Professional Documents
Culture Documents
Agradecimientos
A nuestros padres, quienes nos han apoyado con esfuerzo y abnegacin para
el emprendimiento de nuestros estudios.
Pgina | 2
Dedicatoria
El presente trabajo est dedicado a nuestros amigos, familiares y personas
involucradas en el campo de la biotecnologa.
Pgina | 3
Contenido
1.
Introduccin............................................................................................. 5
2.
Generalidades.......................................................................................... 5
3.
3.1.1.
3.1.2.
3.1.3.
Uso de detergentes.....................................................................7
3.1.4.
3.1.5.
3.2.
4.
Mtodos fsicos.................................................................................. 9
3.2.1.
Vibraciones ultrasnicas..............................................................9
3.2.2.
3.2.3.
3.2.4.
3.2.5.
3.2.6.
Congelacin-Descongelacin.....................................................11
4.1.1.
Centrifugacin...........................................................................12
4.1.2.
Filtracin en gel.........................................................................13
4.1.3.
Dilisis o ultrafiltracin..............................................................13
4.2.
4.2.1.
4.2.2.
Electroforesis............................................................................. 15
4.2.3.
Enfoque isoelctrico..................................................................15
4.3.
4.3.1.
Cambio en el pH........................................................................16
4.3.2.
4.3.3.
4.4.
5.
Mtodos qumicos.............................................................................. 7
4.4.1.
Cromatografa de afinidad.........................................................17
4.4.2.
Elucin de afinidad....................................................................17
Adsorcin......................................................................................... 18
Pgina | 4
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
Atrapamiento................................................................................... 20
5.6.
Encapsulacin.................................................................................. 21
6.
Conclusiones.......................................................................................... 21
7.
Bibliografa............................................................................................. 23
1. Introduccin
Pgina | 5
2. Generalidades
En general la extraccin y purificacin de enzimas es requerida por las
siguientes razones:
Pgina | 6
Pgina | 7
Pgina | 8
Pgina | 9
Los tejidos vegetales o tejidos microbianos con pared celular son a menudo
sometidos a homogenizacin con un material abrasivo tal como almina o
arena. El cizallamiento y la tensin provocan la ruptura de la pared celular que
conduce a la coleccin del lquido clular como un homogeneizado crudo.
Sistemas de mortero mano de mortero simples o mezcladores y molinos se
utilizan para lograr los resultados deseados (Kulkarni y Deshpande, 2007).
P g i n a | 10
P g i n a | 11
3.2.6.Congelacin-Descongelacin
P g i n a | 12
Las grandes molculas tales como enzimas pueden ser sedimentadas por las
altas velocidades (hasta 300,000g) generadas por una ultracentrfuga. Aunque
la velocidad a la que cualquier enzima en particular se sedimenta depende de
una variedad de factores, incluyendo el tamao y la forma de la molcula y la
viscosidad de la solucin, se encuentra que en general, cuanto mayor sea el
peso molecular, mayor es la tasa de sedimentacin. Este mtodo no se utiliza
ampliamente en procedimientos de purificacin para separar una enzima de
otra porque slo un volumen pequeo (unos pocos mL) puede ser tratado
dentro de una ultracentrifugadora. Sin embargo la centrifugacin es
ampliamente utilizada para eliminar el material insoluble precipitado en el curso
de aislamiento, por ejemplo, para eliminar los desechos de clulas despus de
la homogeneizacin o para recoger la enzima que ha sido precipitada por la
adicin de sales (Strayer, et al., 2008).
4.1.2.Filtracin en gel
P g i n a | 13
4.1.3.Dilisis o ultrafiltracin
Una membrana de dilisis, tal como el celofn puede ser usado para separar
las protenas o molculas globulares con un peso molecular de alrededor de
20, 000 Dalton. El tamao de poro puede ser cambiado por diversos
tratamientos mecnicos y qumicos. El mtodo se utiliza de manera rutinaria
para separar pequeas molculas orgnicas, sales y disolventes orgnicos a
partir de los extractos crudos. La capacidad de manejo de volumen es
generalmente baja. El proceso no se puede emplear para separar una enzima
de otra (Strayer, et al., 2008).
La ultra filtracin por otro lado es una modificacin del procedimiento de
dilisis en la que pequeas molculas y iones pasan a travs de una
membrana de dilisis bajo la influencia de la presin aplicada (por lo general
gas nitrgeno a 4 atm. de presin). Esto conduce a la concentracin de la
P g i n a | 14
P g i n a | 15
4.2.3.Enfoque isoelctrico
P g i n a | 16
de
sitios
de
unin
P g i n a | 17
4.4.2.Elucin de afinidad
P g i n a | 18
Existen varias ventajas al usar enzimas inmovilizadas por ejemplo, las enzimas
pueden reutilizarse y usarse de manera continua, reduce el costo de
procesamiento, mejor recuperacin del producto, eficiencia del tiempo,
estabilidad de la enzima, mejor control de catlisis, eficiencia en los procesos y
sistemas de diagnstico rpidos (Arroyo, 1998).
Muchos mtodos han sido usados para la inmovilizacin de enzimas, algunos
mtodos importantes son descritos a continuacin.
5.1. Adsorcin
La adsorcin est mediada por enlaces inicos, enlaces hidrofbicos o puentes
de hidrgeno. La agitacin de la enzima con una resina de intercambio inico
puede causar su adsorcin. Tambin se puede hacer mediante cambios en el
pH, fuerza inica de la solucin o alterando la concentracin.
El proceso es ventajoso ya que, es simple y de bajo costo, requiere
tratamientos suaves, se puede aplicar en clulas enteras, as como enzimas
aisladas; sin embargo, hay algunas desventajas que incluyen, la enzima unida
se puede lixiviar durante el cambio en el pH, y si el sustrato tiene una carga
similar puede interferir con la unin de la enzima (Garca, et al., 2004).
P g i n a | 19
P g i n a | 20
5.5. Atrapamiento
El mtodo se basa en el atrapamiento de las enzimas o clulas completas
dentro de los polmeros de matrices insolubles. La enzima se incorpora dentro
de la matriz, a diferencia de la unin superficial en la tcnica de adsorcin. La
enzima se mezcla inicialmente con la solucin del monmero y luego se activa
la polimerizacin durante la cual la enzima queda atrapada dentro de la matriz
formada. La polimerizacin puede efectuarse mediante reacciones qumicas,
cambio en el pH, o cambio en la temperatura (Arroyo, 1998).
Las ventajas del atrapamiento son: es un procedimiento sencillo, requiere poca
instrumentacin, se basa en tratamientos leves, no inactiva la enzima, no crea
ninguna restriccin en las enzimas. Las desventajas del mtodo son: se
pueden crear impedimentos estricos para grandes sustratos que interfieren
con la velocidad de reaccin, en los casos en que los geles se compacten
puede afectar a la actividad en un grado menor, en algunos casos los poros de
la matriz son lo suficientemente grandes y se puede producir la elucin de la
enzima.
P g i n a | 21
5.6. Encapsulacin
Las enzimas son muchas veces encerradas dentro de estructuras
membranosas que permiten la entrada de sustratos y la salida de productos, y
adems las enzimas no son capaces de pasar a travs de ellas. Diversos
materiales como el nylon, silicatos, nitrato de celulosa, fosfolpidos o liposomas
se pueden utilizar para la fabricacin de materiales de encapsulacin.
La tcnica tiene las ventajas siguientes: el proceso es simple, es barato,
proporciona un rea superficial grande con respecto a volumen, no requiere
aparatos costosos e instrumentacin. Las desventajas son las siguientes: las
enzimas pueden no ser estables, no se puede utilizar en gran escala (Arroyo,
1998).
6. Conclusiones
Las enzimas se encuentran en todos los sistemas vivos y se las ha utilizado
desde que se encontr que pueden funcionar fuera de las clulas.
El uso de enzimas tiene diversas aplicaciones entre las principales tenemos:
diagnstico de enfermedades, propsitos teraputicos, aplicaciones
industriales, fermentaciones procesamiento de alimentos, entre otros.
La extraccin de enzimas extracelulares es ms sencilla porque la enzima es
excretada al medio y no se necesita de procesos para la destruccin de tejidos.
Generalmente las enzimas vegetales y microbianas son ms baratas que las
enzimas de origen animal.
Para la produccin de una determinada enzima generalmente se usa el
siguiente proceso: identificacin de la fuente de enzimas, procedimientos de
manejo generales para extractos de origen y crudo, mtodos para la extraccin,
mtodos para la purificacin, desarrollo de ensayos: cualitativos y cuantitativos,
P g i n a | 22
7. Bibliografa
P g i n a | 23