABLES

ENSAYO 4

ENSAYO 5

MEZCLA A

MEZCLA B

3,5

3,5

MgCl2 mM
Buffer 1X

1X

1X

Primer M

0,3

0,4

dNTPs M

200

200

Taq polimerasa U

Las condiciones de amplificacin para la Mezcla A y B fueron las mismas: Una

denaturacin inicial a 94C por 5 minutos, para 35 ciclos de amplificacin (con un
ciclo que consista en la denaturacin a 94C por 1 minuto, hibridacin a 55C por 1
minuto, elongacin a 72C por 1 minuto), y una elongacin final a 72C por 10
minutos.
6.4.5. Amplificacin de genes cry1 especficos en bacilos nativos esporulados.
Los 35 B. thuringiensis nativos que se caracterizaron a travs del ADN genmico y
plasmdico, los cuales previamente haban amplificado fragmentos de genes cry1.
Se analizaron en dos rondas de PCR mltiple, utilizando la metodologa
estandarizada en la Tabla 11. En la primera reaccin, mezcla A se amplificaron
bandas en los diferentes bacilos nativos esporulados con pesos moleculares de 246,
216 y 180 pb aproximados, que pertenecen a los genes cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac
(Mezcla A), indicando la diversidad de estos genes, adems se observa, en todos
los carriles que el fragmento de 246 pb que identifica el gen cry1Aa es el de mayor
presencia en los aislamientos y el gen cry1Ac de 180 pb se presenta en menor
nmero de bacilos nativos esporulados evaluados (Figura 27), adicionalmente, la
banda inespecficas de 517 pb que se presentan, tambin estuvo presente en el
estudio realizado por Cern et al. (1994), quienes disearon los oligonucletidos
para la identificacin de estos genes cry.

97

Figura 27. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en cepas de referencia y
cepas nativas, utilizando la mezcla A de oligonucletidos. cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac con pesos
moleculares en pb de 246, 216 y 180 pb. Carril 2) Bt var Kurstaki HD1; Carril 3) Control negativo; Carril
4, 5, 6, 7, 8, 9 ,10 11, 12 y 13) bacilos nativos esporulados 4, 9, 11, 14, 24, 57, 61, 75, 76 y. MP)
Marcador de peso molecular Hyper Ladder II. Gel de Agarosa al 3% teido con bromuro de etdio.

Con la segunda reaccin, mezcla B, se identificaron bandas con pesos moleculares

de 367, 130 y 290 pb, pertenecientes a los genes cry1B, cry1C y cry1D, tambin se
identifica la gran diversidad de estos genes en las cepas nativas evaluadas,
identificando el gen cry1C en el fragmento de 130 pb en la mayora de bacilos
nativos esporulados evaluados (Figura 28).

98

Figura 28. Productos de la amplificacin por PCR de genes especficos cry1 en cepas de referencia y
cepas nativas, utilizando la mezcla B de oligonucletidos. cry1Ba, cry1Ca y cry1Da con pesos
moleculares en pb de 367, 130 y 290 pb. Carril 2) Bt var aizawai HD137; 3) Control negativo; Carril 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13) bacilos nativos esporulados 11, 14, 24, 49, 61, 75, 76, 77 y 86; MP)
Marcador de peso molecular Hyper Ladder II. Gel de Agarosa al 3% teido en bromuro de etdio.

Con la PCR mltiple se detectaron los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C
y cry1D en el 76, 26, 21, 35, 32, y 8,8% respectivamente. Adicionalmente, se
encontr, que de las 35 cepas nativas de Bt, 29 bacilos presentaron diferentes
perfiles de genes, observando aislamientos desde 1 hasta 5 genes cry1 especficos,
por lo que fue necesario realizar agrupaciones encontrando los siguientes grupos de
genes cry1 especficos: I) cry1Aa; II) cry1Aa, Ab, Ac, B; III) cry1Aa, Ab, Ac, B, C;
IV) cry1Aa, Ab, Ac, C; V) cry1 Aa, Ab, B, C; VI) cry1Aa, Ab, B, D; VII) cry1Aa, Ac, B,
C; VIII) cry1Aa, Ac, C, D; IX) cry1Aa, Ba; X) cry1Aa, Ca; XI) cry1Aa, C, D;
XII) cry1Ab; XIII) cry1C; XIV) bacilos nativos que amplificaron cry1, pero no la
mezcla de oligonucletidos realizada (NA) (Figura 29).

99

Figura 29. Distribucin del nmero de bacilos nativos esporulados con presencia de genes cry1
especifcos en XIV grupos. Grupos de genes cry1 especficos: I) cry1Aa; II) cry1Aa, Ab, Ac, B;
III) cry1Aa, Ab, Ac, B, C; IV) cry1Aa, Ab, Ac, C; V) cry1 Aa, Ab, B, C; VI) cry1Aa, Ab, B, D;
VII) cry1Aa, Ac, B, C; VIII) cry1Aa, Ac, C, D; IX) cry1Aa, B; X) cry1Aa, C; XI) cry1Aa, C, D; XII) cry1Ab;
XIII) cry1C; XIV) bacilos nativos esporulados que amplificaron cry1, pero no la mezcla de
oligonucletidos realizada (NA)

Adems, la presencia de los bacilos nativos esporulados, y su clasificacin con el

perfil de genes encontrados, tambin fue independiente del lugar de origen, ya que
se encontraron bacilos nativos esporulados con ms de un grupo de clasificacin en
las distintas regiones muestreadas (Tabla 12).

100

Tabla 12. Perfil de genes cry1 especficos identificados en bacilos nativos esporulados en cada uno de
los municipios muestreados.

MUNICIPIO

m.s.n.m

Amplificacin
de genes cry1

Amplificacin de
genes cry1
especficos

Perfil de genes cry1

especficos

Cha

2547

1Aa

Susa

2654

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1B, 1C

Raquira

2188

1Aa, 1B

Santa Sofa

2453

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1B, 1C

Villa de Leyva

2090

1Aa, 1Ab.

Sutamarchn

2107

1Aa, 1Ab, 1B, 1C

Garzn

835

1Aa

Betulia

1899

1Aa, 1Ab, 1B, 1D

3149

1Aa

Piedecuesta

1023

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1B, 1C, 1D

Lebrija

1029

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1C

Girn

815

1Aa, 1C, 1D

Rionegro

774

1C

Floridablanca

901

Aa

35

29

Mesa de los
Santos

Total

Los genes ms ampliamente distribuidos son los genes cry1, los cuales presentan
actividad contra insectos lepidpteros (Chack et al., 1994). En el presente estudio,
se encontr que los genes ampliamente distribuidos en las cepas nativas de B.
thuringiensis analizados son los genes cry1Aa (76%), cry1Ba (35%), cry1Ca (32%),
cry1Ab (26%), cry1Ac (21%) y cry1Da (8,8%). Estos resultados concuerdan con los
resultados obtenidos por Chack et al. (1994), quienes encontraron en 225
aislamientos nativos evaluados, la presencia de genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac en
un 56,4%. En Mxico Bravo et al. (1998) encontraron en 496 aislamientos
evaluados, la presencia de los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac en un 19,7%. Por otra
parte, Smith y Barry (1996), afirman que la presencia de estos genes en la
naturaleza depende de la altura sobre el nivel del mar (m.s.n.m) superior a los
3.000, por ejemplo, en zonas caracterizadas por ser ambientes secos y fros se
presentan principalmente los genes cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac, mientras que en

101

lugares hmedos y calientes entre 0 y 1.500 m.s.n.m predominan los genes cry1C,
cry1D, cry3, cry7, cry8, y coinciden con las zonas de mayor presencia de insectos
del orden lepidptera.

En el presente estudio con las amplificaciones positivas para los genes cry1
obtenidas, y teniendo en cuenta la superficie sobre el nivel del mar, se observ que
en el municipio Mesa de los Santos (Santander) ubicado a 3.149 m.s.n.m, sera el
nico municipio con presencia de estos genes, y se encontr efectivamente genes
cry1Aa (Tabla 12). Sin embargo, en el municipio de Susa (Cundinamarca) ubicado a
2.654 m.s.n.m y Santa Sofa (Boyac) situado a 2.453 m.s.n.m a pesar de
encontrarse en menor altura respecto al anterior municipio, se encontraron los
genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba y cry1Ca. En cuanto a los municipios que se
encuentran en zonas de baja altitud, Betulia (Santander) situado a 1.899 m.s.n.m, se
identificaron los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ba, cry1Da. Garzn (Huila) ubicado a
835 m.s.n.m se encontr el gen cry1Aa (Tabla 12). Los resultados obtenidos en este
estudio nos indican, que la altitud no esta relacionada con la distribucin y
diversidad de B. thuringiensis en el ambiente.

En cuanto a los genes cry1 especficos que no amplificaron (6 bacilos nativos), se

propone que pueden presentar otro tipo de gen cry1 diferentes a los evaluados en
este estudio, ya que aqu se evaluaron nicamente 6 genes de los 42 reportados en
la literatura (Crickmore, 2008).

102

6.5. Seleccin de bacilos nativos para el montaje de bioensayos contra Tuta

absoluta

La relacin entre la caracterizacin microscpica, bioqumica y molecular pueden

ser complementarios, debido a que son herramientas que permiten identificar si los
aislamientos obtenidos de distintas fuentes de recoleccin, pertenecen a B.
thuringiensis y pueden presentar actividad biolgica frente a una plaga determinada.
Por ejemplo, la forma de los cristales de las diversas cepas de B. thuringiensis ha
sido relacionadas con su actividad biolgica, aunque esta ltimamente ha sido
cuestionada (Mrquez et al., 1996), sin embargo, en la caracterizacin bioqumica, y
de acuerdo con el perfil electrofortico que presente, se puede determinar si los
cristales observados tienen la presencia de pesos similares a las protenas Cry, que
se pueden clasificar con posible actividad frente a un orden de insecto, y por ltimo
la caracterizacin molecular que indica la probabilidad de que los genes cry que se
identifiquen mediante la prueba de PCR se estn expresando activamente en una
cepa determinada (Hernndez et al., 1997).

En el presente estudio, en la caracterizacin microscpica se encontr que en los 99

bacilos nativos esporulados, se presentaron 18 formas de cristales indicando la gran
diversidad que presenta este gnero. Adems, al realizar la caracterizacin
bioqumica se confirm la presencia del cristal proteco en la mayora de los bacilos
nativos esporulados (exceptuando 8 bacilos nativos), clasificando pesos protecos
que varan de 28 a 150 kDa. Tambin, con esta caracterizacin se pueden comparar
las bandas que presentan similitud con las protenas de la familia Cry. Por ltimo, en
la caracterizacin molecular, se identific que en 35 de los 99 bacilos nativos
analizados amplifican el gen cry1, y de estos, por medio de una PCR mltiple se
identificaron 29 bacilos nativos que presentaron desde 1 hasta 5 genes cry1
especficos, lo que significa que estos genes se estn expresando activamente y
posiblemente presenten actividad insecticida frente a lepidpteros.

Para la seleccin de las cepas de B. thuringiensis a evaluar biolgicamente se tuvo

en cuenta el nmero de cristales, que tuvieran en los conteos entre 10-20 y ms de

103

20 cristales por campo ptico. Esta caracterstica es muy importante porque los
cristales estn compuestos por las protenas Cry, y son estas, las que desarrollan
en principio la toxicidad que se aumenta con la entrada de esporas al hemocele de
la larva. El nmero y peso de protenas, ya que las toxinas Cry1 estn relacionadas
con pesos de 130-135 kDa y las toxinas Cry2, tambin activas contra insectos
lepidpteros, poseen pesos entre 60-70 kDa. Y por ltimo el nmero y tipo de genes
cry1 presentes. Los bacilos nativos seleccionados (Tabla 13), presentan 2 o ms
formas de cristal, eligiendo preferencialmente la forma redonda y/o bipiramidal (ocho
bacilos), que segn la lteratura presenta actividad frente al orden lepidptera,
adems de otras formas de cristal como redondas, amorfas y triangulares para
relacionar la posible actividad insecticida y las formas de cristal potenciales para el
control de Tuta absoluta.

Se seleccionaron bacilos que por su perfil electrofortico hubieran revelado entre 2 a

5 protenas clasificadas en grupos con actividades potenciales contra insectos
lepidpteros y que estuvieran relacionadas por peso, con las protenas Cry de las
cepas de referencia Bt var. kurstaki y Bt var. aizawai, que en los ensayos
preliminares mostraron alta toxicidad contra larvas de la polilla del tomate. Cuatro
aislamientos revelaron 5 bandas de protenas, dos revelaron cuatro, uno revelo tres
y por ltimo tres revelarn 2 bandas de protena (Tabla 13).

La caracterizacin molecular mediante PCR, permiti seleccionar aislamientos que

contenan entre 4 a 5 genes cry1. Siete aislamientos presentaron el gen cry1Ca que
de acuerdo a investigaciones previas es el gen que codifica una toxina Cry activa
biolgicamente a esta plaga, adems de otras combinaciones de genes (Niedmann
et al., 2006) (Tabla 13). Los genes presentes en todas las cepas fueron el gen
cry1Aa (en nueve de los aislamientos), el cry1Ab (en seis aislamientos) y los genes
cry1Ac y cry1Ba (en cinco aislamientos). En total se seleccionaron 9 perfiles de
genes diferentes que podran mostrar la respuesta biolgica, de cmo estn
actuando las toxinas codificadas contra larvas de 2do instar de Tuta absoluta.

104

Tabla 13. Caracterstica de las Cepas nativas de Bacillus thuringiensis aisladas de suelos
colombianos seleccionados por sus caractersticas de presencia y numero de cristales, tamao de las
protenas reveladas y presencia de genes cry1 especficos para bioensayos.

CEPA

Promedio del
Nmero de
cristales por
campo ptico

Forma del
Cristal*

Bandas de protenas
en kDa

Perfil de genes cry1

especficos (pb)

ZCUJTL9

10-20

Am, Rd

28;35;75;100

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ba

ZCUJTL11

10-20

Bp, Rd

35;50;75

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca

ZBUJTL24

10-20

Rd Bp, Am

28;50

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca

ZBUJTL39

10-20

Tr, Am, Bp

35;50;75;100;150

1Aa, 1Ab, 1Ba, 1Ca

ZSUJTL57

0-10

Am

35;75

1Aa, 1Ab, 1Ba, 1Da

ZSUJTL75

10-20

Rd, Bp

35;50;100;150

1Aa, 1Ac, 1Ba, 1Ca

ZSUJTL76

10-20

Rd, Am

28;35;50;100;150

1Aa, 1Ab, 1Ac, 1Ba, 1Ca

ZSUJTL77

0-10

Rd, Am

75;100

1Aa, 1Ac, 1Ca, 1Da

ZSUJTL86

Mayor a 20

Rd, Bp

35;50;75;100;150

1Aa, 1Ca, 1Da

ZSUJTL96

0-10

Rd,

35;50;75;100;150

1Ca

*Am=Amorfo; Rd=Redondo; Bp=Bipiramidal; Tr=Triangular.

6.6. Obtencin y Cuantificacin de Protenas totales de los extractos crudos

en bacilos nativos esporulados

Se obtuvieron extractos crudos de espora-cristal de buena concentracin. La

ecuacin de la recta para la regresin fue y=0.0008x - 0.0052 y el coeficiente de
correlacin (R2) fue 0.99.

La Tabla 14 presenta la concentracin determinada para cada una de las cepas

nativas de Bacillus thuringiensis analizadas. Se observa que 5 cepas presentaron
concentraciones superiores a la cepa de referencia HD1, indicando un muy buen
comportamiento en la produccin de protenas totales. Las protenas Cry
representan entre el 20-30% del total de protena producida por una cepa de Bt
(Lecadet y Dedonder, 1971; Aronson, 1986). Por lo que alcanzar producciones de
protenas totales y por ende de protenas Cry por encima de la cepa HD1, es una
condicin fisiolgica y metablica que potencializa a una cepa para ser usada como

105

controlador biolgico. La cepa HD1 es una de las mejores cepas de Bt aisladas

hasta el momento en el mundo y posee un amplio espectro de accin insecticida.
Sin embargo, no se puede definir la actividad biolgica de una cepa por la
produccin de cantidades determinadas de protenas sino por su real potencial, y
eso solo lo definen nicamente los ensayos biolgicos.
Tabla 14. Concentracin de protena total del extracto crudo de 10 cepas de B. thuringiensis
escogidos para el bioensayo.

Absorbancia

Concentracin

595 nm

g/ml

ZCUJTL9

1,660

2081,5

ZCUJTL11

0,791

995,3

ZBUJTL24

0,320

406,5

ZBUJTL39

0,250

319,0

ZSUJTL57

0,667

840,3

ZSUJTL75

0,584

736,5

ZSUJTL76

0,537

667,8

ZSUJTL77

0,809

1017,8

ZSUJTL86

0,796

1001,5

ZSUJTL96

1,149

1442,8

Bt. var. kurstaki HD1

0,690

869,0

CEPA

6.7. Caracterizacin Biolgica

6.7.1 Cra de Tuta absoluta

Para establecer la cra del insecto plaga Tuta absoluta se utilizaron plantas de
tomate variedad milano que presentaron un 98% de germinacin. Plantas de 1 mes
y medio de edad se infestaron con polillas adultas y despus de 2 das se
encontraron infestadas nicamente en las hojas superiores, conteniendo una buena
cantidad de huevos por planta.

Tuta absoluta produce entre 10-12 generaciones por ao (Barrientos et al., 1997;
Vlez, 1997). El ciclo biolgico se completa en rangos de das diferentes de acuerdo

106

a la temperatura a la cual se desarrolle la cra (Barrientos et al., 1997). En este

estudio las jaulas establecidas para la cra del insecto estuvieron sometidas a
temperaturas variables, altas durante el da (27C) y muy bajas durante la noche
(13C), condicin que prolong y produjo variabilidad en el ciclo reproductivo de las
polillas, llegando a estar entre 50-60 das.

Las polillas adultas colocaban en promedio hasta 50 huevos por hoja, de estos,
cerca del 80% cambiaban su coloracin de blanco a amarillo-naranja producindose
la maduracin, para luego eclosionar. Inmediatamente despus las larvas se
desplazaban por la hoja y penetraban la epidermis. Los 2dos instar larvales se
pudieron distinguir por su tamao que en promedio fue de 2,6 mm, diferentes a los
instar 3ro y 4to que alcanzaron 4,5 y 7,9 mm respectivamente (Figura 30).
Resultado muy similar al descrito en anteriores estudios (Vlez, 1997; Estay, 2000;
Fernndez y Montagne, 1990; Gonzlez, 1989; Lpez, 1991).

Las condiciones ambientales que se generan en las jaulas mantenidas en el CIAA,

fueron monitoreadas diariamente por medio de una hoja de registro, que contena:
fecha, temperatura, humedad relativa y operario encargado de llevar a cabo la
lectura de estos factores. Se seleccionaron larvas de 2do instar, debido a que B.
thuringiensis presenta mayor toxicidad en los primeros instares larvarios de los
insectos susceptibles, de tal forma que las larvas de 2do instar de Tuta absoluta
permiten realizar con mayor facilidad los bioensayos, para determinar la toxicidad de
esta bacteria (Hfte y Whitheley, 1989; Maciel-Rosas et al., 1994).

107

Figura 30. Instares larvales de Tuta absoluta.

1) El primer instar presenta color blanco y cabeza de color oscuro, posee una longitud de 1.61 mm; 2)
El segundo instar Cambia de color verde a color blanco en el momento de la muda, el tamao
promedio es de 2.80 mm; 3) El tercer instar presenta inicialmente un color gris blanquecino, luego
cambia a verde y finalmente a blanco, la longitud promedio es de 4.69 mm; 4) Cuarto instar, aparece
una mancha rojiza dorsal que se extiende de los ocelos hasta la margen posterior, longitud de 7,72 mm

6.7.2. Estandarizacin del bioensayo

Las dietas utilizadas para la estandarizacin del bioensayo consistieron en una dieta
natural (hojas de tomate) que aportan al insecto nutrientes en proporcin, cantidad y
forma a las que est acostumbrado empleada en los mtodos 1, 2, 3 y 5 (ver
metodologa, numeral 5.9.2, mtodos de inmersin de la hoja, aspersin de la hoja,
frascos con foliolo, y recipientes plsticos) y dieta artificial mtodo 4, (ver
metodologa, numeral 5.9.2, medio de cultivo extracto de hojas de tomate) que tiene
elementos de composicin conocida como el cido ascrbico, vitaminas entre otros
(Bravo y Cern, 2004).

Se evaluaron 5 experimentos para la estandarizacin de un bioensayo sobre larvas

de 2do instar de Tuta absoluta. La evaluacin del primer experimento produjo 100,

108

83 y 100% de mortalidad de las larvas con los bioinsecticidas Dipel, Turilav y

XenTari respectivamente (Figura 31A). El testigo absoluto (grupo control) produjo
el 4%. El anlisis estadstico mostr al octavo da de evaluacin diferencias
altamente significativas entre los tratamientos evaluados y el testigo (P>F=0,0765),
que se corrobor con la prueba de Tukey al 95% de confianza (Anexo 8). En este
experimento los biopesticidas utilizados se distribuyeron homogneamente en las
hojas, lo que permite una mayor confiabilidad de los resultados. Adicionalmente la
mortalidad en el testigo es menor al 10% que es el mximo permitido para
bioensayos (Beegle, 1990). Sin embargo, la cantidad de unidades experimentales
contando las repeticiones es muy grande, lo que redunda en mayor tiempo y costo
del bioensayo.

El experimento 2 produjo 100, 85 y 69% de mortalidad de las larvas con los

bioinsecticidas Dipel, Turilav y XenTari respectivamente (Figura 31B). El grupo
control produjo el 3%. De igual manera, al octavo da se encontraron diferencias
significativas entre los tratamientos evaluados y el testigo, (P>F=0,0045), que se
corrobor con la prueba de Tukey al 95% de confianza (Anexo 8). En este
experimento la inoculacin de los biopesticidas sobre las hojas no es homognea, al
depender del operador que hace la aspersin. Por esto, tal vez las diferencias en
mortalidad presentadas entre el experimento 1 y este para el producto XenTari son
altas, reducindose en 31%. Para los otros dos bioinsecticidas la mortalidad no
present diferencias. La mortalidad de larvas en el control fue tambin baja por lo
que este experimento es vlido para este criterio.

El experimento 3 produjo el 100, 29 y 33% de mortalidad de las larvas, con Dipel

Turilav y XenTari respectivamente. El control present el 67% de mortalidad, lo
que invalida esta evaluacin (Figura 31C). En este experimento el modelo de
florero no es estable para las larvas lo que ocasiona una mortalidad alta en el
control. Sin embargo, en los experimentos con los bioinsecticidas Turilav y
XenTari se produjo una disminucin en la mortalidad con respecto a los dos
anteriores experimentos, debida tal vez a la posicin vertical de las hojas, por lo
que los productos escurran y se depositaban en la base, de esta manera y la
distribucin al azar de las larvas se produjo un contraste alto en mortalidad al ser

109

comparado con el del producto Dipel, en el que todas las larvas murieron. Para
este producto se present una alta mortalidad al 1er da del 25%, mientras que con
los productos Turilav y XenTari la mortalidad en este da fue 0. Lo mismo ocurri
al 3er da, Dipel present 71% de mortalidad, respecto al 9 y 14% de los productos
Turilav y XenTari. Se puede concluir con esto, que Dipel es un bioinsecticida
que determina una mayor rapidez de mortalidad de larvas de Tuta absoluta, ya que
como se sabe las larvas ingieren las esporas y cristales del producto y este
bsicamente les causa inanicin. Una vez el insecto consume cristales y esporas, la
-endotoxina o protenas Cry se activan debido a que el pH del tubo digestivo del
insecto es superior a 8,9 y produce enzimas proteolticas que liberan las fracciones
txicas del cristal (De Maagd et al., 2001). La intoxicacin se evidenci, por que las
larvas de Tuta absoluta dejaron de consumir la hoja de tomate y disminuyeron los
daos producidos en las mismas. Las lesiones en la larva se manifestaron porque
las esporas penetran en el hemocele del insecto y germinan produciendo septicemia
y mal olor en las larvas muertas.

El mtodo 4 present una mortalidad del 100% sobre el grupo control e igualmente
sobre los tres productos evaluados, presentando adicionalmente contaminacin,
resultado que invalid este experimento. Se observ como algunas larvas se
introducan en el medio de cultivo provocando la muerte. Al parecer el medio de
cultivo formulado present una concentracin alta de productos de las hojas de
tomate y esto gener la mortalidad del 100% de las larvas. Ha sido reportada una
sustancia presente en algunas especies de tomate como L. hirsutum y L. glabratum,
que producen altas concentraciones de alfa tomatina, un alcaloide txico para varios
lepidpteros entre ellos, Tuta absoluta (Giustulin et al., 2001). Es posible que las
hojas de L. esculentun utilizadas en este estudio produzcan este alcaloide en muy
bajas concentraciones que no alcanzan normalmente a presentar toxicidad sobre
larvas de T. absoluta, pero si al concentrarlas en el medio de cultivo.

El anlisis de estos 4 experimentos nos permiti concluir que la metodologa ptima

para realizar los bioensayos con Tuta absoluta fue el mtodo en el que se sumergen
las hojas en el producto. La mortalidad del testigo fue inferior al 10% en las
metodologas 1 y 2, por lo cual se validan estos dos mtodos. El experimento 2

110

tambin present resultados claros pero no confiables ya que los productos

XenTari y Turilav presentaron mortalidades ms bajas que con el mtodo 1. Los
mtodos 3 y 4 con mortalidades del testigo del 33 y 100% fueron invalidados
(Beegle, 1990).

Se decidi instrumentalizar el mtodo estandarizado, para ello se realiz el

experimento 5 (Figura 31D), con el fin de disminuir la cantidad de cajas de petri
utilizadas. Se utilizaron recipientes de plstico en el que se introdujeron 7 hojas, que
fueron infestadas por 3 larvas cada una, para un total de 21 larvas. Esta bioensayo
mostr resultado muy parecido al experimento 1, 3% de mortalidad del control y
100, 87 y 100% de mortalidad de larvas de T. absoluta con los bioinsecticidas
Dipel, Turilav y XenTari respectivamente.

La prueba de comparacin de Tukey al 95% de confianza, se realiz aquellos

tratamientos que presentaron una supervivencia en el testigo superior o igual al
90%, seleccionando los tratamientos 1, 2 y 5. Por medio de esta prueba, se
detectaron diferencias significativas (P>0,05) entre la mortalidad de las larvas de
Tuta absoluta despus de 8 das de aplicacin del formulado Turilav en
comparacin con Dipel y XenTari y de los 3 bioinsecticidas aplicados, respecto
al testigo absoluto en todos los tratamientos evaluados.

111

Figura 31. Porcentaje de mortalidad de los productos comerciales Dipel, Turilav y Xentary, sobre
larvas de 2do instar de Tuta absoluta. De arriba hacia abajo mtodo 1(azul), mtodo 2 (anaranjado),
mtodo 3 (verde) y mtodo 5 (caf). No se presenta el mtodo 4 por invalidarse.

6.7.3. Bioensayos discriminatorios para la evaluacin de bacilos nativos

esporulados preseleccionadas

Con el fin de seleccionar las cepas nativas que presentaran la mayor actividad
biocontroladora frente a Tuta absoluta, se realiz un bioensayo preliminar con dosis
nica con los diez bacilos nativos esporulados preseleccionadas de acuerdo a los

112

criterios descritos anteriormente (Numeral 6.5). La concentracin utilizada para este

bioensayo fue 0.8 g protena total/ml, dosis de referencia, teniendo en cuenta los
resultados obtenidos por Pitre et al. (2008), quien determin la CL50 para la cepa de
referencia Bt var. kurstaki HD1 con un valor de 0.846 g de protena/cm2 sobre
larvas de primer instar de Tecia solanivora, insecto lepidptero.

La evaluacin de extractos crudos del complejo espora-cristal de las diez cepas de

B. thuringiensis a una concentracin de 0,8 g de protena /ml sobre larvas de 2do
instar de Tuta absoluta produjo un incremento en la mortalidad de larvas a medida
que aumentaban los das despus de aplicacin (DDA) (Figura 32). La mayor
mortalidad de larvas despus de 6 DDA, se obtuvo con la cepa nativa ZBUJTL39,
con un porcentaje de mortalidad del 41,6%, seguido de la cepa nativa ZCUJTL11,
que present una mortalidad de 36,11% y la cepa nativa ZSUJTL86 con un
porcentaje de mortalidad de 23,61%. Con la cepa utilizada como control positivo
HD1 (cepa regenerada desde el producto comercial Dipel) se present una
mortalidad de 29,17% (Figura 32). En el testigo se evidenci una mortalidad de las
larvas de 6,94%, lo que valida la prueba, ya que 10% de mortalidad en el testigo
absoluto en bioensayos con insectos del orden lepidptera, es un criterio para
invalidar la prueba (Beegle, 1990).

113

Figura 32. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes bacilos nativos
esporulados.

La comparacin de medias de Tukey al 95% de confianza no detect diferencias

significativas (P>0,05) entre la mortalidad de las larvas de Tuta absoluta despus de
6 das de aplicacin del extracto crudo de las cepas nativas de B. thuringiensis
ZBUJTL39, ZCUJTL11 y la cepa de referencia HD1, pero s entre las mortalidades
obtenidas con las cepas nativas 39 y 11 y las dems cepas nativas de B.
thuringiensis evaluadas, siendo significativamente (P<0,05) superior a los bacilos
nativos ZBUJTL39 y ZCUJTL11. La cepa de referencia utilizada como control (HD1)
no present diferencias significativas con las dems cepas nativas de B.
thuringiensis (cepas 9, 24, 39, 57, 75, 76, 77, 86, 96), sin embargo, present
porcentualmente una mortalidad superior (Figura 33).

114

Figura 33. Mortalidad de las larvas de Tuta absoluta tratadas con los diferentes extractos crudos de
los bacilos nativos esporulados, prueba de Tukey 95% de confianza.
Tratamientos con la misma letra no presentan diferencias significativas.

Teniendo en cuenta estos resultados, se puede sugerir que la actividad

biocontroladora que presenta el bacilo nativo esporulados ZBUJTL39 es mayor a la
presentada por la cepa de referencia (HD1). Lo anterior, posiblemente se debe a
que este microorganismo presenta mayor afinidad por este insecto (Tuta absoluta),
adems de estar mejor adaptado a las condiciones medioambientales de nuestro
pas. El bacilo nativo esporulado 11, tambin present porcentajes de mortalidad
superiores a la cepa de referencia, no obstante, en la prueba de comparacin de
Tukey no present diferencias significativas con HD1 (Figura 33), lo que sugiri la
realizacin de ensayos de concentracin letal 50, para determinar el verdadero
potencial que presentan estos bacilos nativos esporulados sobre el control de Tuta
absoluta.

Con los resultados preliminares obtenidos se seleccionaron los bacilos nativos

esporulados ZCUJTL11 y ZBUJTL39, para ser utilizados en la determinacin de la
concentracin letal 50, debido a que presentaron mortalidades significativamente

115

superiores a la cepa de referencia HD1 y a los dems bacilos nativos esporulados,

adems de presentar un alto potencial para su utilizacin en el control de la plaga.
La metodologa de bioensayos secuenciales, para seleccionar los bacilos
patognicamente promisorios, y determinar con precisin su CL50, permite un ahorro
considerable de individuos de la plaga objetivo, cuyo nmero en cohortes
estandarizadas

para

lograr

una

confiabilidad

estadstica

adecuada,

es

marcadamente mas bajo que si se realizaran bioensayos simultneos, coincidiendo

con lo experimentado por Jimnez, (1992).

6.7.4. Concentracin Letal 50

Se utiliz como dosis de referencia el valor utilizado en la evaluacin de las cepas
preseleccionadas, el cual fue de 0,8 g/ml, debido a que a esta concentracin no se
obtuvieron mortalidades del 100%. A partir de esta concentracin se manejaron
intervalos de 0,8 unidades hasta la concentracin 4,8 g/ml. El bioensayo cont con
un testigo absoluto y el control positivo correspondiente a la cepa de Bt var. kurstaki
HD1.

Los resultados de mortalidad obtenidos con los diferentes B. thuringiensis

evaluados (Anexo 10) fueron sometidos a un anlisis Probit con el programa
Bioestat 2007 (Anexo 11). Para todos los B. thuringiensis evaluados, el valor de P
fue mayor a 0.05, lo que permite aceptar la hiptesis propuesta, que sugiere que
existe una correlacin lineal entre la dosis y la respuesta evaluada, correspondiente
a la mortalidad de las larvas (Figura 34).

116

a.

b.

117

c.
Figura 34. Mortalidades obtenidas en la evaluacin dosis- respuesta de los bacilos nativos
esporulados sobre larvas de T. absoluta. a. bacilo nativo 11. b. bacilo nativo 39. c. Cepa de referencia
HD1.

Las concentraciones letales medias obtenidas para las cepas nativas ZCUJTL11,
ZBUJTL39 y la cepa de referencia HD1 fueron de 2,40 g/ml, 5,53 g/ml y de 6,41
g/ml, respectivamente. La concentracin letal 50 obtenida con la cepa 11 fue
significativamente inferior a la presentada por la cepa de referencia HD1, pero no
present diferencias significativas con la cepa nativa 39, segn los lmites de
confianza estimados por el programa estadstico (Biostat). Lo anterior sugiere que la
cepa ZCUJTL11 es el que necesita menor concentracin del extracto crudo para
producir una reduccin en el 50% de la poblacin del insecto (Tabla 15). Resultado
que concuerda con las investigaciones realizadas por Arango et al. (2002), quienes
encontraron que cepas nativas de Bacillus thuringiensis recolectadas en suelos
colombianos, presentaron mayor actividad biolgica que la cepa de referencia HD1,
comparando su concentracin letal 50, frente al lepidptero Spodoptera frugiperda,
evidenciando un control significativamente superior del insecto con los tratamientos
correspondientes a los aislamientos nativos, debido a que se necesitan

118

concentraciones de 962 ng/cm2 para la cepa de referencia, mientras que en los

aislamientos nativos se necesitan concentraciones desde 11 hasta 84 ng/cm2.
Sin embargo, estudios realizados en Chile por Niedmann et al. (2006), utilizando
aislamientos nativos de B. thuringiensis para el control de Tuta absoluta con dosis
de 1.56, 3.12, 6.25, 12.5 y 25 g/ml, no hallaron correlacin entre dosis y porcentaje
de mortalidad, debido a que todas las mediciones presentaron incoherencias, por lo
tanto la determinacin de la CL50 no se logr obtener para cada aislamiento nativo,
debido a que no se encontr la regresin lineal necesaria para la interpolacin de
dichos valores.

En el presente estudio, los resultados del bioensayo fueron favorables debido a que
se necesit una concentracin de 2,4 g/ml de extracto crudo de protena total del
bacilo nativo ZCUJTL11, que causa el 50% de mortalidad en el insecto plaga Tuta
absoluta, mientras que con HD1 se necesitan el triple de la concentracin (6,41
g/ml), para que produzca igual respuesta de mortalidad del insecto plaga (Tabla
15). Hay que tener en cuenta que la cepa de referencia que se utiliz en estos
bioensayos fue una cepa regenerada del producto comercial Dipel, mientras que en
la estandarizacin de bioensayos se utiliz el producto comercial (que causo 100%
de mortalidad a concentracin de 2,5 g/L), que contiene ingredientes activos que
estimulan su efecto toxico, y por ende, la respuesta obtenida es bien diferente.

Esta respuesta obtenida es muy importante, ya que la cepa de referencia Bt

variedad kurstaki HD1, es la mejor cepa de B. thuringiensis aislada y comercializada
hasta la fecha, para el control de insectos lepidpteros plaga. Y poder identificar
bacilos nativos con mejor actividad biolgica que la cepa HD1, es altamente
potencial y novedoso para producirse como un biopesticida comercial para el control
de Tuta absoluta. Preliminarmente habra que realizar bioensayos especficos sobre
otros insectos plaga para determinar su completo espectro de accin.

119

Tabla 15. Concentraciones letales 50 (CL50) de las cepas nativas y de referencia. Cepa 11, Cepa 39 y
do
Bt var. kurstaki HD1, sobre larvas de 2 instar de Tuta absoluta, con lmites de confianza al 95%

Cepas
Cepa 11
Cepa 39
Bt var.
kurstaki HD1

Concentracin
g/ml

Limite inferior
g/ml

Limite Superior
g/ml

2,40
5,53

1,585
3,869

3,628
13,238

6,41

3,922

12,759

Las diferencias en la sensibilidad de los insectos hacia las protenas Cry pueden
deberse, en gran parte, a tres aspectos involucrados en la evaluacin de la
toxicidad: a) condiciones en las que se realiza el bioensayo (incorporacin de la
toxina en la dieta, extensin en superficie, tiempo de incubacin). b) Fuente de las
toxinas (diferentes toxinas se expresan en cepas recombinantes de Bt). c) la colonia
del insecto (origen geogrfico, distribucin y migracin), factor importante en la
determinacin de la sensibilidad de un insecto hacia diferentes toxinas Cry (Irachete
et al., 2001).

Por otra parte, con respecto a la variable mortalidad corregida (Figura 35), se
observ un aumento de la misma a medida que aument la dosis para cada cepa
nativa. La cepa nativa ZCUJTL11 present porcentajes de mortalidad corregida
entre 31,7% y 58,3% a las diferentes dosis evaluadas. El bacilo nativo 39 present
porcentajes de mortalidad corregida entre 25,4% y 50,8% y la cepa utilizada como
referencia (HD1), entre 18,3% al 48,3%. La comparacin de medias de Tukey al
95% de confianza no detect diferencias significativas entre las mortalidades
corregidas obtenidas con las dosis de 4,8 g/ml, 4 g/ml, 3,2 g/ml de la cepa
ZCUJTL11, siendo estos valores significativamente superiores a los presentados por
los dems bacilos nativos esporulados a las diferentes concentraciones evaluadas,
a excepcin de la dosis a 4,8 g/ml de la cepa 39 y de la cepa de referencia HD1
(Figura 35).

En cuanto a la mortalidad corregida, obtenida con la mnima dosis evaluada (0,8

g/ml), se evidenci una correlacin directa entre la dosis y la mortalidad corregida
obtenida, ya que los porcentajes de mortalidad corregida obtenidos a dicha dosis

120

fueron los valores ms bajos para todas las cepas evaluadas. El anlisis estadstico
realizado por medio de la prueba de comparacin de medias de Tukey al 95% de
confianza demostr que la mortalidad corregida obtenida con la cepa de referencia
HD1 a la concentracin de 0,8 g/ml es significativamente menor a las dems
mortalidades corregidas obtenidas con las diferentes dosis evaluadas para todas las
cepas, a excepcin de la concentracin 0,8 g/ml del bacilo ZBUJTL 39 (Figura 35).

Figura 35. Mortalidad corregida de las cepas nativas 11 y 39 y la cepa de referencia HD1 a las
diferentes dosis evaluadas. Tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes segn
la prueba de comparacin de medios de Tukey (95%)

Cuando las larvas de Tuta absoluta se trataron con la dosis de 4,8 g/ml de la cepa
ZCUJTL11, se obtuvo una mortalidad de 58,3%, con la misma dosis la cepa nativa
ZBUJTL39, obtuv una mortalidad de 50,8% y con la cepa de referencia HD1 una
mortalidad de 48,3% y con el testigo absoluto una mortalidad de 4,79% (Anexo 12).
Se observ que la mortalidad obtenida con los tratamientos fue significativamente
mayor que la obtenida con el testigo absoluto, lo que indica que el extracto crudo

121

(complejo espora-cristal) caus una mortalidad significativa de las larvas, lo que

podra deberse a su efecto txico. Una vez el insecto consume cristales y esporas,
la -endotoxina se activo debido a que el pH del tubo digestivo del insecto es
superior a 8,9 y tiene enzimas proteolticas que liberan las fracciones txicas del
cristal. La intoxicacin se evidenci, por que las larvas de Tuta absoluta dejaron de
consumir la hoja de tomate y disminuyeron los daos producidos en las mismas.
Las lesiones en la larva se manifestaron porque los poros del intestino se van
agrandando, lo que genera que las bacterias de la flora intestinal causen septicemia
y mal olor en las larvas muertas (Whiteley y Schnepk, 1986). En el presente estudio
se identificaron insectos con coloraciones grises oscuras y negras, ubicadas en la
parte media del intestino y en los ltimos segmentos del cuerpo, sintomatologa que
produce los aislamientos de B. thuringiensis (Figura 36).
Esta coloracin es ocasionada por los tejidos necrosados debido al incremento de la
actividad secretora de las clulas del epitelio intestinal, dao mecnico a la ruptura
de las clulas epiteliales, al deterioro de las clulas columnares y basales, y a la
posterior separacin de estas de las clulas y microvellos intestinales e invasin de
los fluidos intestinales en la hemolinfa y flacidez corporal (Whiteley y Schnepk,
1986).

Figura 36. Larva de Tuta absoluta muerta debido a intoxicacin con el complejo espora-cristal
(extracto crudo).

122

Este resultado se corroboro con la prueba confirmatoria donde se observaron

colonias tpicas de B. thuringiensis evaluados, y se estableci que la muerte de las
larvas no fue producida por un efecto de la manipulacin, agente antimicrobiano o
algn microorganismo externo (Figura 37).

Figura 37. Prueba confirmatoria: bacilos nativos esporulados, aislada del insecto plaga Tuta absoluta.

La identificacin de la cepa nativa ZCUJTL11 es de gran importancia para el cultivo

del tomate en Colombia, ya que abre la posibilidad del control biolgico de Tuta
absoluta, apoyando las acciones integradas de MIP para este lepidptero plaga. El
estudio para la produccin de un biopesticida basado en este bacilo debe hacerse
con miras a brindarle una posible solucin a la comunidad de campesinos y
agricultores que viven de este cultivo tan importante para el Pas. Las caractersticas
sobresalientes de este bacilo que present cristales bipiramidales y romboidales,
iguales a los producidos por la cepa de referencia Bt variedad kurstaki HD1. Produjo
tres bandas de protenas sobresalientes con pesos de 35, 50 y 75 kDa. La protena
de 75 kDa puede estar relacionada con toxicidad hacia insectos lepidpteros plaga,
ya que las protoxinas de 125-135 kDa se clivan en protenas toxicas activas de 60 a
80 kDa. Los genes cry identificados en este bacilo fueron cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac,
cry1B y cry1C, al parecer el gen cry1Ab esta relacionado con toxicidad sobre larvas
de Tuta absoluta. En un trabajo previo Theodoluz et al. (2003) evaluando protenas

123

Cry1Ab recombinantes observ DL50 entre 10 y 18,2 g/ml, lo que confirma el

potencial biocontrolador del aislamiento ZCUJTL11 con el que se obtuvo una DL50
de 2,4 g/ml de extracto crudo de protenas totales. Es de anotar que si el
bioensayo se realiza con protenas recombinantes de este aislamiento nativo la DL50
estara muy por debajo de este valor obtenido.
6.8. Conformacin de un Banco de bacilos nativos esporulados
Se conform un banco de cepas de Bacilos esporulados, la cual se encuentra
almacenado en la Universidad Jorge Tadeo Lozano. El banco de cepas se registr
como bacilos Gram positivos esporulados debido a que es necesario confirmar si
son o no son aislamientos de Bacillus thuringiensis. Para lo anterior se sugiere
realizar la prueba del antgeno flagelar (H) o una PCR en tiempo real con el fin de
establecer correctamente su especie. (Figura 38).
Por otra parte, el banco de cepas nativas permite clasificar y seleccionar las cepas a
utilizar no solo con insectos lepidpteros, sino tambin con otras familias de insectos
y verificar su patogenicidad (Hernndez, 1997)

Figura 38. Banco cepas de Bacilos Gram positivos esporulados.

124

7. CONCLUSIONES

Se estandarizaron metodologas para la caracterizacin de aislamientos nativos

esporulados a nivel microscpico, por tincin diferencial safranina-verde de
malaquita, bioqumica por SDS-PAGE, molecular por PCR y M-PCR y biolgica
utilizando larvas de 2do instar de Tuta absoluta, que permiten en principio,
seleccionar los aislamientos con la capacidad de producir cristales parasporales
potencialmente txicos contra insectos plagas de inters, con contenidos
gnicos que codifiquen para protenas con actividades biolgicas novedosas
para el control de insectos lepidpteros plaga. Y finalmente, evaluar la
mortalidad producida por extractos crudos de protenas totales de los bacilos
esporulados nativos sobre larvas de 2do instar de la polilla del tomate: Tuta
absoluta.

La caracterizacin microscpica de aislamientos de B. thuringiensis, por medio

de tinciones diferenciales, como la safranina y el verde de malaquita, permiten
reconocer la forma, tamao y cantidad relativa de esporas y cristales,
identificando las diferentes morfologas de cristal.

La forma del cristal es dependiente del medio de cultivo en el que se cultive los
bacilos, e independiente de su actividad biolgica frente a un insecto plaga.

Utilizando medios de cultivo con fuentes de nitrgeno orgnico e inorgnico, los

aislamientos de B. thuringiensis aumentan la esporulacin y produccin de
cristales, facilitando su cuantificacin y mejorando la concentracin de protenas
totales.

La metodologa SDS PAGE permite identificar bandas de protenas con pesos

moleculares similares a las protenas Cry a partir de extractos crudos de
aislamientos nativos, y con esto, predecir la actividad biolgica potencial de
acuerdo a grupos establecidos.

125

La amplificacin por PCR con la utilizacin de oligonucletidos universales

diseados en zonas de alta homologa de los genes, permiti la identificacin de
genes de la familia cry1 en aislamientos nativos esporulados.

La amplificacin por PCR mltiple utilizando oligonucletidos especficos

diseados en zonas hipervariables de los genes permiti la identificacin de los
genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca y cry1Da en aislamientos nativos
esporulados.

Los bacilos nativos ZCUJTL11 y ZBUJTL39 a una concentracin de 0,8 g/ml,

presentaron mayor porcentaje de mortalidad que la cepa de referencia Bt var
kurstaki HD1 y los dems bacilos nativos esporulados evaluados en el
bioensayo general.

El anlisis Probit determin que la CL50 del bacilo nativo esporulado ZCUJTL11
fue 2,4 g/ml sobre larvas de 2do instar de Tuta absoluta. Sin ser diferente a
nivel estadstico que la cepa de referencia Bt var kurstaki HD1 y el bacilo nativo
ZBUJTL39, fue 2-3 rdenes menores la CL50 que la determinada para estas dos
cepas, cuyas concentraciones letales medias fueron 5,53 y de 6,41 g/ml
respectivamenete. Este resultado es bien importante, ya que, la cepa de
referencia HD1 es el mejor bacilo utilizado hoy dia para el control de una
variedad de insectos lepidpteros plaga, por lo que el bacilo esporulado
ZCUJTL11 se convierte en una cepa con gran potencial para el control de Tuta
absoluta. Se debe trabajar en la formulacin de un producto comercial con este
aislamiento nativo.

Los resultados obtenidos permiten concluir que la metodologa estandarizada y

utilizada en la caracterizacin de 99 bacilos nativos esporulados permite
clasificar y seleccionar los aislamientos de acuerdo con la capacidad de producir
cristales parasporales potencialmente txicos contra insectos plaga de inters,
los cuales se podrn escalar posteriormente para la produccin de
formulaciones de bioplaguicidas comerciales basados en cepas nativas Bacillus

126

thuringiensis, pervios ensayos biolgicos que son en ltimas los que confirman
la toxicidad de una cepa. O la utilizacin de los genes que codifiquen para
protenas con actividades biolgicas novedosas o de inters, pueden utilizarse
tambin en la produccin de organismos (v. gr., plantas o bacterias)
transgnicos que expresen las toxinas de Bacillus thuringiensis para el control
de insectos plagas.

127

8. RECOMENDACIONES

Tomar otras fuentes de muestreo como insectos muertos, hojas, agua para
identificar la diversidad de Bacillus thuringiensis en el medio ambiente.

Realizar la prueba del antisuero H y deteccin de serotipos H, para confirmar si

los aislamientos obtenidos son efectivamente aislamientos de Bacillus
thuringiensis.

Repetir los bioensayos con los aislamientos ZCUJTL11 y ZBUJTL39 para

confirmar su toxicidad sobre Tuta absoluta.

Clonar los genes del bacilo nativo ZCUJTL11 y expresar las toxinas en forma
recombinante y realizar bioensayos con estas toxinas recombinantes.

Secuenciar el gen cry1Ab de la cepa ZCUJTL11 y hacer comparaciones con los

genes previamente reporatdos en GenBank.

Utilizar oligonucletidos tanto generales como especficos que identifiquen otras

familias de genes cry, ya que en esta forma se puede determinar la variabilidad
de estos genes.

Estudiar la posibilidad de desarrollar un producto comercial con lo bacilos

nativos ZBUJTL11 y ZCUJTL39, para realizar ensayos de campo y verificar la
toxicidad de estos.

Analizar la posibilidad de produccin de plantas transgnicas de tomate con

el/los gen del bacilo nativo ZCUJTL11.

128

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